实时荧光定量PCR检测人乳头瘤病毒应用研究

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测人乳头瘤病毒(HPV)的应用价值。方法随机选择2015年2月至2016年2月于本院就诊的宫颈病变患者203例,采用实时荧光定量PCR和第二代杂交捕获法(HCⅡ)对宫颈组织标本进行HPV DNA检测,对检测结果进行分析。结果 77例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者实时荧光定量PCR和HCⅡ法HPV DNA阳性检出率分别为93.51%和85.71%,二者比较差异无统计学意义(P0.05);和72例慢性宫颈炎及鳞状上皮病变患者实时荧光定量PCR和HCⅡ法HPV DNA阳性检出率分别为59.72%和36.11%,二者比较差异有统计学意义(P0.05)。203例患者实时荧光定量PCR和HCⅡ法HPV DNA阳性检出率分别为71.43%和57.64%,二者比较差异有统计学意义(P0.05)。结论实时荧光定量PCR和HCⅡ都可用于HPV DNA检测,二者对某些类型宫颈疾病的检测阳性率存在差异。实时荧光定量PCR检测对HPV感染具有一定的辅助诊断意义,有利于宫颈类疾病的早期诊治,值得推广应用。     

第二代杂交捕获法与多重荧光PCR在检测高危型人乳头瘤病毒中的应用比较

目的探讨第2代杂交捕获法（HC2）和多重荧光聚合酶链反应（PCR）在女性生殖道高危型人乳头瘤病毒（HPV）中的检测性能。方法随机选择267例宫颈疾病患者，采集宫颈部位分泌物，运用美国食品药品监督管理局（FDA）认证的HC2和多重荧光PCR分别检测标本中的HPV，并将2种方法检测结果不一致的标本进行测序分析。结果HC2和多重荧光PCR检测高危型HPV的阳性率分别为33．33％和31．46％；HC2和多重荧光PCR对高危型HPV感染的诊断敏感性分别为85．88％和90．32％，特异性分别为91．21％和99．43％。结论与HC2相比，多重荧光PCR检测高危型HPV的敏感性和特异性均有提高。     

聚合酶链反应反向点杂交法鉴定人乳头瘤病毒型别

为了探讨人乳头瘤病毒 (ＨＰＶ)的分型方法 ,我们将聚合酶链反应 (ＰＣＲ)技术和Ｓａｉｋｉ等[1] 提出的反向点杂交 (ＲＤＢ)技术结合起来 ,对ＨＰＶ进行型别鉴定 ,现报告如下。一、材料及方法1.标本来源 :30份宫颈癌组织标本 ,选自贵阳医学院附属医院病理科 ,为 1995年 1月～ 1997年 12月部分存档活检及手术切除的蜡块标本。2 .菌种及试剂 :内含ＨＰＶ全基因组的 4种ＰＵＣ19质粒 :ＨＰＶ6Ｂ、11、16和 18及特异性寡核苷酸探针 (ＳＳＯ) ,通用引物序列为 :ＧＰ5 5′ ＴＴＴＧＴＴＡＣＴＧＧＴＡＧＡＴＡＣ 3′ ,ＧＰ6 5′ ＧＡＡＡＡＡＴＡ…     

第二代杂交捕获法检测宫颈人乳头瘤病毒感染的初步研究

目的:探讨人乳头瘤病毒与宫颈癌及癌前期病变的相关性.方法:选取2004年12月～2005年7月我院妇科宫颈病门诊妇女1689例,取宫颈刷出物同时作宫颈薄层液基细胞学涂片与HPV-DNA检测,HPV-DNA检测方法是第二代杂交捕获法,可一次检测13种高危型HPV病毒,分析HPV感染与宫颈癌及癌前期病变的关系.结果:HPV-DNA检出率随宫颈癌变程度加重呈趋势性升高,1689例病人中高危型HPV检出率为25.16%(425/1689),宫颈癌及癌前期病变中为90.35%(234/259).结论:高危型HPV是诱发宫颈癌及癌前期病变的重要病因学因素.第二代杂交捕获法可作为宫颈癌的一种筛查方法.     

