温胆汤含药血清对谷氨酸条件下原代星形胶质细胞P38MAPK及PKC的影响

目的:探讨温胆汤含药血清在谷氨酸(Glu)环境条件下对星形胶质细胞P38MAPK和PKC表达的影响。方法:将40只SD大鼠随机分为5组:正常组、氯氮平20mg/kg组、温胆汤40g/kg组、温胆汤30g/kg组、温胆汤20g/kg组,每组8只。正常组用等量生理盐水ig,氯氮平组ig 20 mg/kg,ig温胆汤生药40、30、20 g/kg,1次/d,8天后处死取血,制备含药血清。胶质原纤维酸性蛋白免疫染色法鉴定培养的星形胶质细胞纯度。星形胶质细胞在谷氨酸(0、5、10μmol/ml)条件下经含药血清处理,即谷氨酸对照组、正常血清组、氯氮平20mg/kg含药血清组、温胆汤40g/kg、30g/kg、20g/kg血清组,处理24h、36h和48h后,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞存活率;ELISA法检测P38MAPK磷酸化和非磷酸化及PKC蛋白表达的影响。结果:培养的星形胶质细胞纯度在95%以上。谷氨酸(0μmol/ml)条件下,温胆汤40g/kg、30g/kg含药血清组在3个时间段不同程度增加星形胶质细胞存活率;谷氨酸(5、10μmol/ml)条件下,温胆汤含药血清处理24h、36h后,温胆汤40g/kg、30g/kg、20g/kg含药血清组不同程度增加的细胞存活率;48h后,温胆汤40g/kg含药血清组增加的细胞存活率。谷氨酸(0、5、10μmol/ml)条件下,氯氮平20mg/kg含药血清组、温胆汤30g/kg含药血清组能显著上调星形胶质细胞P38MAPK蛋白磷酸化和非磷酸化的表达。谷氨酸(0、5μmol/ml)条件下,温胆汤40g/kg、30g/kg、20g/kg含药血清组显著降低星形胶质细胞PKC表达;谷氨酸(10μmol/ml)条件下,温胆汤40g/kg含药血清组显著降低星形胶质细胞PKC表达。结论:一定谷氨酸环境下温胆汤能不同程度的增加星形胶质细胞的存活率,能上调P38MAPK磷酸化和非磷酸化的表达及降低PKC蛋白的表达,从而间接反映出温胆汤能调节星形胶质细胞GJIC(细胞缝隙连接)的功能。     

温胆汤含药血清对星形胶质细胞Cx43和GJ的影响

目的:探讨温胆汤含药血清对星形胶质细胞缝隙连接(GJ)和连结蛋白43(Cx43)表达的影响。方法:40只SD大鼠随机分为5组:正常组、氯氮平20mg/kg组、温胆汤40g/kg组、温胆汤30g/kg组、温胆汤20g/kg组。氯氮平组ig氯氮平20 mg/kg,温胆汤40g/kg、30g/kg、20g/kg组分别ig温胆汤生药40、30、20 g/kg,正常组用等量生理盐水ig,1次/d,8天后处死大鼠,取血,离心取血清,灭活,过滤除菌备用。将星形胶质细胞分为6组:对照组(普通培养基培养)、正常鼠血清组、氯氮平20mg/kg血清组、温胆汤40g/kg血清组、温胆汤30g/kg血清组、温胆汤20g/kg血清组,按照相应的分组更换含药血清进行培养24h、36h、48h后,采用划痕染料标记示踪技术(SLDT)在荧光显微镜下,通过荧光黄扩散距离测定星形胶质细胞间GJ水平;Western blotting法检测星形胶质细胞中Cx43磷酸化和非磷酸化的表达。结果:温胆汤40g/kg、30g/kg、20g/kg血清组作用于星形胶质细胞24h、36h、48h后,能使荧光扩散面积及强度不同程度的显著增加;并显著提高Cx43磷酸化和非磷酸化的表达。结论:温胆汤能够上调星形胶质细胞Cx43磷酸化和非磷酸化的表达,增强GJ水平,从而改善细胞间隙连接通讯(GJIC)功能。     

