慢病毒介导shRNA稳定干扰P210bcr/abl基因表达的体内外研究

P210bcr/abl融合基因在慢性髓系白血病(CML)发生、发展中起重要作用。针对P210bcr/abl融合基因的小分子抑制剂(如伊马替尼)治疗CML非常有效,但容易产生耐药性。P210bcr/abl基因的融合区为RNA干扰其表达提供了一个特异性靶点。本研究通过病毒载体建立能同时表达P210bcr/ablshRNA和P210bcr/abl基因的BaF3细胞系,并探讨慢病毒介导的shRNA对P210bcr/abl基因表达的作用。用荧光显微镜检测慢病毒对BaF3细胞的感染率,用台盼蓝拒染法检测细胞的增殖能力;用RT-PCR和Western blot分别检测P210bcr/ablmRNA和蛋白的表达。结果发现,P210bcr/ablshRNA能使BaF3-P210bcr/abl细胞中的P210bcr/ablmRNA及蛋白表达明显下降,并且能增强BaF3-P210bcr/abl细胞对伊马替尼的敏感性,与不表达P210bcr/ablshRNA的BaF3-P210bcr/abl细胞相比,伊马替尼对该细胞系的IC50下降50%以上。将该细胞由尾静脉移植到受致死剂量照射的裸小鼠体内,移植该细胞的小鼠生存期较移植BaF3-P210bcr/abl细胞的小鼠生存期明显延长。结论:稳定表达针对P210bcr/abl基因融合区的shRNA可能增强CML常规治疗的效果。     

汉防己甲素联合屈洛昔芬对K562细胞bcr/abl表达的影响

为了研究汉防己甲素(Tet)联合屈洛昔芬(DRL)对K562细胞株凋亡相关因子bcr／abl mRNA及蛋白表达的影响，Tet(1μmol／L)和DRL(5μmol／L)单用及联合应用于K562细胞一定时间后，分别采用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)和Western blot方法检测K562细胞bcr／abl mRNA和蛋白表达的变化。结果表明：Tet和DRL单独应用对K562细胞bcr／abl mRNA及蛋白表达均无影响，两药联合应用于48小时K562细胞bcr／abl mRNA表达开始下调，K562细胞P^210 BCR／ABL蛋白表达于72小时开始下调。结论：Tet和DRL联合应用可下调K562细胞bcr／abl的表达，这可能是两药联用逆转耐药的机制之一。     

高三尖杉酯碱通过抑制P210^bcr／abl诱导K562细胞凋亡

为探讨高三尖杉酯碱（ｈｏｍｏｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎｅ,ＨＨＴ）抗慢性髓细胞白血病（ＣＭＬ）的机制,以ＣＭＬ细胞系Ｋ５６２细胞为对象,应用ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＰＩ双标志和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交技术,观察ＨＨＴ对细胞凋亡和Ｐ２１０＾ｂｃｒ／ａｂｌ癌蛋白的影响。结果表明,５－２０ｎｇ／ｍｌ浓度的ＨＨＴ可诱导Ｋ５６２细胞凋亡,但随着药物浓度的增加细胞出现坏死性死亡,ＨＨＴ可使细胞内融合蛋白Ｐ２１０＾ｂｃｒ／ａｂｌ的含量约减少７０％,而对正常存在于细胞内的Ｐ１４５＾ｃ－ａｂｌ无影响,上述结果证实,ＨＨＴ通过对Ｐ２１０＾ｂｃｒ／ａｂｌ的定向抑制作用促进ＣＭＬ细胞凋亡,这可能是其抗ＣＭＬ的分子机制。本研究为ＨＨＴ在临床上的进一步应用提供了实验基础。     

