人诱导性多功能干细胞分化的心肌细胞在心血管疾病中的应用

正随着我国社会经济的飞速发展,人口老龄化加速,心血管疾病(cardiovascular diseases,CVD)已成为我国城乡居民死亡的最主要原因,远高于肿瘤及其他疾病。据推算,我国CVD患者人数达到2.9亿,并在未来10年内持续快速增长~([1])。2015年我国急性心肌梗死患者住院总费用达153.40亿元,自2004年来,在排除物价因素影响后,住院总费用年     

生长分化因子-11促进小鼠诱导性多能干细胞向心肌细胞定向分化的研究

目的 明确生长分化因子（GDF）-11对小鼠诱导多能干细胞（miPSCs）向心肌细胞定向分化的促进作用,为心肌再生的细胞生物学治疗提供种子细胞和实验依据。方法 常规培养小鼠miPSCs,分为对照组和GDF-11组。GDF-11组在普通分化培养基中加用10 ng/ml的GDF-11。悬滴法诱导培养形成拟胚体（EBs）,每日观察搏动拟胚体数目。采用实时荧光定量PCR检测多能干细胞标志物Oct-4、心脏中胚层标志物Flk-1、心脏祖细胞标志物Nkx2.5、和心肌特异性标志物cTnT的表达变化。用免疫荧光染色观察心肌结构蛋白cTnI的表达水平。结果 GDF-11组的Oct-4表达水平在诱导分化的第3、7天分别为同期对照组的（0.55±0.31）倍（P<0.01）和（0.41±0.57）倍（P<0.05）;诱导分化的第10天,GDF-11组的Flk-1和Nkx2.5表达相分别为对照组的（2.09±0.8）倍（P<0.05）和（2.47±0.22）倍（P<0.01）;cTnT的表达在分化后第10天和第14天分别为对照组的（1.81±0.19）倍（P<0.01）和（1.61±0.20）倍（P<0.01）;两组均出现了心肌样搏动细胞团,GDF-11组搏动EBs百分比要显著高于对照组（P<0.01）。免疫荧光染色显示,GDF-11组的cTnI阳性率要显著高于对照组（P<0.01）。结论 GDF-1能够显著促进miPSCs的心肌定向分化。     

在心血管领域关于诱导性多能干细胞的研究

诱导性多能干细胞（iPSCs）是人类和动物的体细胞通过转导特定转录因子重编程序而获得与胚胎干细胞（ESC）相似的多潜能干细胞。iPSCs细胞具有无限增殖,自我更新,多向分化的特点。本文主要总结iPSCs在心血管领域的研究现状,应用价值及前景,以及iPSCs现阶段应用的缺陷。     

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞研究进展

<正>心血管疾病(CVD)是全球第一大致死疾病,各种CVD的临床终末阶段为心力衰竭。心脏移植是无禁忌证晚期心力衰竭患者的首选治疗方法^[1]。然而,心脏移植面临着供者不足、免疫排斥等诸多困难。人诱导多能干细胞(hiPSC)的出现为再生医学提供了可能,且避免了胚胎干细胞(ESC)引起的伦理问题,因而受到广泛关注。     

诱导性多能干细胞在心血管系统中的作用

诱导性多能干细胞(iPS)是一种类似胚胎干细胞的新型干细胞.iPS细胞可以从各种不同动物的不同体细胞转化而来,它可以分化为心房肌、心室肌、血管以及传导系统的细胞.iPS细胞或由iPS细胞分化来的心肌细胞可用来治疗心肌梗死.通过iPS技术建立细胞模型可研究长QT综合征(LQTS)、Brugada综合征、致右室心律失常性心...     

