Bcl-2过度表达对大鼠成骨细胞Bax、Caspase-3表达的影响

目的：探讨凋亡相关基因Bcl-2过表达对大鼠成骨细胞Bax蛋白以及活性Caspase-3表达的影响。方法：将含有Bcl-2cDNA的逆转录病毒表达载体pDOR-SB质粒转染大鼠成骨细胞使之过表达，用免疫组化ABC法检测Bax、Caspase-3活性蛋白表达变化。结果：转染筛选后的阳性克隆细胞表现为Bcl-2表达显著增强。同时Bax蛋白表达下降接近显著性差异，活性Caspase-3表达无明显变化。结论：Bcl-2过度表达对活性Caspase-3表达无影响，但对Bax蛋白表达起下调作用，提示Bcl-2家族成员之间可以相互影响。     

siRNA转染对大鼠髓核细胞TRAIL表达和细胞行为的影响

[目的]探讨siRNA转染对大鼠髓核细胞TRAIL表达和细胞行为的影响。[方法]采用弯曲鼠尾法建立椎间盘退变模型。处死动物。取退变椎间盘组织分离培养髓核细胞。P1髓核细胞分为4组,分别为空白对照组、TRAIL-siRNA转染组(siTRAIL组)、TNF-α处理组(TNF-α组)和TNF-α处理+TRAIL-siRNA转染组(TNF-α+siTRAIL组)。采用MTT法检测P1髓核细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot法检测髓核细胞Caspase-3的活性和表达。[结果]相较于空白对照细胞,TRAIL siRNA转染对细胞增殖、凋亡、Caspase-3的表达无明显影响(P0.05);TNF-α处理引发髓核细胞增殖显著下降(P0.05),而凋亡率显著升高(P0.05),Caspase-3的表达显著升高(P0.05)。TNF-α处理后再用TRAIL-siRNA转染可显著逆转TNF-α对细胞增殖、凋亡和Caspase-3表达的影响(P0.05)。[结论] TRAIL siRNA转染可沉默TRAIL表达,从而逆转TNF-α诱导大鼠髓核细胞增殖抑制、细胞凋亡和Caspase-3表达。     

血红素氧合酶1对TNF-α诱导的人退变椎间盘髓核细胞凋亡的作用研究

目的探讨血红素氧合酶1(heme oxygenase 1,HO-1)对TNF-α诱导的人退变椎间盘髓核细胞凋亡的作用及其可能的分子机制。方法取腰椎间盘突出症患者自愿捐赠的椎间盘组织,体外培养人退变髓核细胞并传代,取第3代细胞进行实验。采用细胞计数试剂盒8测定不同浓度(10、20、50、100和200 ng/mL)TNF-α对髓核细胞活性的影响,筛选最佳刺激浓度进行下一步实验。将髓核细胞分成4组,分别采用单纯基础培养液(对照组)、TNF-α刺激(TNF-α组)、TNF-α和CoPP 10μmol/L刺激(CoPP组)、TNF-α和ZnPP 15μmol/L刺激(ZnPP组)培养,24 h后采用Hoechst染色以及流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测凋亡相关蛋白活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)、上皮膜蛋白1(epithelial membrane protein 1,EMP-1)以及HO-1、p-P65的表达。为进一步探讨HO-1对髓核细胞凋亡的潜在分子机制,取髓核细胞分别采用TNF-α刺激(TNF-α刺激组)以及TNF-α和吡咯烷二硫基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)5μmol/L刺激(TNF-α+PDTC刺激组)培养24 h,采用流式细胞仪检测髓核细胞凋亡率。结果经检测确定TNF-α最佳抑制浓度为100 ng/mL。Hoechst染色示,对照组和CoPP组凋亡细胞较少;TNF-α组和ZnPP组可见凋亡样改变细胞核,其中ZnPP组最显著。流式细胞仪检测示,与对照组相比,TNF-α组、CoPP组及ZnPP组细胞凋亡率均显著提高(P0.05);与TNF-α组相比,CoPP组细胞凋亡率显著降低(P0.05),而ZnPP组显著提高(P0.05)。Western blot检测示,与对照组相比,TNF-α组HO-1蛋白表达降低,cleaved Caspase-3、EMP-1及p-P65蛋白表达升高(P0.05)。与TNF-α组相比,CoPP组HO-1蛋白表达明显升高,cleaved Caspase-3、EMP-1、p-P65蛋白表达明显降低(P0.05);而ZnPP组HO-1蛋白表达明显降低(P0.05),cleaved Caspase-3、EMP-1蛋白表达增高(P0.05),p-P65蛋白表达无明显变化(P0.05)。与TNF-α刺激组相比,TNF-α+PDTC刺激组细胞凋亡率明显降低(t=3.076,P=0.031)。结论 HO-1能够抑制TNF-α诱导的人椎间盘髓核细胞凋亡,其机制可能是通过调控NF-кB通路得以实现。     

