甲状旁腺细胞与睾丸Sertoli细胞共同移植产生免疫赦免的研究

目的　研究甲状旁腺细胞与睾丸细胞共同移植是否产生免疫赦免。方法　随机将SD大鼠分为以下四组 :1组为单纯甲状旁腺细胞移植组 ;2组为甲状旁腺细胞 1× 10 6个睾丸Sertoli细胞移植组 ;3组为甲状旁腺细胞 2× 10 6个睾丸Sertoli细胞移植组 ;4组为甲状旁腺细胞 4× 10 6个睾丸Sertoli细胞移植组。观察移植物的存活情况 ;体外检测移植物内细胞成分及淋巴细胞凋亡情况。结果　 1组平均存活期为 (17.2 2± 3.6 3)d ;2、3、4组存活时间延长 ,分别为 (19.4 4± 4 .6 4 )d、(32 .2 2± 6 .6 7)d和 (48.80± 3.33)d。 4组在 5 0d观察期内 ,多数鼠的血清钙及甲状旁腺激素 (PTH)值维持在正常范围内 (P <0 .0 1)。移植物内可见表达FasL的睾丸细胞、甲状旁腺细胞及凋亡的淋巴细胞。FasL的表达及凋亡指数随着移植的Sertoli细胞数增加而增加。结论　睾丸Sertoli细胞FasL的表达诱导了浸润的活化淋巴细胞凋亡 ,使共同移植的甲状旁腺细胞存活期延长。     

模拟微重力下三维培养的大鼠甲状旁腺细胞与睾丸塞尔托利细胞联合移植

目的 观察模拟微重力条件下三维培养的大鼠甲状旁腺细胞与同系睾丸塞尔托利细胞联合移植后的分泌功能,以及移植物存活情况.方法 取SD大鼠的甲状旁腺细胞,分别进行常规培养和模拟微重力条件下三维培养;取SD大鼠睾丸塞尔托利细胞,进行常规培养.取Wistar大鼠作为移植受者,制备甲状旁腺功能低下症模型.用随机数字表法将建模成功的Wistar大鼠分为3组:A组大鼠接受常规培养的单纯甲状旁腺细胞移植;B组大鼠接受常规培养的甲状旁腺细胞联合睾丸塞尔托利细胞移植;C组大鼠接受经三维培养的甲状旁腺细胞联合睾丸塞尔托利细胞移植.移植后观察各组移植物的存活情况,并检测移植物的细胞成分,淋巴细胞凋亡及甲状旁腺细胞功能.结果 A组、B组和C组移植物的存活时间依次延长,分别为(17.3±1.6)d、(43.2±2.4)d和(52.5±1.5)d,3组间两两比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).C组移植物内甲状旁腺细胞已长入支架材料内部,并与之紧密结合,甲状旁腺激素分泌旺盛;还可见大量散在的、Fas配体表达阳性的睾丸塞尔托利细胞;在移植物与肾实质交界处可见大量淋巴细胞凋亡.结论 模拟微重力条件下三维培养技术与具有免疫赦免作用的睾丸sertoli细胞共同应用于甲状旁腺细胞移植,可以提高移植后甲状旁腺细胞的分泌功能,延长移植物的存活时间.

Abstract：

Objective To observe the function and survival of parathyroid cells cultured under simulated microgravity condition after cotransplanation of syngeneic allogeneic testicular sertoli cells.Methods Parathyroid cells in SD rats were assigned to flask-culture or bioreactor-culture.Allogeneic testicular sertoli cells in SD rats were cultured by using routine method.The recipients of hypoparathyroidism Wistar rat models were divided into 3 groups randomly:group A,receiving parathyroid cells(cultured with routine method)transplantation only;group B,receiving parathyroid cells and allogeneic testicular sertoli cells(cultured with routine method)transplantation;group C,receiving parathyroid cells(cultured under simulated microgravity condition)and allogeneic testicular sertoli cells transplantation.Allograft survival,change in cell components,apoptosis of infiltrative lymphocytes and parathyroid cells function were analyzed after transplantation respectively.Results The average survival time in group A,B and C was(17.3±1.6),(43.2±2.4)and (52.5±1.5)days,respectively.There was significant difference among group (P<0.05).In group C,parathyroid cells with strong secreting function grew into scaffold materials and adhered to them.FasL-expressing testicular cells and apoptotic lymphocytes were quite evident between allograft and kidney parenchyma.Conclusion Parathyroid cell cultured under simulated microgravity condition enhances its survival and function after cotransplanation of allogeneic testicular sertoli cell with immune privilege.     