慢性髓细胞白血病患者染色体分析及bcr/abl融合基因转录本定量的临床意义

目的探讨慢性髓细胞白血病(CML)患者染色体分析与bcr／abl融合基因定量的临床应用价值。方法17例CML患者采用骨髓细胞短期培养法制备染色体,应用G、R显带技术进行染色体分析,同时采用实时定量RT-PCR技术进行bcr／abl融合基因定量检测,并对其中的9例患者进行了跟踪观察。结果全部患者均检出Ph染色体及表达bcr／abl融合基因,阳性患者之间19cr／abl表达水平差异很大。常规药物治疗后稳定于慢性期的4例患者,bcr／bal表达水平轻度上升或下降,未发现新的染色体异常;进入急变期的3例患者bcr／abl表达平均上升了9．06倍,均出现新的附加染色体异常;2例异基因骨髓移植的患者bcr／abl表达水平随临床治疗而发生变化;bcr／abl变化趋势相同而细胞遗传学结果不同的患者,对药物治疗的反应不同,预后也不一样。结论染色体分析结合bcr／abl基因定量较为全面地反映了CML患者的生物学特性,与疾病进展密切相关,对CML的诊断、疗效评价、预后判断反映白血病细胞负荷有较大的临床价值。     

bcr／abl特异性siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建bcr／abl的特异性siRNA真核细胞表达载体,并初步探索对K562细胞bcr／abl mRNA和P210蛋白的影响。方法：根据GenBank数据库提供的bcr／abl基因核苷酸序列,按照Tusch 1设计原则,选择设计双链小干扰RNA（siRNA）,再转化为能表达其小发卡结构RNA（shRNA）的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶Ⅱ启动子H1的真核表达载体pTER117,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定;在脂质体的介导下转染K562细胞,用RT—PCR分析bcr／abl mRNA的表达,细胞化学染色检测P210蛋白的表达。结果：构建bcr／abl融合基因siRNA真核表达载体pTER117经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致,转染K562细胞24h后,pTER117使bcr／abl mRNA的相对水平下降50％,使P210蛋白下降47％。结论：bcr／abl融合基因siRNA真核细胞表达载体构建成功,并有效干扰K562细胞bcr／abl的表达。     

双色荧光原位杂交用于慢性粒细胞白血病干扰素治疗效果的监测

为了探讨双色荧光原位杂交（D-FISH）方法对CML病人干扰素治疗后疗效监测的意义，本研究采用D-FISH方法对慢性粒细胞白血病（CML）病人应用干扰素治疗前后骨髓间期核细胞进行bcr/abl融合基因的检测，并与RT-PCR方法检测bcr/abl mRNA及传统细胞遗传学方法检测Ph染色体的结果进行比较。结果显示，22例CML病人D-FISH bcr/abl融合基因在干扰素治疗前均为阳性，其平均检出率在干扰素治疗前后分别为96.4％和58.6％，其中2例治疗前P染色体阴性病人，D-FISHbcr/abl融合基因在干扰素治疗前后平均检出率分别为94.0％和70.1％。D-FISH方法检测的22例病人中，4例为部分反应，4例为微小反应，其余14例为无反应。与传统的细胞遗传学方法相比较具有良好的相关性。结果：D-FISH方法直接检测CML病人间期核细胞的bcr/abl融合基因，克服了传统的细胞遗传学只能进行分裂中期核细胞分析及RT-PCR方法不能定量检测的不足，为CML干扰素治疗后克隆缓解程度的评定提供了更方便、可靠的方法。     

联合应用FISH和巢式RT-PCR技术检测慢性髓系白血病bcr/abl融合基因

目的 检测慢性髓系白血病(CML)bcr／abl融合基因，协助临床诊断。方法 联合应用荧光原位杂交(FISH)、Northem杂交和巢式RT—PCR技术。结果 在16例被检测的CML患中，有3例两种方法的结果不一致，经Northem杂交验证发现，RT—PCR较FISH更敏感，但存在假阳性；另外，FISH较容易检测到bcr／abl融合的少见类型，而巢式RT—PCR需要同时设计多对特殊引物，否则极易漏诊。结论 联合应用FISH和巢式RT—PCR技术检测CML bcr／abl融合基因可以优势互补，使结果更加准确、可靠，更适合于临床诊断、疗效判定以及对微量残留病的监测。     