不同引物介导的聚合酶链反应对人乳头瘤病毒的快速检测与分型

目的 比较通用引物、型特异性引物在检测人乳头瘤病毒（HPV）DNA中的应用。方法 104例尖锐湿疣组织中提取DNA后分别用HPV6b、11、16、18型特异性引物及通用引物MY09／11、GP5^＋／6^＋经聚合酶链反应（PCR）进行扩增。部分标本采用限制性内切酶Pst I来确定HPV11型。结果 GP5^＋／6^＋的检出率高于MY09／11，但差异无显著性（χ^2=3．78，P〉0．05）。GP5^＋／6^＋检出微量HPV DNA的敏感度高于MY09／11。型特异性引物检测HPV感染优于通用引物MY09／11结合酶切分型。结论 型特异性引物检出HPV11单一型感染显著多于HPV6b型，且发现HPV6b、11型同时感染有逐年增高之趋势。GP5^＋／6^＋引物结合型特异性引物可为临床上检测尖锐湿疣HPV型别提供方便易行的选择。     

流式荧光杂交法检测人乳头瘤病毒的临床应用

目的探讨流式荧光杂交法检测人乳头瘤病毒(HPV)的临床应用价值。方法采集苏州地区1 406例妇科就诊患者宫颈脱落细胞,用流式荧光杂交技术检测HPV基因型,并对HPV感染率、基因亚型和年龄分布等进行分析。结果检出HPV感染576例(40.97%),其中单一亚型感染392例(27.88%),多重亚型感染184例(13.09%);采用流式荧光杂交法可同时检测26种HPV基因亚型,最常见的亚型为HPV-6、11、16、52、58等;单纯HPV低危亚型感染117例,占阳性病例的20.31%,高危亚型感染365例(63.37%);50～59岁年龄组HPV感染率最高(52.24%),30～39岁年龄组感染率最低(34.02%);并且,随年龄增加低危亚型感染率逐步降低,高危亚型感染率却呈明显上升趋势。结论本地区妇科患者中HPV感染率较高,流式荧光杂交法是检测HPV感染的有效方法,开展HPV分型检测对宫颈病变的防治意义重大。     

荧光定量PCR检测性病患者人乳头瘤病毒核酸

为了解本地区STD患者中HPV的感染情况,我们对2 0 0 1年9月～2 0 0 2年8月收集的35 7名STD患者标本进行HPVDNA荧光定量检测,结果如下。1　材料和方法1.1　研究对象　本院性病门诊尖锐湿疣(CA)患者10 3例,均为男性,年龄2 1～6 5岁,平均30 .2岁;HPV亚临床感染者2 5 4例,男137例,女     

人乳头瘤病毒PCR产物酶标-微孔板杂交分型

目的建立聚合酶链反应（ＰＣＲ）产物直接酶标记微孔板反向分子杂交法用于人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）型别鉴定。方法利用ＨＰＶ通用引物介导ＰＣＲ（ＧＰＰＣＲ）扩增靶ＤＮＡ，然后对产物直接标记辣根过氧化物酶复合物（ＨＲＰＰＥＩＱＩ），与预先包被在微孔板上的ＨＰＶ寡核苷酸探针杂交后酶显色法检测。结果ＨＰＶ各型之间无交叉杂交；杂交灵敏度可达１３～７６个病毒ＤＮＡ拷贝，比ＰＣＲ琼脂糖凝胶电泳检测高１０倍；该法重复性好，阳性孔批内ＣＶ为６．３４％，批间ＣＶ为１０．５３％，阴性孔批内ＣＶ为１％，批间ＣＶ为５．７９％；而且杂交影响因素较少。结论该法特异性强、灵敏度高、操作简便，无放射性和ＥＢ染料污染，杂交时间短、仪器读取结果，便于大量常规临床样本定性或定量检测。     

荧光定量聚合酶链反应检测人类乳头瘤病毒在尖锐湿疣中的应用

目的：对尖锐湿疣(CA)患者进行人类乳头瘤病毒(HPV)DNA定量测定及HPV分型。方法：用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)对146例CA患者疣体组织进行HPV6，11型和HPV 16．18型的分型检测及HPV DNA定量测定。结果：146例CA患者标本中检出HPV 6．11和HPV 16．18型感染阳性143例(97．95％)。其中单独HPV 6．11型阳性104例，占71．24％；单独HPV 16.18型阳性16例，占10．96％；HPV 6．11和HPV 16．18型同时阳性23例，占15．75％；HPV 6.11和HPV 16.18型同时阴性3例，占2．05％。定量测定结果显示：HPV 6.11型患者病毒载量最高1．0×10^8拷贝／mL，最低2．8×10^3拷贝／mL，HPV 16.18型患者病毒载量最高1.0×10^8拷贝／mL，最低2．57×10^4拷贝／mL。结论：CA患者应用FQ-PCR检测HPV阳性率高，并可快速区分高危型及低危型HPV感染，对尖锐湿疣复发及癌变作出可能性预测。     

TaqMan-based real-time polymerase chain reaction assay for specific detection of bocavirus-1 in domestic cats