同种异体甲状旁腺组织移植治疗甲状旁腺功能低下的实验研究

目的 探讨甲状旁腺经不同预处理并移植于腹直肌内后甲状旁腺移植物的功能和生存情况.方法 成年雄性Wistar大鼠70只作为供体,成年雄性SD大鼠35只作为受体,建立去甲状旁腺模型受体后采用随机数字表法随机分为直接移植组、高氧培养移植组、环孢素A组、60Co照射移植组及综合处理组5组,每只受体接受2只供体的4个甲状旁腺组织块,甲状旁腺移植于大鼠的腹直肌内.观察各组大鼠在甲状旁腺移植前后不同时相血清钙和甲状旁腺激素(PTH)的变化.结果 各组在甲状旁腺组织移植后,1周内血清钙和PTH均能达到或接近正常水平,与移植前相比差异均有统计学意义(P＜0.01).各组移植物的存活时间不同,直接移植组的存活时间最短,血清钙和PTH维持正常水平的时间分别为3周和4周.高氧培养移植组、环孢素A组、60Co照射移植组以及综合处理组血清钙及PTH维持在正常或接近正常水平的时间分别为5周和8周、6周和8周、5周和7周以及5周和9周;除高氧培养移植组移植术后9周(血清钙)及60Co照射移植组移植术后8周(PTH)差异无统计学意义外,其余4组的血清钙和PTH水平在移植术后4～9周与直接移植组比较其差异均具有统计学意义(P＜0.05),直接移植组较低;高氧培养移植组、CsA组和60Co照射移植组的血清钙和PTH水平在移植术后7～9周低于综合处理组(P＜0.05),综合处理组的血清钙和PTH的维持时间较长.结论 腹直肌内甲状旁腺移植能维持血钙于正常水平;甲状旁腺移植物或受体经预处理后能延长其存活时间.甲状旁腺组织经培养后再移植是治疗甲状旁腺功能减退症的一条有效途径.     

微囊化兔甲状旁腺组织异种移植治疗甲状旁腺功能低下症的实验研究

目的探讨不同部位微囊化兔甲状旁腺组织异种移植治疗大鼠甲状旁腺功能低下症的效果。方法应用微囊技术制备微囊化（海藻酸钠-钡生物微胶囊）兔甲状旁腺组织。16只去甲状旁腺的Wistar大鼠按完全随机法分为肾脂肪囊微囊组及腹腔微囊组，每组8只。分别于移植微囊化兔甲状旁腺组织后5、15、25、35、45、55及65d检测血清钙含量，并于移植后第65d取移植物行透射电镜检查。结果移植后，肾脂肪囊微囊组大鼠血清钙水平恢复到正常范围直至观察结束时，透射电镜检查显示移植物存活良好；腹腔微囊组大鼠血清钙水平恢复到正常范围，但第65d时血清钙水平下降至〈1．6mmol／L，透射电镜检查显示移植物中心坏死，仅边缘有少数存活细胞。结论微囊化兔甲状旁腺组织异种移植在不用免疫抑制剂情况下，可以在大鼠体内存活，且有功能。不同移植部位移植后随着时间的延长存在差异，肾脂肪囊在微囊化异种组织移植中是首选的移植部位。     