腰退行性病变与TRALL基因之间关系的研究

[目的]探讨腰椎间盘退行性病变与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)基因之间的相关性及临床意义。[方法]取60例腰椎间盘突出症患者(退变组)和同期60例因创伤手术患者(未退变组)髓核组织。行组织化学染色。体外实验方面,分离细胞培养后,分为4组,分别为空白对照、TRAIL siRNA转染、TNF-α处理和TNF-α处理+TRAIL-siRNA转染组。采用MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot法检测髓核细胞Caspase-3的活性和表达。[结果]Tunel染色显示凋亡阳性细胞率退变组为48.92%,未退变组为5.23%;TRAIL蛋白表达阳性率退变组为49.11%,未退变组为12.25%,两组间的差异均有统计学意义(P0.05)。体外试验方面,相较于空白对照细胞,TNF-α处理细胞的增殖显著下降(P0.05),而凋亡率显著升高(P0.05),Caspase-3的表达显著升高(P0.05)。TRAIL siRNA转染对细胞增殖、凋亡、Caspase-3的表达无明显影响(P0.05),TNF-α处理后再用TRAIL-siRNA转染可显著逆转TNF-α对细胞增殖、凋亡和Caspase-3表现的影响(P0.05)。[结论]髓核TRAIL阳性表达细胞率与凋亡细胞率呈正相关,TRAIL沉默能显著逆转TNF-α诱导的髓核细胞增殖抑制、细胞凋亡及Caspase-3的表达。     

基质交联分子1对前列腺癌PC-3细胞凋亡相关蛋白表达的影响

目的:观察抑制基质交联分子1(STIM1)对前列腺癌PC-3细胞凋亡相关蛋白表达的影响。方法:将携带STIM1基因的小干扰RNA(shRNA)慢病毒载体STIM1-pGCSIL-GFP转染人激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞,3d后荧光倒置显微镜观察转染效率;1周后RT-PCR及Western印迹验证STIM1抑制表达有效性,并采用Western印迹检测PC-3细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax,survivin、激活型Caspase-3的表达水平。结果:倒置显微镜观察发现PC-3细胞病毒转染效率80%。转染1周后,RT-PCR及Western印迹显示STIM1被有效抑制。抑制STIM1表达后,对照组Bcl-2/Bax比率为1.24,干扰组PC-3细胞Bcl-2/Bax比率为0.31,比率显著下降;干扰组PC-3细胞survivin表达明显降低,相对表达量为对照组的0.14倍;Caspase-3裂解激活相对表达量为对照组的1.52倍(P0.05)。结论:STIM1在前列腺癌PC-3细胞中可视为致癌基因,抑制其表达可通过下调Bcl-2/Bax比率,降低survivin表达,激活Caspase-3级联通路,诱导细胞凋亡。     