Ph+/bcr-abl+急性淋巴细胞白血病微小残留病变的细胞遗传学分析、巢式RT-PCR及流式细胞术检测

为了探索检测Ph^ ／bcr-abl^ 急性淋巴细胞白血病(ALL)患的微小残留病变(MRD)的简便而灵敏的方法，对84例初治ALL患和其中的缓解期患的骨髓分别用细胞遗传学、流式细胞术和巢式RT—PCR检测。结果表明，缓解期患骨髓中不存在Ph^ 染色体，巢式RT-PCR方法检测到1l／14例缓解期患存在MRD(bcr-abl融合基因)(阳性率78．57％)，而流式细胞术检测到5／14的缓解期患阳性(阳性率35．71％)。巢式PCR的灵敏度达到10^-6-10^-7水平，流式细胞检测的灵敏度达到10^-4-10^-5水平。结论：Ph染色体核型分析技术检测MRD不够灵敏，而巢式RT—PCR检测MRD较流式细胞技术检测灵敏度更高，且更易于开展应用。     

线粒体途径在慢性髓系白血病信号转导中的作用

本研究旨在探讨线粒体途径在慢性髓系白血病（CML）信号转导中的作用。用脂质体转染法将bcr3／abl2反义寡核苷酸（ASO）导入CML细胞系K562细胞中;用MTr法检测bcr3／abl2 ASO对K562细胞活力的影响;流式细胞术（FCM）分析测定细胞凋亡率;荧光染料罗丹明123染色分析细胞线粒体跨膜电位（△ψm）的变化;Western blot检测线粒体凋亡信号转导通路相关蛋白细胞色素C（CytC）的表达。结果表明,2μmol／Lbcr3／abl2 ASO与K562细胞作用24小时后,可明显抑制K562细胞活力,其抑制率为65．7％;可诱导细胞凋亡,凋亡率为16．9％;可下调K562细胞线粒体△ψm,有38．33％的细胞出现线粒体△ψm下降;可增强CytC的表达,激光光度扫描仪测得其表达光密度值由2．33±0．3升高到4．78±0．1。结论：线粒体途径通过介导凋亡信号而在CML信号转导中发挥重要作用。     

蛋白转导结构域-bcr/abl融合基因的构建和表达

目的 构建含蛋白转导结构域（PTD）与慢性粒细胞白血病（CML）bcr/abl融合基因片段的质粒，并在大肠杆菌中表达。方法 PCR扩增的CML bcr/abl基因片段，经DNA测序后，与合成编码PTD的DNA片段一起手稿质粒pET-16b，构建表达载体pEPb，转化大肠杆菌并进行了PTD－bcr/abl蛋白的诱导表达和纯化。结果 跨越bcr/abl断裂点的523bp的目的片段被有效地扩增，DNA序列分析表明所构建的含PTD－bcr/abl融合基因的质粒与设计相同。PTD－bcr/abl融合蛋白在转化大肠杆菌获得了高效表达并纯化。结论 成功地获得了PTD－bcr/abl融合蛋白片段的基因表达产物，为进一步研究CML的免疫治疗奠定了基础。     

慢性粒细胞白血病患者Ph染色体变异易位的细胞遗传学特征与荧光原位杂交研究

本研究探讨慢性粒细胞白血病(CML)中变异Ph染色体易位的细胞遗传学特征并比较双色单融合(DC-SF)与双色双融合(DCDF)bcr／abl探针荧光原位杂交技术(FISH)在变异易位CML中的应用价值。应用常规细胞遗传学方法分析我院42例CML变异Ph易位患者，其中9例进行DC-SF-FISH和1l例进行DC-DF-FISH研究。结果表明：在642例Ph阳性CML中变异易位42例(6.5％)，简单变异易位42.9％(18／42)，复杂变异易位54.8％(23／42)，遮蔽的或隐匿的Ph易位1例。除4，6号染色体外，其余染色体均被累及。4种类型变异易位分别出现于至少2个病例中。变异易位伴附加异常15例(35.7％)。FISH检测bcr／abl阳性19例(95％)，阴性1例。DC-DF-FISH显示除1例患者部分细胞(8.8％)能检测到abl／bcr融合信号外，其他患者皆缺乏该融合信号。但在易位后的9号和参与变异易位的另外染色体上分别可以见到abl和bcr基因信号。DC-SF-FISH不能观察到信号的变异特征。结论：CML变异Ph易位广泛累及除9，22外其他染色体。部分类型属重现性异常；FISH检测能给予精确的分子诊断．而DC-DF-FISH可提供直观的、准确的分子变异特征分析。     