温胆汤对精神分裂症模型鼠海马组织Cx43、谷氨酸及神经胶质细胞超微结构的影响

目的:研究温胆汤对精神分裂症模型鼠海马组织Cx43、谷氨酸及神经胶质细胞超微结构的影响。方法:将60只大鼠随机分为5组:正常组、模型组、温胆汤40 g/kg组、温胆汤20 g/kg组、温胆汤10 g/kg组,每组12只。在造模前,正常组和模型组用等量生理盐水灌胃,温胆汤40 g/kg组、温胆汤20 g/kg组、温胆汤10 g/kg组分别灌胃给予等体积药物,每日给药1次,连续给药21天。在最后1次给药2时后,正常组除外,其余各组一次性ip MK801 0.6 mg/kg,建立精神分裂症模型;3天后处死大鼠,取海马组织检测。采用双抗体夹心-酶联免疫吸附(ABC-ELISA)法检测海马组织中Cx43的含量,RT-PCR半定量法对脑组织Cx43 mRNA表达量进行分析,免疫组化检测海马组织中谷氨酸活性的表达,电镜观察海马组织神经胶质细胞的超微结构。结果:温胆汤40 g/kg组、温胆汤20 g/kg组和温胆汤10 g/kg组均不同程度升高海马组织Cx43的含量和Cx43 mRNA的表达,使海马组织谷氨酸活性的表达也显著升高,并且减轻神经胶质细胞的凋亡。结论:温胆汤可明显减轻精神分裂症模型鼠神经胶质细胞的凋亡,提高谷氨酸活性的表达和升高海马组织Cx43的含量、Cx43 mRNA的表达,从而对缝隙连接通讯(GJIC)的功能起到调节作用。     

温胆汤含药血清对谷氨酸环境下星型胶质细胞凋亡及NRG1、ErbB4表达的影响

目的:探讨温胆汤含药血清对谷氨酸环境下星型胶质细胞凋亡及NRG1、ErbB4表达的影响。方法:SD大鼠灌胃相应药物或生理盐水后制备含药血清,灭活,过滤除菌,EP管(4mL)分装备用。以正常组、模型组、氯氮平20mg/kg含药血清、温胆汤40g/kg、20g/kg、10g/kg含药血清培养,干预谷氨酸环境下星形胶质细胞,流式细胞仪检测星形胶质细胞凋亡;Western bloting、Real-time PCR分别测定星型胶质细胞NRG1、ErbB4蛋白、磷酸化和mRNA表达。结果:温胆汤各浓度含药血清组均能明显减少星形胶质细胞凋亡;降低NRG1、ErbB4蛋白和mRNA表达,提高其磷酸化表达。结论:温胆汤10%含药血清可有效调节NRG1、ErbB4表达,从而调控NRG1-ErbB4信号通路的功能,保护神经细胞,这也许是温胆汤能够治疗精神分裂症的作用机制之一。     

温胆汤对精神分裂症模型鼠海马PKC,p38MAPK及P-Cx43的影响

目的:研究温胆汤对精神分裂症模型鼠大脑蛋白激酶C(PKC),p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)及磷酸化连接蛋白Cx43(P-Cx43)蛋白表达的影响。方法:将72只清洁级SD大鼠随机平均分为6组:正常组(A,生理盐水20 m L·kg-1),模型组(B,生理盐水20 m L·kg-1),氯氮平组(C,20 mg·kg-1),温胆汤高剂量组(D,40 g·kg-1),温胆汤中剂量组(E,20g·kg-1),温胆汤低剂量组(F,10 g·kg-1)。A,B组ig生理盐水;C组ig氯氮平;D,E,F组分别ig温胆汤,1次/d,21 d后,B,C,D,E,F组一次性ip地卓西平马来酸盐(MK-801)0.6 mg·kg-1,建立精神分裂症模型,行为学观察3 d后,处死大鼠,取海马组织,采用蛋白免疫印迹(Western bloting)法检测海马组织中PKC,p38 MAPK及P-Cx43蛋白的含量。结果:与正常组相比,模型组大鼠出现刻板行为;海马组织PKC,p38 MAPK及P-Cx43含量明显升高(P0.05)。与模型组比较,温胆汤各组及氯氮平组均不同程度改善了模型鼠的一般状况;明显降低海马组织PKC,p38 MAPK及P-Cx43的含量(P0.05)。Cx43的磷酸化程度也有统计学意义(P0.05),且模型组磷酸化水平最高。结论:温胆汤可明显降低PKC,p38 MAPK及P-Cx43蛋白的浓度,进而调节缝隙连接通讯(GJIC)的功能。     