缺氧诱导因子1α对人羊膜间充质干细胞耐受缺氧能力影响的实验研究北大核心CSCD

目的通过瞬时转染缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)基因,观察缺氧处理后人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)成活及凋亡情况,探讨HIF-1α对hAMSCs耐受缺氧能力的影响。方法取健康剖宫产产妇自愿捐赠的羊膜组织分离、培养hAMSCs,通过倒置相差显微镜观察细胞形态及免疫荧光法检测干细胞标志物OCT-4、NANOG表达,对培养细胞进行鉴定。取第3代hAMSCs进行缺氧处理(200μmol/L CoCl_2)后,按以下分组瞬时转染对应质粒:A组为hAMSCs空白组,B组为pcDNA3.1阴性对照组,C组为shRNA阴性对照组,D组为shRNA-HIF-1α干扰组,E组为pcDNA3.1-HIF-1α过表达组。缺氧处理后12、24、48 h采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)检测各组细胞成活率;24 h采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,并采用Western blot检测HIF-1α、VEGF、B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma2,Bcl-2)、Bax、活化型半胱天冬酶-3(cleaved Caspase-3,C-Caspase-3)蛋白表达。结果 CCK-8法检测示,缺氧处理后各时间点与A、C组比较,D组细胞成活率明显降低(P<0.05);与A、B组比较,E组细胞成活率明显升高,其中24 h组间比较差异有统计学意义(P<0.05);E组内24 h时细胞成活率明显高于12、48 h时(P<0.05)。流式细胞仪检测示,与A、C组比较,D组细胞凋亡率明显升高(P<0.05);与A、B组比较,E组细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。Western blot检测示,与A、C组比较,D组细胞中HIF-1α、VEGF、Bcl-2蛋白表达明显减少,Bax、CCaspase-3蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);而E组结果相反,与A、B组比较,E组细胞中HIF-1α、VEGF、Bcl-2蛋白表达明显增加,Bax、C-Caspase-3蛋白表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 HIF-1α基因过表达能够明显改善hAMSCs耐受缺氧能力,其机制可能与上调VEGF和Bcl-2表达及下调Bax和C-Caspase-3表达作用相关。     

bcl-2及其重要功能结构域在调节成纤维细胞NIH3T3凋亡中的研究

目的 以成纤维细胞NIH3tT13作为细胞模型,探讨bel-2 Loop Domain结构域在成纤维细胞凋亡中的作用地位.方法 构建正常和Loop Domain结构域突变bcl-2基因的真核表达质粒,用于成纤维细胞转染;脂质体介导,分别将(1)空载体质粒(2)携带bcl-2基因质粒和携带突变基因的质粒转染成纤维细胞(NIH3T3),转染后用肿瘤坏死因子(TNF)-α刺激NIH3T3细胞诱导凋亡,应用流式细胞仪(FCM)检测各组细胞凋亡,应用华联小鼠全基因表达谱芯片检测各组细胞基因表达谱的变化.结果 成功构建bcl-2基因和Loop domain中突变的真核表达载体;成功将携带突变基因、野生基因的质粒转染入NIH3T3细胞;各组转染后用TNF-α刺激细胞诱导凋亡,FCM检测发现,TNF-α刺激细胞17 h后,NIH3T3未转染细胞凋亡明显增加,细胞凋亡率为(53.18 ±8.18)%,NIH3T3转染野生型bcl-2质粒组与NIH3T3未转染细胞组比较细胞凋亡率明显下调;NIH3T3转染突变bcl-2质粒组与NIH3T3未转染细胞组比较细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05);NIH3T3转染野生型bcl-2质粒组与NIH3T3转染突变bcl-2质粒组比较细胞凋亡率明显上调;基因芯片检测发现:转染bcl-2基因的NIH3T3细胞凋亡基因与转染空质粒组下调,转染Loopdomain突变的真核表达载体的NIH3T3细胞凋亡基因比转染bcl-2基因的NIH3T3细胞上调.结论 证实bcl-2基因Loop domain结构域突变对bcl-2基因功能产生明显影响,bcl-2基因Loop domain结构域突变使NIH3T3细胞凋亡产生明显变化.     