bcr/abl融合基因对β1整合素和L-选择素基因表达的影响

目的 研究ber／abl融合基因对β1整合素和L-选择素表达的影响。方法 应用半定量RT-PCR方法检测ber／abl融合基因阴性和阳性的慢性髓系白血病(CML)细胞中β1整合素和L-选择素mRNA的表达水平。同时观察酪氨酸激酶抑制剂Rb-C-Box基因转染bcr／abl基因阳性细胞后β1整合素和L-选择素mRNA表达水平的变化。结果 在bcr／abl基因阳性细胞中，L-选择素mRNA表达水平明显低于ber／abl阴性细胞，转入Rb-C-Box基因后，L-选择素mRNA的表达水平与ber／abl阴性细胞相似。bcr／abl阴性和阳性细胞及转染Rb-c-Box基因细胞中β1整合素mRNA表达水平差异均无显性。结论 ber／abl融合基因可抑制CML细胞中L-选择素mRNA的表达，对β1整合素mRNA的表达影响较小。     

1例伴有t(9;22)和ins(3;8)的慢性粒细胞白血病的临床和实验研究

目的报道1例伴有ins(3;8)的慢性粒细胞白血病(CML)病例及其3号、8号全染色体涂染、双色间期荧光原位杂交(FISH)、实时荧光定量PCR研究结果。方法骨髓细胞经直接法或24 h短期培养法制备染色体标本,R显带技术进行核型分析;3号、8号全染色体涂染探针进行染色体涂染;bcr/abl双色双融合探针进行FISH分析;实时荧光定量PCR检测bcr/abl融合基因转录本及其拷贝数。结果骨髓细胞R显带核型分析提示,除t(9;22)外,所有细胞伴ins(3;8);全染色体涂染证实3号染色体上插入一段8号来源的染色体片段;双色FISH检测到bcr/abl基因重排;实时荧光定量PCR检测到bcr/abl融合基因(b3a2)转录本。结论ins(3;8)是CML患者罕见的附加染色体异常;全染色体涂染是明确染色体插入易位的可靠手段。     

趋化因子MIP-1α和MCP-1及其受体CCR-1和CCR-2在慢性髓系白血病细胞中的表达

本文旨在研究MIP-1α和MCP-1及其受体CCR-1和CCR-2在慢性髓系白血病细胞中的表达,同时观察P210bcr/abl融合蛋白中酪氨酸激酶对MIP-1α和MCP-1及其受体CCR-1和CCR-2 mRNA表达的影响.在bcr/abl融合基因阴性和阳性慢性髓系白血病细胞中,采用半定量RT-PCR方法检测MIP-1α、MCP-1、CCR-1、CCR-2mRNA的表达水平.结果表明MIP-1αmRNA和CCR-1 mRNA在bcr/abl融合基因阳性细胞中不表达,但在bcr/abl融合基因阴性细胞中表达,而MCP-1 mRNA和CCR-2mRNA在bcr/abl融合基因阳性和阴性细胞中均不表达.当P210bcr/abl融合蛋白中酪氨酸激酶被抑制后,MIP-1α和CCR-1的mRNA表达水平恢复至正常水平.结论：P210bcr/abl融合蛋白抑制慢性髓系白血病细胞中MIP-1α和CCR-1 mRNA的表达,但对MCP-1和CCR-2mRNA的表达无影响.     

