β-连环素融合绿色荧光蛋白真核表达质粒的构建及表达

目的构建β-连环素融合绿色荧光蛋白真核表达质粒,为进一步研究β-catenin在神经细胞内与其它蛋白质如tau、PSI的相互作用以及在阿尔茨海默病发病机制中的作用提供一种有用的工具。方法用亚克隆的方法将β-连环素基因插入到真核表达栽体pEGFP-C1,重组质粒pEGFP-cat瞬时转染野生型鼠成神经瘤细胞株．并在荧光倒置显微镜下观察转染效率。结果酶切鉴定和测序结果证实编码β-catenin的重组质粒构建成功,免疫荧光技术和免疫印记结果显示β-catenin-GFP融合蛋白在真核细胞中获得表达。结论成功构建β-连环素融合绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在鼠成神经瘤细胞中表达了β-catenin—GFP融合蛋白。     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA8真核重组表达质粒的体外表达分析

目的:分析弓形虫致密颗粒蛋白GRA8真核表达质粒的体外表达。方法:大量提取纯化重组真核表达质粒pVAX1-GRA8,瞬时转染培养的vero E-6细胞,RT-PCR和免疫印迹法检测GRA8在细胞中的表达。结果:从转染pVAX1-GRA8后的vero E-6细胞的RNA中扩增出GRA8的特异条带,转染细胞存在弓形虫感染血清识别的特异蛋白质条带。结论:真核表达质粒pVAX1-GRA8在vero E6细胞中获得表达。     

人B7-H1-Fc融合分子的构建及其在CHO细胞中的表达与鉴定

目的利用基因工程手段构建hB7-H1-Fc重组cDNA,用真核表达系统制备有活性的hB7-H1-Fc融合蛋白.方法 PCR方法从活化的人T细胞cDNA文库中扩增编码人B7-H1膜外区的cDNA序列, 将其与人IgG1Fc和pCI-neo片段连接,构建成hB7-H1-Fc重组表达载体.用脂质体法转染CHO细胞, 夹心ELISA法检测上清中融合蛋白hB7-H1-Fc的表达,经Protein A 亲合层析纯化,SDS-PAGE、免疫印迹鉴定表达产物. 结果 PCR扩增得到编码人B7-H1膜外区的727 bp基因片段,与hIgG1Fc的cDNA片段一起连接并插入pCI-neo表达质粒.重组质粒转染CHO细胞后, 夹心ELISA法检测显示培养上清中有hB7-H1-Fc蛋白表达.纯化后的hB7-H1-Fc蛋白经SDS-PAGE和免疫印迹鉴定其分子质量约51.76×103,与理论预测值相符. 结论成功构建了hB7-H1-Fc重组表达载体,利用哺乳动物细胞CHO表达出有活性的hB7-H1-Fc融合蛋白,为进一步研究B7-H1分子在免疫耐受、自身免疫性疾病中的作用奠定了基础.     

胃肠道间质瘤中C-kit原癌基因突变体的构建及功能研究

目的:构建含突变C-kit基因cDNA的真核表达质粒并行进一步的功能分析.方法:用RT-PCR方法从人胎脑组织克隆野生型C-kit基因蛋白编码区cDNA.根据胃肠道间质瘤中检测出的C-kit基因突变序列,体外突变野生型C-kit cDNA得到突变型C-kit cDNA,与pcDNA3重组成真核表达质粒,并用脂质体法稳定转染人胚胎肾细胞(human embryonic kidney cell,HEK)293细胞系,G418加压筛选出阳性克隆;用Western印迹法检测转染细胞KIT蛋白表达,绘制细胞生长曲线,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测转染HEK 细胞后细胞周期改变,并观察稳定转染突变型重组质粒人胚肾细胞在裸鼠内的成瘤性.分别设转染pcDNA3空白质粒和野生型的C-kit cDNA真核表达质粒的HEK细胞做为对照.结果:构建了突变型C-kit cDNA与pcDNA3的真核表达质粒; 功能检测分析表明:细胞生长曲线显示与对照组相比,实验组的生长速度明显增快;MTT比色显示,与对照组相比实验组细胞增殖活性显著增强;细胞周期检测结果显示,处于增殖期细胞(S G2-M)比例显著高于对照组;体内结果显示转染突变型C-kit基因的HEK细胞在裸鼠体内成瘤.结论:C-kit原癌基因突变体可促使人类细胞生长加快,增殖活性明显增强,并可以使更多的细胞由静止期进入增殖期, 并可使人胚胎肾细胞发生恶性转化,提示C-kit基因突变有可能是引起胃肠道间质瘤恶性转化的关键机制之一.     