Mettl3介导m6A甲基化修饰对过氧化氢诱导的脊髓神经元氧化应激和凋亡的影响

【摘要】 目的：探讨Mettl3介导m6A甲基化修饰对过氧化氢（H2O2）诱导的脊髓神经元氧化应激和凋亡的影响。方法：分离新生（24h内）SD大鼠脊髓，经消化、离心后重悬沉淀，差速贴壁30min后收集未贴壁细胞培养于Neurobasal培养基中，经免疫荧光鉴定呈β3-tubulin阳性，确认为脊髓神经元。将脊髓神经元随机分为6组：空白组，细胞不予任何处理，正常培养；转染对照组，细胞转染阴性对照siRNA（si-NC）；转染组，细胞转染Mettl3 siRNA（si-Mettl3）；诱导组，细胞采用300μmol/L的H2O2处理；转染对照诱导组，细胞先转染si-NC，然后采用300μmol/L H2O2处理；转染诱导组，细胞先转染si-Mettl3，然后采用300μmol/L H2O2处理。实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测各组细胞Mettl3的mRNA表达水平，Western blot检测Mettl3、Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3的蛋白表达水平，免疫荧光检测Mettl3表达，酶标仪检测各组整体m6A水平，并检测白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）水平，流式细胞仪检测细胞凋亡。结果：与空白组相比，诱导组的m6A甲基化修饰水平显著提高（P<0.05），Mettl3的mRNA和蛋白表达水平显著性上调（P<0.05），IL-1β（73.39±8.82ng/L vs 125.58±15.31ng/L）、IL-6（63.34±7.12ng/L vs 101.28±12.49ng/L）、TNF-α（103.29±12.19ng/L vs 204.37±23.65ng/L）和MDA（4.01±0.67pmol/L vs 9.23±1.05pmol/L）水平显著性升高（P<0.05），SOD（28.37±3.72U/mg vs 17.23±2.05U/mg）和GSH-Px（158.19±19.26U/mg vs 83.35±9.05U/mg）水平显著性降低（P<0.05），且Bax和cleaved Caspase-3的蛋白表达水平显著性上调（P<0.05），Bcl-2的蛋白表达水平显著性下调（P<0.05），细胞凋亡率显著升高[（8.30±0.68）% vs （34.29±3.16）%，P<0.05]；与诱导组相比，转染诱导组的m6A甲基化修饰水平显著性降低（P<0.05），Mettl3的mRNA和蛋白表达水平显著性下调（P<0.05），IL-1β（125.58±15.31ng/L vs 96.28±11.27ng/L）、IL-6（101.28±12.49ng/L vs 84.56±10.24ng/L）、TNF-α（204.37±23.65ng/L vs 147.15±18.46ng/L）和MDA（9.23±1.05pmol/L vs 7.28±0.96pmol/L）水平显著性降低（P<0.05），SOD（17.23±2.05U/mg vs 24.01±2.76U/mg）和GSH-Px（83.35±9.05U/mg vs 121.48±15.47U/mg）水平显著升高（P<0.05），且Bax和cleaved Caspase-3的蛋白表达水平显著性下调（P<0.05），Bcl-2的蛋白表达水平显著性上调（P<0.05），细胞凋亡率显著性降低[（34.29±3.16）% vs （23.57±2.01）%，P<0.05]。与空白组相比，转染组的炎性因子、氧化应激和凋亡水平均无显著性差异（P>0.05）。结论：H2O2可上调脊髓神经元中m6A甲基化修饰水平，并可诱导氧化应激和细胞凋亡；抑制Mettl3表达能够降低H2O2诱导的脊髓神经元m6A甲基化修饰水平，进而缓解氧化应激和细胞凋亡。     

黄精多糖对TNF-α作用的大鼠成骨细胞增殖、凋亡影响及其机制研究

目的探讨黄精多糖(polygonatum sibiricum polysaccharide,PSP)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)作用的大鼠成骨细胞增殖、凋亡影响及其可能作用的机制。方法采用MTT法检测不同浓度的PSP对TNF-α诱导的成骨细胞增殖能力的影响,筛选出PSP的适宜浓度;通过流式细胞术检测PSP对TNF-α诱导的成骨细胞凋亡能力的影响。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测PSP对TNF-α作用的成骨细胞中miR-212表达的影响;运用蛋白印迹法(Western blot)检测成骨细胞中Cyclin D1、Bc L-2、Bax、P21的蛋白表达水平。结果 TNF-α可抑制成骨细胞增殖,促进P21蛋白表达,而抑制Cyclin D1蛋白表达。PSP不同剂量组可明显促进成骨细胞增殖,令Cyclin D1蛋白表达上调,而P21蛋白表达下调; TNF-α可促进成骨细胞凋亡,上调Bax表达,而降低Bc L-2、miR-212表达,PSP可提高miR-212的表达水平,上调miR-212表达可显著逆转TNF-α对成骨细胞的作用;抑制miR-212表达可明显逆转PSP对TNF-α诱导的成骨细胞增殖及凋亡的作用。结论黄精多糖可通过上调miR-212表达,进而促进成骨细胞增殖及抑制细胞凋亡。     