《回回药方》中扎里奴思方对精神分裂症模型鼠海马组织Cx43、谷氨酸及神经胶质细胞超微结构的影响

目的研究民族药方"扎里奴思方"对精神分裂症模型鼠海马组织中Cx43、谷氨酸及神经胶质细胞超微结构的影响。方法选择符合实验要求的实验大鼠60只,设置正常组,对照组(模型),实验组(A\B\C),每组12只大鼠,造模前,正常组和对照组予等量生理盐水灌胃,A、B、C组分别予40g/kg、20g/kg、10g/kg的等量药剂(扎里奴思方煎剂)灌胃,每天1次,连续给药21天,给药结束后2 h,各组(不包括正常组)予MK 801 0.6 mg/kg ip,建立实验动物模型,给药后3天处死动物,取海马组织用于检测。采用ABC-ELISA法检测Cx43含量,运用RT-PCR半定量法分析脑组织Cx43 mRNA表达情况,免疫组化检测海马组织中谷氨酸的表达,海马组织神经胶质细胞的超微结构用电镜进行观察。结果实验组(A\B\C)海马组织中的Cx43、Cx43 mRNA及谷氨酸活性表达均有不同程度升高,且减少了神经胶质细胞凋亡。结论《回回药方》中扎里奴思方对精神分裂症模型鼠海马组织中Cx43、谷氨酸及神经胶质细胞超微结构有积极影响,可能起到调节缝隙连接通讯作用。     

温胆汤含药血清对谷氨酸环境下星型胶质细胞凋亡及PI3K，Akt，GSK3β表达的影响

目的:探讨温胆汤含药血清对谷氨酸环境下星型胶质细胞的保护作用及磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/糖原合成酶激酶3β(GSK3β)信号通路的影响。方法:将60只大鼠随机分为5组,其中正常组20只,氯氮平组、温胆汤高、中、低剂量组,每组10只。正常组给予20 mL·kg-1生理盐水灌胃,氯氮平组给予氯氮平原药20 mg·kg-1灌胃,温胆汤组分别给予剂量为40,20,10 g·kg-1的温胆汤灌胃,1次/d,8 d后处死大鼠,取血,离心取血清,灭活,过滤除菌,离心管分装备用。将星型胶质细胞分为空白组、模型组、氯氮平组、温胆汤高、中、低剂量组,其中空白组、模型组给予空白血清培养,其余各组给予相应含药血清培养;除空白组外,其余各组用10 mmol·L-1谷氨酸处理24 h后予流式细胞仪检测星形胶质细胞凋亡率;蛋白免疫印迹法(Western blot),实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)分别检测星型胶质细胞PI3K,Akt,GSK3β蛋白和mRNA的表达。结果:与空白组比较,模型组细胞凋亡率显著升高(P0. 01);与模型组比较,温胆汤各剂量组细胞凋亡率则显著下降(P0. 01)。与空白组比较,模型组细胞PI3K,Akt,GSK3β蛋白、磷酸化蛋白表达显著降低(P0. 01);与模型组比较,温胆汤各剂量组细胞PI3K,Akt,GSK3β蛋白、磷酸化蛋白表达明显升高(P0. 05,P0. 01)。与空白组比较,模型组细胞PI3K,Akt,GSK3βmRNA的表达显著降低(P0. 01);与模型组比较,温胆汤各剂量组细胞PI3K,Akt,GSK3βmRNA表达明显升高(P0. 05,P0. 01)。结论:温胆汤含药血清可有效升高PI3K,Akt,GSK3β表达,从而调控PI3K/Akt/GSK3β信号通路,保护神经细胞。     

六味地黄丸含药血清对自杀基因治疗黑色素瘤增效作用的缝隙连接机制初探

目的 探讨六味地黄丸含药血清对HSV-tk/GCV自杀基因系统杀伤小鼠黑色素细胞瘤B16细胞增效作用的缝隙连接机制。方法 制备六味地黄丸含药血清（分别为2.5%、5.0%、10.0%六味血清）及10.0%对照血清。 采用RT-PCR法检测六味地黄丸含药血清对B16细胞株的缝隙链接蛋白（Cx）26和Cx43 mRNA的影响,Western blot法和间接免疫荧光法检测其对B16细胞Cx26和Cx43蛋白表达的影响;RT-PCR检测Cx26－309、Cx26－337、Cx26－367、Cx26－2098 SiRNA对Cx26的干扰效率,选用干扰效率最高的Cx26－2098 SiRNA干扰Cx26基因后观察六味地黄丸联合HSV-tk/GCV的旁观者效应;MTT法检测细胞间缝隙连接通讯功能（gap junctional intercellular communication, GJIC）抑制剂甘草次酸（GA）对六味地黄丸联合tk/GCV系统对B16细胞杀伤作用的影响,实验设为对照血清组,2.5%、5.0%、10.0%六味血清组（简称低、中、高剂量组）及对照血清联合GCV组,低、中、高剂量联合GCV组,低、中、高剂量联合GCV加GA组。GCV终浓度为20 mol/L,GA终浓度为50 mol/L。结果 六味地黄丸含药血清能提高B16细胞中Cx43 mRNA及蛋白的表达,且具有量效依赖关系;对Cx26 mRNA与蛋白的表达具有双向调节作用,低剂量时具有抑制作用而高剂量是能上调其表达;SiRNA干扰Cx26基因表达后,六味地黄丸联合自杀基因治疗的旁观者效应与没有干扰前比较无明显的变化;低、中、高剂量联合GCV组在GA阻断前细胞抑制率（48.75%、59.39%、69.28%）与阻断后细胞抑制率（29.14%、38.71%、58.13%）比较,显著降低,差异有统计学意义（P<0.01）。结论 六味地黄丸含药血清对HSV-tk/GCV自杀基因系统杀伤恶性黑色素瘤B16细胞的增效作用与缝隙连接机制有关,可能是通过提高Cx26和Cx43等缝隙连接蛋白表达而达到协同增效作用。     