趋化因子BLC表达载体构建及在肿瘤细胞中的表达

目的 建立真核表达重组体pcDNA-BLC的稳定转染细胞株,为研究趋化因子BLC的抗肿瘤免疫作用机制奠定基础。方法 以小鼠脾脏组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增BLC全长cDNA,并将扩增的cDNA片段插入pcDNA3．1( )真核表达质粒,构建重组质粒pcDNA-BLC,重组子经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术导入Colon26细胞,经G418筛选建立稳定转染细胞株。用免疫印迹法(Western Blot)鉴定转染细胞表达的蛋白质,证实BLC存在。用趋化实验证实转染细胞株表达的BLC有生物学活性。结果 真核表达重组体pcDNA-BLC构建成功,pcDNA-BLC稳定转染细胞株表达有生物学活性的BLC。结论 成功建立了BLC的稳定转染细胞株,为研究BLC的抗肿瘤免疫作用机制继而发展肿瘤疫苗奠定了基础。     

严重急性呼吸综合征冠状病毒2核衣壳蛋白原核表达、纯化及其抗血清制备

目的 表达并纯化重组的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）核衣壳（N）蛋白,通过免疫小鼠制备SARS-CoV-2 N蛋白抗血清。方法 将含有SARS-CoV-2 N基因的pET28a-N原核表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导蛋白表达,用Ni-NTA亲和层析柱纯化SARS-CoV-2 N重组蛋白;将SARS-CoV-2 N重组蛋白联合锰佐剂通过肌内和皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,获得抗血清;用蛋白质印迹分析检测SARS-CoV-2 N重组蛋白与SARS-CoV-2 N单克隆抗体及严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）N多克隆抗体的反应;用间接免疫荧光实验检测小鼠抗血清与真核表达质粒转染细胞中SARS-CoV-2 N重组蛋白的反应。结果 成功诱导大肠杆菌表达出可溶性的SARS-CoV-2 N重组蛋白,相对分子质量约为55 000,纯化出该重组蛋白;蛋白质印迹分析结果显示SARS-CoV-2 N重组蛋白能与SARS-CoV-2 N单克隆抗体及SARS-CoV N多克隆抗体结合;间接免疫荧光实验检测结果表明制备的小鼠抗血清能与哺乳动物细胞中表达的SARS-CoV-2 N重组蛋白结合。结论 成功表达、纯化出SARS-CoV-2 N重组蛋白,并制备出该蛋白的小鼠抗血清,为后续建立SARS-CoV-2的快速诊断方法及开展SARS-CoV-2 N蛋白的功能研究奠定了基础。     

炎症信号受体TLR-4基因的克隆及真核表达

为探讨TLR 4基因在真核细胞的表达情况 ,用RT PCR技术从人脐静脉血管内皮细胞总RNA扩增TLR 4全密码子cDNA序列。限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ双酶切真核表达质粒pcDNA3和TLR 4cDNA片段 ,构建重组质粒pcDNA3 TLR4。用Dosper阳离子转染试剂包裹质粒 ,转染人胚肾 2 93细胞 (HEK 2 93细胞 )。用免疫荧光细胞化学染色及流式细胞术分析TLR 4基因表达。结果 :从人脐静脉血管内皮细胞扩增出 2 72 6bp的TLR 4cDNA片段。经PCR、酶切及序列测定分析证实质粒 pcDNA3内插入了TLR 4cDNA片段 ,免疫荧光细胞化学染色和流式细胞术分析均检测到TLR 4基因在人胚肾 2 93细胞表达。本研究显示重组真核表达质粒 pcDNA3 TLR4在HEK 2 93细胞表达TLR 4蛋白 ,有利于进一步研究其相应配体和信号传导通路     

人Slit2全长cDNA的真核表达及鉴定

目的:对人神经轴突导向因子Slit2(hSlit2)全长cDNA进行真核表达并进行鉴定。方法:采用分段克隆的方法获得hSlit2全长cDNA的克隆,并构建hSlit2全长cDNA真核表达重组质粒pCMV-GFP-C/hSlit2,用磷酸钙共沉淀法将其转染到人胚肾细胞HEK-293细胞中,通过免疫印迹法鉴定其蛋白表达。结果:经酶切鉴定证实hSlit2全长cDNA的真核表达载体构建成功,免疫荧光蛋白和Western blot结果证实hSlit2全长cDNA在HEK-293细胞中的表达。结论:人神经轴突导向因子hSlit2真核表达载体构建成功,为进一步完善hSlit2蛋白及各水解片段功能研究提供了实验基础。     