胡黄连苷Ⅱ调节RIP1/RIP3/MLKL信号对地塞米松诱导成骨细胞凋亡的影响

目的 探讨胡黄连苷Ⅱ调节受体相互作用蛋白激酶(RIP)1/RIP3/混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL)信号对地塞米松(DEX)诱导成骨细胞凋亡的影响。方法 体外培养hFOB 1.19细胞,随机分为对照组、DEX组、DEX+胡黄连苷Ⅱ组、DEX+RIP1过表达组、DEX+空载质粒组、DEX+胡黄连苷Ⅱ+RIP1过表达组,分组处理后检测各组细胞活力、凋亡率、活性氧(ROS)相对水平、乳酸脱氢酶(LDH)、白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及IL-6释放量、BCL-2及BAX相对表达、RIP1/RIP3/MLKL信号蛋白表达。结果 与对照组相比,DEX组细胞活力、BCL-2相对表达降低(P<0.05),凋亡率、ROS相对水平、LDH及IL-1β、TNF-α、IL-6释放量、细胞BAX及RIP1、RIP3、MLKL蛋白相对表达升高(P<0.05)。与DEX组相比,DEX+胡黄连苷Ⅱ组细胞活力、BCL-2相对表达升高(P<0.05),凋亡率、ROS相对水平、LDH及IL-1β、TNF-α、IL-6释放量、细胞BAX及RIP1、RIP3、MLKL蛋白相对表...     

血红素加氧酶-1基因过表达对脊髓神经元损伤的保护作用

目的探讨血红素加氧酶-1(HO-1)基因过表达对脊髓神经元损伤的保护作用。方法利用腺相关病毒(AAV)构建HO-1过表达载体,运用免疫荧光标记神经元特异性标志物鉴定原代脊髓神经元,比较正常培养(对照组)、磷酸缓冲盐溶液(PBS)+H2O2(单纯损伤组)、PBS+AAV-EGFP+H2O2(AAV-EGFP组)、PBS+AAV-HO-1+H2O2(AAV-HO-1组)的HO-1、IL-6、TNF-α的蛋白表达与神经凋亡情况。结果HO-1重组腺相关病毒基因测序结果表明,获得的克隆片段和目的基因的DNA序列完全一致。β-tubulin-Ⅲ标记神经元,DAPI用于核定位呈现蓝色,其他细胞不显色。AAV-HO-1组HO-1蛋白表达比对照组高,单纯损伤组、AAV-EGFP组、AAV-HO-1组IL-6蛋白与TNF-α蛋白表达比对照组高,差异有统计学意义(P<0.05),单纯损伤组、AAV-EGFP组IL-6蛋白与TNF-α蛋白表达比AAV-HO-1组高差异有统计学意义(P<0.05)。单纯损伤组与AAV-EGFP组比较细胞凋亡水平差异没有统计学意义(P>0.05)。AAV-HO-1组的细胞凋亡比单纯损伤组和AAV-EGFP组的细胞凋亡比例小,差异有统计学意义(P<0.05)。结论过表达HO-1通过抑制炎症反应减少氧化应激损伤后细胞凋亡,对原代大鼠脊髓神经元氧化应激损伤起保护作用。     

雌激素对脂多糖诱导成骨细胞凋亡基因表达影响的实验研究

目的 探讨雌激素对脂多糖诱导的体外培养大鼠成骨细胞凋亡基因Bcl-2、Bax、Fas表达的影响，为明确雌激素抑制脂多糖诱导的大鼠成骨细胞凋亡的机理提供依据。方法 新生SD大鼠颅骨第2．3代成骨细胞随机分为对照组、脂多糖组、脂多糖＋雌激素组等3组，每组细胞分别培养24、48、72h，5、7、14d后作免疫组化染色，计数各组阳性细胞率，并比较组间的差异性。结果 对照组成骨细胞有少量Bcl-2、Bax、Fas表达，脂多糖组细胞Bax和Fas表达显著升高（P〈0．05），高峰期为72h，Bcl-2的表达无明显变化（P〉0．05）；脂多糖＋雌激素组细胞Bax和Fas表达显著降低（P〈0．05），高峰期仍为72h，且Bcl-2的表达显著升高（P〈0．05）。结论 脂多糖使成骨细胞Bax和Fas表达增强，而对Bcl-2的表达无明显影响；雌激素能抑制脂多糖增强成骨细胞Bax和Fas表达的作用，能使Bcl-2的表达明显增强，使Bcl-2／Bax比值增大从而抑制脂多糖诱导的大鼠成骨细胞凋亡。     