心肌营养素-1诱导小鼠诱导性多能干细胞心肌细胞定向分化的实验研究

目的:观察心肌营养素-1(CT-1)对小鼠诱导性多能干细胞(miPSCs)心肌细胞定向分化的诱导作用。方法:实验分为对照组与CT-1处理组。miPSCs经悬滴法诱导形成拟胚体,第3天培养基中加入1μmol/ml CT-1(CT-1组),对照组采用普通培养基。于第4、7、10和14天,收取细胞样本,采用实时PCR检测心脏特异标志物基因的表达。用免疫荧光染色及流式细胞术检测干细胞标志物Oct4和心肌特异性分化标志物肌钙蛋白I(cTnI)的表达。用透射电镜观察心肌样细胞的超微结构。结果:CT-1组第10天,样本中心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)基因表达的水平为同期对照组的1.75倍,有显著性差异(P<0.05)。免疫荧光染色法检测显示,两组均有cTnI表达。流式细胞术鉴定的结果显示,对照组与CT-1组cTnI的阳性率分别为28.5%和56.4%,有显著性差异(P<0.05)。电镜观察显示,CT-1组肌原纤维及胞内线粒体明显增多,肌纤维排列规则,可见细胞间桥粒连接和缝隙连接。结论:CT-1可显著提高miPSC向心肌细胞定向分化的效率。     

微环境中人骨髓间充质干细胞向心肌细胞表型分化的实验研究

目的 探讨人骨髓间充质干细胞(hBMSC)在非接触共培养的微环境中向心肌细胞分化的能力.方法 密度梯度离心法分离培养hBMSC,用流式细胞仪鉴别其表面标记特征.采用transwell按1:10的比例共同培养hBMSC和SD乳鼠心室肌细胞.用聚合酶链反应检测心肌转录因子GATA4的基因表达水平.免疫细胞化学、免疫荧光检测横纹肌α-辅肌动蛋白、结蛋白、肌钙蛋白(cTn)T和cTnI等心肌细胞标志蛋白的表达.结果 hBMSC的标志物主要为CD29(98.64%±0.80%)和CD44(96.70%±1.50%),而极少表达CD105(2.21%±0.60%)、CD11b(0.80%±0.05%)、CD45(1.39%±0.13%)和CD34(1.73%±0.08%).与心肌细胞共培养后第7天可在hBMSC细胞中观察到少量搏动的细胞,随着诱导时间的增加,细胞的搏动更规则、有力.与心肌发育有关的转录因子GATA4基因在诱导后1、2、3周均有表达.共培养后2周,检测的心肌标志蛋白均有阳性表达,分别是结蛋白,α-辅肌动蛋白,cTnI和cTnT.荧光标记也检测到cTnT和cTnI的阳性表达.结论 hBMSC具有向心肌细胞分化的潜能,在共培养的微环境中,可以分化成心肌细胞表型,其机制是通过心肌细胞的旁分泌作用,而不需要hBMSC与心肌细胞的直接接触.     

诱导多能干细胞向心肌细胞分化的研究进展

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是通过重编程体细胞而得到的类似胚胎干细胞和胚胎APSC多能细胞的一种细胞类型。iPSCs向心肌细胞分化是一种使心肌细胞再生,治疗心肌梗死、心力衰竭等相关疾病的一种新兴技术。本文通过对近年来发表的iPSCs向心肌细胞分化的相关文献的整理、总结和分析,介绍近年来iPSCs及其向心肌细胞分化的相关研究进展、所面临的问题以及未来的发展方向。     

诱导性多能干细胞与心血管疾病

诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）可通过对多种终末分化的体细胞进行外源性重编程而获得。iPSCs作为自体来源的细胞,在组织修复领域有着巨大的应用前景。然而,iPS诱导技术尚存在诸如制备率低、成瘤风险增加和整合基因残留等一系列问题。现结合国内外最新研究成果,在介绍有关解决iPSCs自身缺陷上所取得的研究进展的同时,重点对iPSCs的心肌定向诱导分化、iPS细胞源性心肌细胞的细胞特性以及其在心血管疾病再生医学临床治疗的最新研究进展做一综述。     