人脂联素受体1和2的真核表达

目的 扩增和表达人脂联素受体1（AdipoR1）和人脂联素受体2（AdipoR2）基因。方法 利用RT-PCR方法扩增AdipoR1和AdipoR2全长cDNA。将AdipoR1和AdipoR2的cDNA构建到真核表达载体pcDNA3．1。重组质粒转染HEK293细胞。通过免疫荧光技术标记HEK293细胞的AdipoR1和AdipoR2融合蛋白,共聚焦显微镜观察AdipoR1和AdipoR2在细胞中的定位。结果 成功构建真核表达重组质粒pcDNA3．1-adipoR1和pcDNA3．1-adipoR2．重组质粒转染HEK293细胞后。定位于HEK293细胞膜上。结论 AdipoR1和AdipoR2重组质粒的构建和在HEK293细胞中的成功表达。为进一步研究其与胰岛素抵抗的关系创造了条件。     

登革2型病毒NS1-NS2a基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建登革2型病毒NS1-NS2a基因真核表达质粒.方法 RT-PCR扩增NSI-NS2a基因片段后,将其克隆人真核表达载体pReceiver-M01a;过PCR、酶切、测序和间接免疫荧光染色鉴定重组质粒.结果 经PCR扩增、酶切和测序验证,重组质粒构建正确,命名为pRe-NS1-NS2a;重组质粒转染Vero细胞后,间接免疫荧光染色显示细胞质中有登革2型病毒特异性蛋白的表达.结论 成功构建了真核表达质粒pRe·NS1-NS2a.     

KM鼠中出现稀毛鼠的遗传规律

目的在KM鼠封闭群中发现一只雄性稀毛小鼠个体,探讨该鼠稀毛性状的发生原因,试图培育稀毛鼠品系。方法采用同胞交配、回交等繁殖方法做遗传实验。结果在近交繁殖的F2代,宗祖鼠与F1回交的后代里,均有稀毛鼠个体出现。证明该鼠的稀毛性状与遗传有关。结论KM鼠稀毛性状,是受单基因控制的常染色体隐性遗传。其遗传规律完全符孟德尔的独立分离定律。     

低硒小鼠模型的建立及低硒对心肌的影响

目的建立低硒实验动物模型,观察低硒对心肌的影响。方法利用黑龙江地产酵母配制低硒小鼠饲料,使用配制的小鼠饲料喂养BALB/c幼鼠,经过4个月的喂养,测定血清、肝脏、心肌细胞的硒含量,观察心肌超微结构的变化,测定血清心肌酶的变化。结果利用黑龙江地产酵母配制的低硒饲料,硒含量为0.016 mg/kg,符合低硒标准。BALB/c鼠用该饲料喂养4个月,心肌、肝脏、血清硒含量分别为0.187 mg/kg、0.219 mg/kg、0.241mg/kg,符合低硒诊断标准。观察低硒鼠心肌超微结构,可见心肌细胞线粒体肿胀,细胞核出现了异型性,血清心肌酶较常硒鼠升高。结论利用黑龙江地产酵母成功配制了低硒饲料。经过低硒饲料饲养可建立低硒鼠模型。低硒可以引起BALB/c鼠心肌细胞损伤。     

建立小鼠子宫内膜损伤模型的研究

目的 建立小鼠子宫内膜损伤模型.方法 借鉴热球子宫内膜去除术原理,利用宫腔导管贯穿小鼠Y型宫腔的一侧,给予预温85 ℃流动热水经80 s热损伤小鼠子宫内膜组织,达到子宫内膜广泛剥脱目的.结果 处理后48 h宫腔内见子宫内膜层广泛脱落,部分子宫腔壁内膜完全脱落,内膜间质可见大量血管充血;处理后7 d子宫腔及浅肌层大量的炎...     