葛根素抑制吡格列酮诱导的成骨细胞凋亡

目的观察葛根素对吡格列酮诱导的成骨细胞凋亡的影响。方法 MTT法检测不同浓度葛根素(0.01-100μmol/L)和吡格列酮(20μmol/L)作用于MC3T3-E1细胞24 h后细胞增殖活性影响。流式细胞仪测定葛根素和吡格列酮对MC3T3-E细胞凋亡的影响。Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Bcl-2、Bax的表达情况。结果 1、与对照组相比,吡格列酮组的细胞增殖活性明显下降(P0.05),而0.1-10μmol/L葛根素组细胞增殖活性明显增强(P0.05)。2、与吡格列酮组相比,加入0.1-1μmol/L葛根素后细胞的增殖活性明显增强(P0.05)。3、加入1μmol/L的葛根素后,吡格列酮导致的细胞凋亡率上升受到抑制(P0.05)。4、吡格列酮处理后caspase-3、caspase-8、Bax蛋白的表达上调,Bcl-2蛋白的表达下调,而加入葛根素共同作用后,caspase-3蛋白表达下调,Bcl-2蛋白的表达上调。结论葛根素可以抑制吡格列酮诱导的成骨细胞凋亡。     

海藻糖对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

目的探讨海藻糖是否对肝脏缺血再灌注损伤具有保护作用及其相关机制。方法C57BL/6J小鼠数字随机分为无缺血组、缺血再灌注组、海藻糖处理组和生理盐水对照组,缺血90 min后于再灌注的0h和6h,收集血液和肝组织,通过分离血清测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)肝功能指标及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-2(IL-2)炎症因子水平和肝组织病理改变研究海藻糖在肝脏缺血再灌注损伤中的作用;AML12小鼠肝细胞系构建缺糖缺氧-复糖复氧细胞模型,分为实验组和对照组,实验组根据给予的海藻糖浓度不同分为低剂量组和高剂量组,对照组无海藻糖,收集细胞,流式细胞仪检测凋亡水平以研究海藻糖对肝脏缺血再灌注损伤诱导的细胞凋亡的影响,蛋白印迹法检测Caspase-3、Cleaved Caspase-3和Bcl-2蛋白水平以研究海藻糖在肝脏缺血再灌注损伤诱导的细胞凋亡中的分子机制。结果体内动物实验显示肝脏缺血再灌注后,缺血再灌注组ALT、AST及TNF-α、IL-1β和IL-2等肝功能指标及炎症因子水平升高(P<0.05),且肝组织发生坏死;而在给予海藻糖处理后,ALT、AST、TNF-α、IL-1β和IL-2等水平较生理盐水对照组降低且肝组织坏死面积也减少(P<0.05)。体外细胞实验显示与对照组相比,实验组肝细胞凋亡水平下降;且实验组活化的促凋亡蛋白Cleaved Caspase-3水平下降、抗凋亡蛋白Bcl-2水平升高。结论在体内和体外条件下海藻糖对肝脏缺血再灌注损伤有保护作用,其机制可能是通过抑制肝脏缺血再灌注损伤诱导的炎症发生和抑制Caspase-3的活化并促进Bcl-2的表达,减轻细胞凋亡,从而保护肝脏缺血再灌注损伤。     

缺氧诱导因子1α对人羊膜间充质干细胞耐受缺氧能力影响的实验研究

目的通过瞬时转染缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)基因,观察缺氧处理后人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)成活及凋亡情况,探讨HIF-1α对hAMSCs耐受缺氧能力的影响。方法取健康剖宫产产妇自愿捐赠的羊膜组织分离、培养hAMSCs,通过倒置相差显微镜观察细胞形态及免疫荧光法检测干细胞标志物OCT-4、NANOG表达,对培养细胞进行鉴定。取第3代hAMSCs进行缺氧处理(200μmol/L CoCl_2)后,按以下分组瞬时转染对应质粒:A组为hAMSCs空白组,B组为pcDNA3.1阴性对照组,C组为shRNA阴性对照组,D组为shRNA-HIF-1α干扰组,E组为pcDNA3.1-HIF-1α过表达组。缺氧处理后12、24、48 h采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)检测各组细胞成活率;24 h采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,并采用Western blot检测HIF-1α、VEGF、B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma2,Bcl-2)、Bax、活化型半胱天冬酶-3(cleaved Caspase-3,C-Caspase-3)蛋白表达。结果 CCK-8法检测示,缺氧处理后各时间点与A、C组比较,D组细胞成活率明显降低(P0.05);与A、B组比较,E组细胞成活率明显升高,其中24 h组间比较差异有统计学意义(P0.05);E组内24 h时细胞成活率明显高于12、48 h时(P0.05)。流式细胞仪检测示,与A、C组比较,D组细胞凋亡率明显升高(P0.05);与A、B组比较,E组细胞凋亡率明显降低(P0.05)。Western blot检测示,与A、C组比较,D组细胞中HIF-1α、VEGF、Bcl-2蛋白表达明显减少,Bax、CCaspase-3蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P0.05);而E组结果相反,与A、B组比较,E组细胞中HIF-1α、VEGF、Bcl-2蛋白表达明显增加,Bax、C-Caspase-3蛋白表达明显减少,差异有统计学意义(P0.05)。结论 HIF-1α基因过表达能够明显改善hAMSCs耐受缺氧能力,其机制可能与上调VEGF和Bcl-2表达及下调Bax和C-Caspase-3表达作用相关。     