温胆汤对精神分裂症大鼠海马组织NRG1、ErbB4 mRNA表达及其行为学的影响

目的:研究温胆汤对精神分裂症模型大鼠行为学及其海马组织神经调节蛋白1(NRG1)、ErbB4 mRNA表达的影响。方法:将60只大鼠随机分为6组,即正常组、模型组、氯氮平20 mg/kg组、温胆汤40g/kg组、温胆汤20g/kg组、温胆汤10g/kg组。正常组和模型组分别ig生理盐水20 ml/kg,氯氮平20 mg/kg组ig氯氮平原药20 mg/kg,温胆汤40、20、10 g/kg组分别ig温胆汤生药40,20,10 g/kg,1次/d,共21 d。在末次给药2 h后,除正常组外,其余各组一次性ip MK-801 0.6 mg/kg,以诱发精神分裂症模型,造模后,观察并记录各组大鼠的行为学改变,观察3 d后,处死并取海马组织检测,观察大鼠的行为学改变,并做刻板行为和共济失调评分;RT-PCR检测大鼠海马组织NRG1、ErbB4 mRNA表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠刻板行为和共济失调评分明显升高;其海马组织NRG1、ErbB4 mRNA的表达也明显升高。与模型组比较,温胆汤40、20、10 g/kg组均能明显降低大鼠刻板行为和共济失调评分;也能明显降低海马组织NRG1、ErbB4 mRNA的表达。结论:温胆汤通过降低精神分裂症易感基因NRG1及其受体ErbB4蛋白的表达,改善了大鼠的行为学改变,从而防治精神分裂症。     

补阳还五汤通过调节血管平滑肌细胞Cx43作用于动脉粥样硬化的研究

目的:研究补阳还五汤抗同型半胱氨酸(Hcy)诱导血管平滑肌细胞(HUVSMC)增殖的作用及其机制。方法:以14.9g/kg补阳还五汤剂量连续灌胃SD大鼠1周,提取补阳还五汤含药血清,并与胎牛血清(FBS)按一定比例,配置成20%(20%补阳)、10%(10%补阳+10%FBS)、5%(5%补阳+15%FBS)补阳还五汤含药血清组组。血管平滑肌细胞长满培养瓶或培养板后,用同型半胱氨酸分组造模,将细胞随机分为10组:空白组、模型组、乙酰半胱氨酸(NAC)组、20%、10%、5%补阳还五汤含药血清组、NF-kB阻断剂PDTC组、MAPK阻断剂SB20组、ERK阻断剂PD98组、PKC阻断剂Stau组。蛋白质印迹法(Western blot)测定血管平滑肌细胞Cx43蛋白的表达量;RT-PCR技术检测各组血管平滑肌细胞Cx43 mRNA水平;建立血管内皮-平滑肌细胞共培养体系,Western blot分别检测内皮细胞和平滑肌细胞内Cx43的表达;电镜检测血管内皮-平滑肌细胞共培养体系细胞缝隙连接的变化。结果:Western blot实验中,平滑肌细胞与共培养体系中的内皮细胞、平滑肌细胞的Cx43蛋白表达水平,模型组与空白组比较,模型组中Cx43蛋白表达量均显著升高;乙酰半胱氨酸组,20%、10%、5%补阳还五汤含药血清组与模型组比较,Cx43蛋白表达显著下调。RT-PCR实验中,模型组与空白组比较,模型组中Cx43mRNA表达量显著升高;乙酰半胱氨酸组、20%、10%、5%补阳还五汤含药血清组与模型组比较,Cx43mRNA表达量显著降低。电镜检测细胞缝隙连接实验中:模型组与空白组比较,内皮-平滑肌细胞之间形成的缝隙连接遭到破坏,而20%补阳还五汤含药血清组却能形成与正常组相似的连接。结论:补阳还五汤可能通过下调Cx43蛋白以及其mRNA的表达,改善细胞之间的缝隙连接,减少血管平滑肌细胞增殖而发挥抗动脉粥样硬化的作用。