Feline bocavirus-1 (FBoV-1) was first discovered in Hong Kong in 2012, and studies have indicated that the virus may cause feline hemorrhagic enteritis. Currently, there is a lack of an effective and quantitative method for FBoV-1 detection. In this study, a TaqMan-based quantitative real-time PCR (qPCR) for FBoV-1 detection was established. Primers and probes were designed to target the conserved region of the FBoV-1 NS1 gene. The sensitivity analysis indicated that the minimum detection limit was 4.57 × 10¹ copies/μL. The specificity test revealed no cross-reaction with seven other common feline viruses, including the same species—FBoV-2 and FBoV-3. The sensitivity of this method was 100 times higher than that of conventional PCR (cPCR). The established method showed good repeatability, with the intra-assay and inter-assay coefficients of variation of 0.18%–1.00% and 0.27%–0.45%, respectively. Furthermore, the analysis of feline feces revealed that the detection rate by qPCR was 7.0% (9/128), whereas that by cPCR was 4.7% (6/128). In conclusion, the established qPCR assay can quantitatively detect FBoV-1 with a high sensitivity, high specificity, and good reproducibility, making it a promising technique for the clinical detection of and basic and epidemiological research on FBoV-1.     

A SYBR Green I-based real-time polymerase chain reaction assay for detection and quantification of canine bufavirus

Canine bufavirus (CBuV) was first discovered in puppies in Italy in 2016, and subsequent studies have reported its possible relationship with acute enteritis. Currently, there is no specific and quantitative detection method for CBuV. This study examined the conserved NS1 gene and used a pair of specific primers to establish a direct SYBR Green I-based real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) method for the detection and quantification of CBuV. In the sensitivity experiment, the detection limit of SYBR Green I-based real-time qPCR was 4.676 × 10¹ copies/μL and that of conventional PCR (cPCR) was 4.676 × 10³ copies/μL. Furthermore, the qPCR method did not detect other viruses in dogs, indicating good specificity. The intra-assay coefficient of variation was 0.07–0.55% and the inter-assay coefficient of variation was 0.03–0.11%, indicating good repeatability. In clinical sample testing, the detection rate of qPCR was 5.0% (6/120), higher than that of cPCR (2.5%, 3/120). In addition, the samples that tested CBuV-positive in this experiment were all from dogs with acute enteritis. In summary, the SYBR Green I-based qPCR method established in this study has good sensitivity, specificity, and reproducibility for clinical sample detection and can also assist in future research on CBuV.     

利用实时荧光定量聚合酶链式反应快速检测人及动物粪便中的沙门菌

目的为了快速检测、鉴定沙门菌属细菌,提高食源性疾病暴发应对能力,本研究建立了针对沙门菌属的实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测方法,并对其特异性、敏感性和检测下限进行评价。方法筛选针对沙门菌的属特异基因,并建立该基因的qPCR检测体系,利用肠道不同种属细菌、不同亚种及血清型沙门菌属细菌、动物及人粪便样本评价该体系的特异度、灵敏度及检测下限。结果获得沙门菌的属特异基因ttrA,建立基于该基因的qPCR检测方法。发现该方法对纯DNA的最低检测下限为2拷贝/反应。对沙门菌属以外的肠道致病菌无扩增,对1 100株不同亚种及血清型的沙门菌的扩增结果均为阳性,对150份沙门菌致腹泻患者的粪便增菌液和210份动物带菌粪便增菌液均检测阳性。结论本研究建立的基于单一基因的沙门菌属快速分子检测方法具有特异度高、灵敏度高的特点,可用于快速筛查、鉴定沙门菌及由其引起的感染性腹泻。     

实时PCR快速检测宫颈组织HPV16感染的应用

目的建立实时PCR技术快速检测宫颈组织HPV16感染。方法根据GeneBank中HPV16E6序列,设计合成特异的引物和MGB荧光探针,优化实验条件,并对40例宫颈癌,38例宫颈非典型增生,20例正常对照宫颈组织标本进行HPV16DNA检测。结果建立了灵敏、特异地检测宫颈组织HPV16DNA的实时PCR技术;宫颈癌、宫颈非典型增生和正常对照宫颈组织中HPV16DNA阳性率分别为42.5%、34.2%和0%;宫颈癌组织中HPV16DNA平均拷贝数(106.01±1.22拷贝/mL)高于宫颈非典型增生组(105.78±1.37拷贝/ml),但差异无显著性(P>0.05)。结论实时PCR检测宫颈组织内HPV16感染,具有快速、简便、特异性强等优点,适用于临床常规检测。     

实时荧光定量PCR检测DHX32 mRNA方法的建立及初步应用

目的建立实时荧光定量PCR(FQ-RT-PCR)检测DHX32 mRNA的方法并研究其在结直肠癌中的表达。方法用Taq-Man探针建立检测DHX32 mRNA的FQ-RT-PCR方法,评价其特异性、重复性及扩增效率,并用该法检测DHX32 mRNA在结直肠癌中的表达水平。结果批内变异系数1.1%～1.9%,批间变异系数1.2%～2.5%;扩增效率为0.85,相关系数为0.9990。癌组织DHX32 mRNA表达水平中位数为1.90×10-3(四分位间距5.47×10-3),明显高于癌旁组织0.09×10-3(四分位间距1.41×10-3),两者差异有统计学意义(P<0.05)。DHX32 mRNA表达水平与结直肠癌癌栓形成、淋巴结转移、组织学分级以及Dukes分期关系密切(P<0.05)。肿瘤的恶性程度越高,DHX32 mRNA表达水平越高。结论FQ-RT-PCR检测DHX32 mRNA的方法特异性好,重复性高,操作简单,无污染。DHX32 mRNA表达上调可能在结直肠癌发生、发展中起重要作用,其表达水平可作为结直肠癌恶性程度的评价指标。     