肾上腺髓质素对缺氧复氧诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞凋亡的影响及其机制

目的 探讨肾上腺髓质素(ADM)对缺氧复氧(HR)诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)凋亡的影响及其机制.方法 体外培养的NRK-52E细胞,随机分为4组:正常对照组、HR组、空质粒+HR组、ADM质粒+HR组.采用Fugene HD转染试剂,将pcDNA3.1-myc-his B空质粒和ADM真核表达质粒分别转染至NRK-52E细胞内,应用免疫细胞化学的方法检测转染效率,转染成功48 h后制作HR模型.锥虫蓝摄取法进行细胞计数并计算细胞存活率,分光光度法检测上清液中乳酸脱氢酶(LDH)含量评价细胞活力;Annexin V和PI染色结合流式细胞仪技术检测细胞凋亡率;RT-PCR法检测ADM、Bax、Bcl-2、Fas的mRNA表达;Western印迹法检测活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、8、9(Caspase-3、8、9)的蛋白表达.结果 HR组ADM的表达显著高于正常对照组(P＜0.05).ADM质粒+HR组的ADM表达显著高于空质粒+ HR组(P＜0.05).与正常对照组相比,HR组活细胞计数和细胞存活率显著降低,LDH含量及细胞凋亡率显著升高,Bax、Bcl-2、Fas、活性Caspase-3、8、9表达显著上调,Bax上调更明显,故Bax/Bcl-2升高(均P＜0.05).与HR组相比,ADM质粒+HR组活细胞计数和细胞存活率显著升高,LDH含量及细胞凋亡率显著降低,Bax、Fas、活性Caspase-3、8、9表达显著下调,Bcl-2表达进一步上调,Bax/Bcl-2降低(均P＜0.05).空质粒+HR组和HR组比较,上述各指标差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 ADM在NRK-52E细胞中的高表达可以减轻HR诱导的细胞凋亡,其机制至少部分是通过抑制线粒体通路和死亡受体通路实现的.     

补肾健脾活血方调控Apaf-1/CHOP-Caspase-9/Bcl-2通路抑制成骨细胞氧化应激

目的 探讨补肾健脾活血方对减轻大鼠成骨细胞氧化应激损伤和调控线粒体介导的细胞凋亡的机制。方法 提取大鼠原代成骨细胞,通过CCK8实验检测补肾健脾活血方干预下对成骨细胞增殖活性的影响、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色检测成骨细胞ALP活性、茜素红染色检测成骨细胞的矿化情况、实时定量PCR检测Apaf-1和CHOP基因的mRNA表达、蛋白质印迹检测Caspase-9和Bcl-2蛋白表达量。结果 CKK8实验和碱性磷酸酶染色表明氧化应激损伤的大鼠成骨细胞增殖活性显著降低,成骨分化受抑制,同时Apaf-1和CHOP的mRNA表达以及Caspase-9的蛋白表达明显增加(P≤0.01),Bcl-2蛋白表达则显著减少(P≤0.01);经补肾健脾活血方干预后,成骨细胞增殖活性得到明显的增强、成骨分化增加,Apaf-1和CHOP的mRNA及Caspase-9的蛋白表达均显著减少(P<0.05),而Bcl-2的蛋白表达则显著升高(P≤0.000 1)。结论 补肾健脾活血方可以促进成骨细胞增殖和成骨分化,显著降低Apaf-1和CHOP的mRNA及Caspase-9...     