大鼠胰岛转染人血红素氧合酶-1基因对同种胰岛移植的影响

目的探讨大鼠胰岛转染人血红素氧合酶-1(HO-1)基因在胰岛移植中的潜在应用价值。方法采用携带人HO-1基因的腺病毒对新分离的SD大鼠胰岛细胞进行转染;对体外培养的胰岛细胞使用重组人肿瘤坏死因子α及放线菌酮诱导凋亡。使用流式细胞术检测凋亡率;每只链脲霉素诱导的糖尿病模型大鼠门静脉内置入约1200个胰岛当量的胰岛后,观察糖尿病大鼠血糖及体重变化;免疫组织化学法检测肝内移植胰岛细胞的胰岛素、HO-1蛋白表达及表达CD3抗原的淋巴细胞浸润情况。结果转染人HO-1基因的胰岛细胞凋亡率明显低于对照组(P<0.05);单纯胰岛细胞移植后移植物存活时间为(5.33±4.18)d,转染人HO-1基因的胰岛细胞移植后移植物存活时间为(10.56±4.33)d,两组比较,P<0.05;转染人HO-1基因的胰岛细胞培养48 h即见人HO-1蛋白表达;肝内移植7 d后移植物有人HO-1蛋白表达;移植胰岛周边及胰岛内淋巴细胞浸润程度较单纯胰岛移植组明显减轻。结论大鼠胰岛转染人HO-1基因能够增加体外培养胰岛细胞的抗凋亡能力,并能延长体内移植胰岛的存活时间,减轻淋巴细胞对胰岛的浸润。     

新生猪Sertoli细胞与大鼠胰岛细胞联合移植延长大鼠移植胰岛的存活时间

目的 探讨新生猪Sertoli细胞(NPSCs)与大鼠胰岛细胞联合移植对延长大鼠同种异体胰岛移植物存活时间的作用及其主要的机制.方法 将糖尿病Wistar大鼠随机分为3组.(1)单纯移植组(n=6):单纯移植1500个胰岛当量(IEQ)的SD大鼠胰岛细胞至糖尿病大鼠的左肾包膜下;(2)分侧移植组(n=4):将1500个IEQ的SD大鼠胰岛细胞移植到糖尿病大鼠的左肾包膜下,同时将1×10~7个NPSCs移植到糖尿病大鼠的右肾包膜下;(3)混合移植组(n=6):将1500个IEQ的SD大鼠胰岛细胞和1×10~7个NPSCs混合移植到糖尿病大鼠的左肾包膜下.移植后每天监测各组的血糖水平,以了解移植物的存活时间;移植后发生排斥反应时获取移植物标本,行HE和免疫组织化学染色,观察移植物中CD3~+T淋巴细胞浸润情况及细胞凋亡调控基因(Bcl-2)和血红素氧合酶1(HO-1)基因的表达水平.结果 单纯移植组、分侧移植组和混合移植组胰岛移植物存活时间分别为(5.7±1.0)d、(5.3±0.5)d和(16.3±1.4)d,混合移植组存活时间较其他两组显著延长(P<0.05).单纯移植组移植区可见大量淋巴细胞浸润,主要为CD3+T淋巴细胞;混合移植组移植区Bcl-2基因呈高表达;各组移植区HO-1基因均有表达,差异不明显.结论 NPSCs与大鼠胰岛细胞联合移植可以延长大鼠同种异体胰岛移植物的存活时间,其机制可能与NPSCs抑制移植物淋巴细胞浸润、促进Bcl-2基因高表达的局部免疫调节作用有关.     

转化生长因子-β1基因修饰树突状细胞诱导异种胰岛移植耐受

目的探讨转化生长因子(TGF)-β1基因修饰的树突状细胞(dendriticcell,DC)对异种胰岛移植的免疫耐受诱导作用。方法分别从BALB/C小鼠骨髓培养未成熟DC及成熟DC,将TGFβ1-pcDNA3质粒转染未成熟DC。分别将成熟DC和TGFβ1-DC负载Wistar大鼠胰岛抗原回输糖尿病小鼠体内,7d后将大鼠胰岛移植于左肾包膜下,观察移植物存活、T细胞增殖反应和细胞毒效应。结果以Wistar大鼠为供体,正常小鼠的移植物存活时间为(10·2±1·1)d,成熟DC预处理后移植物存活时间明显缩短(7·0±1·3)d,P<0·05,而TGFβ1-DC预处理后存活时间显著延长(45·2±4·5)d,P<0·05。以SD大鼠作为供体时,移植物存活时间与对照组之间相比差异无统计学意义(11·3±1·2)d,P>0·05。成熟DC预处理鼠T细胞增殖活性和细胞毒效应显著增强(SI=6·92,KRmax=73%,P<0·05),TGFβ1-DC预处理后上述效应明显降低(SI=1·13,KRmax=6·9%,P<0·05),但两组对SD大鼠的效应无明显差别。结论TGF-β1基因修饰DC回输受体可诱导异种胰岛移植耐受,其机制与T细胞无能相关。     