Integrin β1在维生素C诱导小鼠诱导性多能干细胞向心肌样细胞分化中的作用

目的:探讨整联蛋白β1（Integrin β1）在维生素C（Vc）诱导小鼠诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）向心肌样细胞(cardiomyocytes,CMs)分化中的作用。方法: 在立式显微镜下,分别摘取胚胎(12.5 d、14.5 d及16.5 d)BALB/c胎鼠、新生（出生1 d,P1）和成年BALB/c小鼠的心脏,提取总RNA,半定量及实时定量PCR分析心脏发育不同时期Integrin β1的表达。利用悬滴培养形成拟胚体(embryoid　body,EB)的方法体外诱导iPSCs向心肌样细胞分化,诱导过程中分别添加Vc和integrin β1抑制剂（HMβ1-1）处理,共分为3组:对照组、Vc处理组和Vc+HMβ1-1处理组。诱导分化的第3、5、7天,半定量及实时定量PCR检测Oct4、integrin β1和心肌特异性因子（α-MHC、MLC2a）。用免疫荧光染色法检测心肌特异性结构蛋白心肌肌钙蛋白 I（cTnI）的表达。结果: Integrin β1在心脏胚胎发育时期（E12.5、E14.5、E16.5、P1）的表达递增（P<0.01）,成年期表达有所回落（P<0.01）。半定量及实时定量PCR的结果提示,Vc组α-MHC、MLC2a的表达显著高于对照组（P<0.01）,加integrin β1抑制剂HM β1-1后表达量降低(P<0.01)。跳动EBs计数的结果提示,诱导分化第10、14、18、22、26天,Vc组跳动EBs的百分率显著高于对照组（P<0.01）;而Vc+ HMβ1-1组跳动EBs的百分率相对于Vc组显著降低（P<0.01）。免疫荧光染色显示,Vc组有较强的cTnI表达,添加integrin β1抑制后,Vc+HMβ1-1组cTnI的表达明显减弱。结论: Vc可促进iPSCs向心肌细胞分化,其机制可能是通过integrin β1介导。     

大鼠诱导多能干细胞向肝系细胞的诱导分化

目的本研究探讨利用诱导因子将大鼠诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)快速高效诱导分化为肝细胞样细胞(hepatocyte-like cells,HLCs)。方法利用诱导因子将iPSCs向肝系细胞方向分化,采用免疫细胞化学染色和RT-PCR方法检测培养20 d时细胞各种肝系细胞标志表达。结果培养分化20 d的iPSCs形成肝细胞样集落,表达肝系细胞特征性标志,并且具有尿素合成和糖原贮备能力。结论利用诱导因子可有效地将大鼠iPSCs诱导分化为HLCs,有望为细胞移植治疗各种肝脏疾病提供种子细胞。     

机械牵张对诱导多能干细胞向心肌细胞分化的研究

目的研究机械牵张对诱导多能干细胞向心肌细胞分化效率的影响。方法诱导多能干细胞形成拟胚体后将拟胚体分为四组:对照组(未行牵张处理),牵张组1(5-6天行24小时牵张),牵张组2(5-6天行24小时牵张,7-8天再行24小时牵张),牵张组3(5-6天行24小时牵张,7-10天再行72小时牵张),通过对小鼠诱导多能干细胞施加20%形变率的机械牵张力后,于第15天,分别计数每组跳动克隆数目从而初步在上述四组中选出诱导效率最高组,此后用荧光免疫染色、Westernblot、RT-PCR和激光共聚焦法,进一步鉴定对照组和初步筛选出的牵张组最终分化效率和细胞成熟度差异。结果机械牵张刺激下,分化15天时,牵张组2的跳动克隆数上升(P<0.05),初步筛选出牵张组2可以提高分化效率;统计α-MHC免疫荧光染色面积发现牵张组2是对照组的2.1倍(P<0.05);牵张组2TroponinI的蛋白表达量为对照组的1.7倍(P<0.05);半定量PCR结果发现,心肌细胞标志基因β-MHC,MLC-2v及心肌细胞早期转录因子Nkx2.5的表达量分别提高了6.7倍、4.4倍和11.4倍(P值均<0.05);激光扫描共聚焦显微镜对分化来的单个心肌细胞进行α-actinin观察发现,牵张组2有利于心肌细胞的伸展和成熟。结论初步验证机械牵张力作为一种刺激诱导因素,20%拉伸形变率,牵张组2(贴壁的拟胚体5-6天行24小时牵张,7-8天再行24小时牵张)的处理方法可以显著促进诱导多能干细胞向心肌细胞的分化效率,为以后的深入研究和临床应用提供了实验基础。     