骨形态发生蛋白-7基因转染对新生大鼠心肌细胞缺氧-复氧时凋亡的影响

目的 探讨骨形态发生蛋白-7(BMP-7)基因转染对新生大鼠心肌细胞缺氧-复氧时凋亡的影响.方法 体外培养的新生大鼠心肌细胞分为3组:正常对照组(C组)、缺氧-复氧组(HR组)培养的心肌细胞置于95%N2-5%CO2混合气体饱和的缺氧罐中缺氧2 h后,放回孵育箱中继续培养4 h;BMP-7基因转染组(BT组)将含pcDNA3.1-BMP-7基因的质粒在转染试剂作用下转染心肌细胞后72 h再行缺氧2 h,复氧4 h.每组重复8次.计数心肌细胞搏动次数,采用全自动生化分析仪测定乳酸脱氢酶(LDH)活性.倒置显微镜下观察心肌细胞形态.采用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡情况,免疫细胞化学方法测定Bcl-2、Bax蛋白的表达.结果 与c组相比,HR组和BT组心肌细胞LDH活性、细胞凋亡率增加,Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调(P＜0.05);与HR组相比,BT组心肌细胞LDH活性、细胞凋亡率降低,Bax蛋白表达下调,Bcl-2蛋白表达上调(P＜0.05).结论 BMP-7基因转染可减轻新生大鼠心肌细胞缺氧-复氧损伤,其机制可能与调控Bcl-2、Bax蛋白的表达,抑制心肌细胞凋亡有关.     

LIGHT基因和干扰素-γ转染诱导肝癌HepG2细胞凋亡的研究

目的 探讨脂质体介导LIGHT基因和IFN-γ转染诱导肝癌HepG2细胞的促凋亡作用.方法 以脂质体介导LIGHT基因和IFN-γ转染肝癌HepG2细胞,设立转染组(单转、联合转染组)和对照组(未转染组).分别于转染后12、24、48 h检测肝癌HepG2细胞的凋亡率、Bcl-2及Caspase-8的表达量,并采用方差分析.结果 (1)细胞凋亡率:单转组转染后12、24、48 h为18.8%±3.5%、25.7%±2.8%、36.4%±3.6%;联合转染组为23.8%±2.4%、31.1%±2.1%、42.5%±4.5%;对照组为8.7%±2.1%、9.3%±1.6%、10.9%±1.2%.3组比较差异有统计学意义(F=15.69,53.33,48.28,P<0.01).(2)Bcl-2表达量:单转组在转染后12、24、48 h为16.4%±5.0%、13.4%±3.5%、8.6%±2.3%;联合转染组为14.7%±3.8%、9.1%±2.0%、4.6%±2.0%;对照组为25.3%±6.3%、19.8%±4.4%、10.1%±3.8%.3组比较差异有统计学意义(F=6.19.12.29,5.81,P<0.05).(3)Caspase-8表达量:单转组在转染后12、24、48 h为19.3%±2.4%、27.2%±1.9%、33.7%±3.0%;联合转染组为22.7%±2.2%、30.9%±3.1%、38.2%±3.2%;对照组为1.2%±0.8%、1.8%±0.6%、3.2%±1.5%.3组比较差异有统计学意义(F=71.54,112.78,101.61,P<0.01).结论 LIGHT基因转染肝癌HepG2细胞后通过调节Bcl-2及Caspase-8的表达来发挥促凋亡作用,IFN-γ能增强LIGHT基因诱导肝癌HepG2细胞的凋亡.     

线粒体融合素基因-2对肝癌细胞凋亡的影响及其机制

目的:探讨外源性线粒体融合素基因-2(mfn2)对肝癌细胞株HepG2凋亡的影响及其机制。 方法:利用脂质体2000将质粒mfn2转染HepG2细胞。RT-PCR检测转染后细胞mfn2 mRNA的表达水平;Weastern Blot法检测mfn2蛋白的表达;MTT检测mfn2对HepG2细胞增殖的影响;Annnexin-V/PI双标记法检测转染前后细胞凋亡的变化;RT-PCR检测凋亡相关基因的表达;电镜观察超微结构的变化。 结果: 转染mfn2基因的HepG2细胞可以稳定表达Mfn2蛋白;MTT实验提示转染mfn2基因后，HepG2细胞增殖受到抑制;转染组与转染空质粒组和空白对照组相比前者可促进细胞凋亡(P<0.05);电镜示mfn2转染后HepG2细胞线粒体嵴断裂、消失、基质疏松;RT-PCR结果示Bcl-2和survivin基因表达下调。结论:外源性mfn2基因可抑制HepG2细胞的增殖，诱导其凋亡。凋亡相关基因的表达下调可能是其诱导凋亡的机制。