小鼠卵母细胞的孤雌激活

目的 探讨一种有效的孤雌激活方法。方法 用乙醇、Ca^2＋载体A23187分别联合6-二甲氨基嘌呤对小鼠卵母细胞进行孤雌激活。结果 7％乙醇卵母细胞活化率、囊胚形成率分别达80.88％、10.29％、;5μmol/L Ca^2＋A23187卵母细胞活率、囊胚形成率分别达86.88％、11.48％。两者差异无显著性。结论 应用乙醇、Ca^2＋载体A23187联合6-二甲氨基嘌呤处理小鼠卵母细胞,均可实现小鼠卵母细胞孤雌发育。     

广东省屏障设施小鼠群中小鼠肝炎病毒感染情况

目的了解我省屏障设施小鼠群中小鼠肝炎病毒（MHV）感染情况。方法收集2003-2007年实验动物小鼠血清样品的监测数据,并对MHV感染情况有关数据进行分析。结果在6个屏障设施内抽检小鼠,5个屏障设施内抽检的样品检出MHV毒抗体阳性,检出率分别为1.4%,2.4%,2.8%,2.6%,13.2%。品系方面主要分布在BALB/c,BALB/c-nu/nu,NIH三个品系,检出率分别为3.6%,14%,7.1%。结论屏障设施小鼠群中小鼠肝炎病毒感染较为普遍。     

人和小鼠淋巴细胞体外粘附小鼠HEV的比较

本文运用淋巴细胞体外粘附淋巴结高内皮小静脉(HEV)的实验,比较正常人外周血淋巴细胞与小鼠淋巴细胞粘附小鼠HEV能力的不同。结果表明人淋巴细胞在体外能粘附小鼠HEV,但其阳性HEV百分率低于小鼠淋巴细胞,这可能与人和小鼠淋巴细胞膜表面细胞粘附分子结构和功能的相似性有关。     

痘苗病毒毒力测定及其免疫血清的制备

目的 测试痘苗病毒毒力,制备痘苗病毒免疫血清,为药物评价和病毒检测奠定基础.方法 鸡胚绒毛尿囊膜培养痘苗病毒,测定病毒的TCID50和小鼠毒力.将痘苗病毒悬液稀释成100TCID50,0.2%福尔马林灭活,分别在0、7、14 d以腹腔注射的方式免疫BALB/c小鼠,用IFA、IEA、ELISA方法评价血清的敏感性和特异性.结果 痘苗病毒TCID50/0.0 5 mL=1.8×104,小鼠LD50/0.2 mL=106,8;制备的免疫血清经IFA法测定效价为1:320,IEA法测血清效价为1:160,ELISA测血清效价1:6400.结论 确定的细胞和小鼠毒力将为药物测定提供基础比对数据;制备的痘苗病毒免疫血清具有高度的敏感性和特异性,可作为测试对照血清使用.     

完整分离围着床期小鼠子宫内膜方法的建立

目的　为了获得组织结构完整、功能正常的子宫内膜样本以进行胚胎着床的体外研究。方法　作者比较了剪碎法、刮取法和挤压法取得子宫内膜的效果。结果　挤压法得到的小鼠子宫内膜呈圆形条状；子宫内膜组织结构完整，具有内膜上皮并包含腺体、血管的基质；意外发现子宫系膜侧的子宫内膜缺损。结论　挤压法是获取子宫内膜进行相关研究的理想方法。     

动脉粥样硬化基因工程小鼠模型

建立可靠的动脉粥样硬化动物模型对于探明其病因、发病机制及防治药物的开发均具有重要的意义。本文介绍了载脂蛋白、脂质代谢有关的受体、脂质代谢有关的酶和转运蛋白等十几种动脉粥样硬化相关基因的基因工程小鼠模型的特点及应用。     

子宫内膜上皮细胞与小鼠胚胎共培养对小鼠胚胎早期发育的影响

目的:采用子宫内膜上皮细胞与小鼠胚胎共培养,观察其对早期胚胎体外发育的影响。方法:对小鼠子宫内膜上皮细胞进行分离、培养鉴定,然后与体外受精的小鼠胚胎进行共培养,观察共培养对小鼠胚胎卵裂率、孵化率以及囊胚期胚胎总细胞数的影响。结果:与无上皮细胞相比,共培养明显促进了小鼠桑椹胚率(71.3%和61.2%,P<0.05),囊胚率(50.0%和39.7%,P<0.05),囊胚孵化率(34.8%和24.3%,P<0.05)和胚胎总细胞数(44.1和35.6,P<0.05)。结论:子宫内膜上皮细胞能够促进小鼠胚胎的体外发育,对早期胚胎的体外发育环境具有优化作用。