实时荧光聚合酶链反应技术检测乙型肝炎病毒YMDD变异的研究

目的采用实时荧光聚合酶链反应(PCR)技术检测慢性乙型肝炎(CHB)患者在使用拉米夫定过程中,乙型肝炎病毒(HBV)YMDD变异的发生情况,并研究影响变异发生的相关因素,为临床预测和判断HBV YMDD变异提供一定的依据。方法选择50例CHB患者作为拉米夫定治疗组,30例CHB患者作为对照组。采用实时荧光PCR方法分别检测两组在用药期间HBV YMDD变异的发生情况,同时采用荧光定量PCR方法检测治疗组在用药前后HBV DNA水平。结果治疗组在用药52周时的变异率24.0%,明显高于对照组52周时的变异率3.3%(P<0.05);治疗组在用药52周时的变异率24.0%,明显高于用药26周时的变异率4.0%(P<0.05);治疗前HBV DNA水平较高组(28例)患者在用药52周时的变异率(35.7%)明显高于HBV DNA水平较低组(22例)患者的变异率(9.1%)(P<0.05);治疗组中未变异的38例患者在用药52周时的HBV DNA阴转率(65.8%)明显高于变异的12例患者的HBV DNA阴转率(16.7%)(P<0.05)。结论拉米夫定可导致HBV YMDD变异的产生,并且该变异的发生率随着拉米夫定的用药时间的延长而增加;HBV YMDD变异的发生同血清HBV DNA水平相关。     

Development of a quadriplex polymerase chain reaction for human cytomegalovirus detection

The development of a quadriplex PCR method with amplification of HCMV in a single‐step procedure using primers taken from four different regions of the viral genome is described. Different concentrations of dNTPs and MgCl₂ were assayed in order to optimize the constitution of the buffer for the multiplex PCR. The specificity of the PCR was tested with 100ng, 10ng, and 1ng of genomic MRC‐5 cell DNA infected with CMV in the presence of 10μg of uninfected MRC‐5 cell DNA. The sensitivity of the PCR was evaluated by the amplification of various amounts (100ng, 10ng, 1ng, and 0.1ng) of genomic MRC‐5 cell DNA infected with CMV. The specificity and sensitivity assays were performed for each pair of primers and for the combined four primer pairs in the multiplex PCR. CMV was consistently detected from 10ng of genomic MRC‐5 cell DNA with each primer pair. When all four sets of primers were combined in a single reaction tube, the sensitivity of the assay was equivalent to 10ng of genomic MRC‐5 cell DNA, whereas amplification from 1ng genomic MRC‐5 cell DNA produced only a subset of the amplimers. By amplifying four target‐sequences of HCMV simultaneously with minimum incubation time at each temperature, a quadriplex, highly sensitive PCR assay was performed. The use of four primer sets designed in different genomic regions of HCMV allowed the detection of variants and achieved maximal sensitivity and specificity which are essential for a diagnostic utilization. J. Clin. Lab. Anal. 13:99–105, 1999. © 1999 Wiley‐Liss, Inc.     

实时荧光定量聚合酶链反应技术在结核性脑膜炎中的诊断价值

目的 用涂片、实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测结核分枝杆菌,探讨其临床应用价值.方法 对临床确诊的结核性脑膜炎(n =110)、可疑结核性脑膜炎(n=205)和非结核性脑膜炎(n=100)患者的脑脊液标本分别采用涂片、RT-PCR两种方法进行检测,对结果进行对比分析.结果 415例脑脊液标本中,脑脊液涂片检查阳性率为2.4％(10/415),PCR检测阳性率为12.5％(52/415);脑脊液涂片、PCR法检测110例临床确诊的结核性脑膜炎患者脑脊液标本阳性率分别为6.4％(7/110)、26.4％(29/110);检测205例临床可疑结核性脑膜炎患者脑脊液标本阳性率分别为1.5％(3/205)、11.2％(23/205).比较两种方法的阳性检测率,差异有统计学意义(P＜0.05),检测100例非结核患者脑脊液标本,涂片及PCR检测均为阴性.结论 RT-PCR法检测脑脊液中TB-DNA对结核性脑膜炎的诊断有决定意义,具有较高临床应用价值.