靶向OX40基因的siRNA抑制大鼠肝脏移植排斥反应的研究

目的 探讨RNA干扰阻断OX40-OX40L共刺激通路对大鼠移植肝存活时间的影响.方法 制作原位肝脏移植物大鼠模型,供体DA大鼠,受体Lewis大鼠.移植术毕时将5 ml含5×109pfu的pLVTHM-OX40-siRNA重组慢病毒经阴茎背静脉在10秒内注射受鼠体内,术后观察受鼠存活时间,移植肝脏进行组织病理学检查,采用ELISA法检测大鼠外周血IL-2、IFN-γ的水平,并进行受者大鼠脾细胞对供者大鼠脾细胞的混和淋巴细胞反应(MLR). 结果转染组大鼠肝脏移植物的存活时间为(74.0±9.3)d,明显长于对照组(7.3±0.5)d和未转染组(7.5±0.5)d;转染组移植肝组织炎细胞浸润、间质水肿、肝组织坏死程度较对照组和未转染组减轻;耐受组大鼠脾脏中T淋巴细胞刺激T淋巴细胞增殖的能力较对照组降低(t=25.1,P＜0.01);移植术后第7 d,转染组血清IL-2浓度为(46±8.4)pg/ml,IFN-γ浓度为(202.7±14.6)pg/ml,均显著低于对照组和未转染组(分别t=176.4,45.5,P＜0.01).结论 转染靶向OX40的siRNA,可通过阻断OX40-OX40L共刺激通路,抑制大鼠肝脏移植后的排斥反应,延长大鼠移植肝的存活时间.     

弓形虫感染对大鼠移植心脏存活时间的影响

目的探讨受者弓形虫感染对同种心脏移植物存活时间的影响。方法通过腹腔注射的方法建立弓形虫感染的大鼠模型,分别于感染后4~7d(急性感染组)或感染后27~32d(慢性感染组)进行同种异体颈部心脏移植,并设注射生理盐水的对照组和同系移植对照组。术后不用免疫抑制剂,观察移植心脏的存活时间以及移植物的病理变化。结果同系对照组的移植物存活时间为(135.3±30.4)d;慢性感染组移植心脏的存活时间为(73.6±49.3)d,明显长于生理盐水对照组和急性感染组(P<0.01),其移植心脏组织中的炎症细胞浸润也较对照组显著减轻,尤其是移植物存活时间超过100d者,无慢性移植物病变。结论受者的弓形虫感染能显著延长同种心脏移植物的存活时间,减轻移植物炎症反应。     

供体骨髓细胞输注诱导大鼠肢体移植免疫耐受

目的 探讨环磷酰胺(CP)加供体脾细胞输注联合供体骨髓细胞(DBMC)输注诱导大鼠肢体移植免疫耐受的效果及机制.方法选择25只雄性Wistar大鼠、25只雌性SD大鼠分别作为肢体移植的供体和受体.实验分为五组:A组:无处理对照组,B组:受体在肢体移植前给予供体脾细胞输注预处理;C组:受体在肢体移植前给予CP预处理,D组:受体在肢体移植前给予供体脾细胞输注加CP预处理,E组:受体在肢体移植前给予供体脾细胞输注联合DBMC输注加CP预处理,每组5只.建立肢体移植动物模型,诱导耐受后观察大鼠一般情况,移植肢体排斥反应出现时间及存活时间,通过混合淋巴细胞培养确定耐受状态,采用PCR检测嵌合体的形成.结果 E组肢体移植物的存活时间[(27.6±1.1)d]较A组[(6.8±0.4)d]、B组[(7.2±0.8)d]、C组[(7.8±1.3)d]、D组[(17.8±0.8)d]显著延长,差异均有统计学意义(P＜0.01).混合淋巴细胞反应E组特异性抑制率[(88.00±1.06)%]显著高于B组[(36.90±1.08)%]、C组[(37.90±0.95)%]和D组[(67.20±1.12)%],差异均有统计学意义(P＜0.01).E组嵌合体呈阳性.结论联合CP加供体脾细胞输注及DBMC输注可一定程度诱导大鼠同种异体肢体移植的免疫耐受,延长移植物存活时间.嵌合体的形成可能与免疫耐受的形成及维持有关.