体外诱导间充质干细胞向心肌细胞方向分化的研究

目的证实来源于胎儿肝脏的间充质干细胞(FMSCs)具有向心肌细胞方向分化的潜能。方法取6~9代细胞,用不同浓度的诱导剂组合诱导细胞,分别置于不同的条件下进行培养,包括不同温度、不同氧浓度及不同培养液。结果在使用心肌分化培养液及常规培养条件下(37℃、20%O2),5-氮胞苷(50μmol/L)、维甲酸(10-3μmol/L)、二甲基亚砜(0.8%)的联合应用,诱导了FMSCs发生向心肌方向的分化。分化细胞呈小圆形细胞,具有相互聚集并形成球样细胞团结构的趋势,同时表达结蛋白及心肌肌钙蛋白Ⅰ。结论FMSCs具有向心肌细胞分化的潜能,FMSCs发生向心肌方向的分化所需条件与来源于其他动物种属的间充质干细胞的分化条件不同。     

Development of a novel two-dimensional directed differentiation system for generation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells

Background

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for treating ischemic heart disease. However, current protocols for differentiating hPSCs either result in low yields or require expensive cytokines.

Methods

Here we developed a novel two dimensional (2D) stepwise differentiation system that generates a high yield of cardiomyocytes (CMs) from hPSCs without using special cytokines. Initially, undifferentiated hPSCs were transferred onto Matrigel-coated plates without forming embryoid bodies (EBs) for a few days and were cultured in bFGF-depleted human embryonic stem cells (hESCs) medium. When linear cell aggregation appeared in the margins of the hPSC colonies, the medium was changed to DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). Thereafter when cell clusters became visible, the medium was changed to DMEM with 20% FBS.

Results and conclusions

At about two weeks of culture, contracting clusters began to appear and the number of contracting clusters continuously increased, reaching approximately 70% of all clusters. These clusters were dissociated by two-step enzyme treatment to monolayered CMs, of which ~ 90% showed CM phenotypes confirmed by an α‐myosin heavy chain reporter system. Electrophysiologic studies demonstrated that the hPSC-derived CMs showed three major CM action potential types with 61 to 78% having a ventricular-CM phenotype. This differentiation system showed a clear spatiotemporal role of the surrounding endodermal cells for differentiation of mesodermal cell clusters into CMs. In conclusion, this system provides a novel platform to generate CMs from hPSCs at high yield without using cytokines and to study the development of hPSCs into CMs.     

人尿源干细胞的分离培养及体外成神经细胞分化研究

目的从正常成人尿液中分离提取间充质干细胞(MSC)来源的人尿源干细胞(hUSC),并研究比较其在不同诱导液中的体外成神经分化能力。方法提取正常成人来源hUSC,经体外培养、扩增,流式细胞术鉴定,用4种不同配方的成神经诱导液分别诱导hUSC向神经细胞分化,在诱导至第14天时,光镜下观察细胞形态改变,并用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法鉴定Nestin、S100、β3-tublin和NF-200基因表达。采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析。组间比较采用t检验和方差分析。结果从正常成人提取的hUSC成功表达MSC表面标志物(CD27~+、CD44~+、CD73~+、CD90~+、CD31~-、CD34~-、CD45~-、HLA-DR~-)。hUSC在B、C、D成神经诱导液中诱导培养14 d后,细胞胞体回缩饱满、折光度变强,呈现神经元样突起。相比A成神经诱导液,B、C和D成神经诱导液中细胞Nestin、S100表达水平增高,B和D成神经诱导液中细胞β3-tublin、NF-200表达水平降低。其中C成神经诱导液中细胞Nestin表达水平高于B和D成神经诱导液中的细胞,B成神经诱导液中细胞S100表达水平高于C和D成神经诱导液中细胞,差异均具有统计学意义(P0.05)。结论 hUSC具备MSC特性;B、C、D成神经诱导液均有助于hUSC向神经类细胞方向分化,提示在优化诱导条件下,hUSC能向神经干细胞(NSC)及胶质细胞亚群分化。