Tet-off调控bcr/abl基因表达的细胞系293pT2-P210的建立

慢性髓系白血病（CML）是一种以髓系细胞受累为主的克隆性疾病。目前认为CML的主要分子发病基础为：位于9q34的abl基因与位于22q11的bcr基因相互易位形成bcr/abl融合基因,并编码具有很强蛋白酪氨酸激酶活性的P210bcr/abl融合蛋白,该蛋白通过多种信号通路抑制细胞凋亡而导致细胞转化。本研究为构建能由Tet-off诱导表达系统调控bcr/abl融合基因表达的细胞系,为深入研究bcr/abl融合基因功能及其调控机制提供一种有价值的细胞模型。将bcr/abl融合基因亚克隆到pTRE2hyg载体构建重组质粒pT2-P210,同时将Tet-off质粒转染293细胞并筛选出单克隆,然后进一步转染pTRE2hyg-LUC质粒,通过荧光素酶活性检测选出能有效诱导目的基因表达的293Tet-off细胞,然后将重组质粒pT2-P210转染到293Tet-off细胞中。结果表明：筛选出了bcr/abl融合基因能被强力霉素有效调控的293pT2-P210单克隆细胞。结论：本研究筛选的293pT2-P210细胞为bcr/abl基因表达能被Tet-off诱导表达系统调控的细胞系,它们适用于bcr/abl融合基因功能及其信号调控机制的深入研究。     

荧光原位杂交法检测慢性粒细胞白血病bcr基因重排

目的：检测慢性粒细胞白血病ｂｃｒ基因重排。方法：应用荧光原位杂交技术，以自行筛选和制备的酵母人工染色体为探针进行荧光原位杂交，检测慢性粒细胞白血病ｂｃｒ基因的重排。结果：用２２号染色体ｂｃｒ基因附近的ＹＡＣ７６５Ｅ３，在９例慢性粒细胞白血病中，发现５例慢性期患者，２例急变期患者和１例经α干扰素治疗后的患者存在ｂｃｒ基因重排，１例自体骨髓移植后患者的核型呈嵌合状态，即同时存在正常的和具有ｂｃｒ基因重排的核型。结论：ＹＡＣ７６５Ｅ３是一个有用的检测ｂｃｒ基因重排的探针，荧光原位杂交技术可能成为白血病治疗效果的监测和微量残留病检出的一种重要手段。     

两例Ph染色体阳性慢性粒细胞白血病患者具有少见型bcr/abl融合基因

目的　研究 2例Ph染色体阳性慢性粒细胞白血病慢性期 (CML CP)患者异常的bcr/abl融合基因结构。方法　分别采用常规的M 及 μ 型bcr/abl融合转录子特异性引物进行逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR) ,对RT PCR扩增产物测序进行序列同源性分析 ,以确定扩增产物的成分及bcr/abl融合转录子类型 ,其中 1例根据测序结果设计引物并通过PCR研究其DNA水平bcr与abl基因融合方式。结果　 2例患者临床表现均符合典型CML CP特征 ,RT PCR扩增后均未见典型的M 及 μ 型扩增带 ,而分别出现一条异常的条带 ,产物大小分别介于M 及 μ bcr/abl之间及小于M bcr/abl。经序列分析证明RT PCR产物均含有bcr及abl基因序列 ,例 1的bcr基因断裂发生在第 18外显子 (e18)内部 ,abl基因融合位点为常见的外显子 2 (a2 )处 ,它们之间插入了 4 0bp的部分abl基因内含子 1b序列 ,为一种新型的符合阅读框架结构的bcr/abl融合转录子e18 int a2。经PCR证明该融合发生在DNA水平。例 2的融合转录子中缺失典型M bcr/abl(b2a2 )融合基因中abl基因外显子 2 (a2 ) ,为e13a3(b2a3)型。结论　少见型bcr/abl融合基因可见于典型Ph染色体阳性CML患者并产生异常的RT PCR扩增带。