蛋白磷酸酶2Ac介导Smad3中间连接区去磷酸化促肾小管上皮细胞间充质转分化的研究

目的:通过蛋白磷酸酶2Ac(PP2Ac)过表达和小干扰RNA质粒转染人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)后予以转化生长因子β1(TGF-β1)刺激,观察PP2Ac对细胞外基质合成、肾小管上皮细胞间充质转分化(EMT)和Smad3中间连接区磷酸化的影响,探讨PP2Ac促肾间质纤维化的机制。方法:常规培养HK-2细胞,分为对照组、TGF-β1组和质粒转染+TGF-β1组。采用RT-PCR和Western Blot法检测PP2Ac、纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E选择素(E-cadherin)表达水平。采用Western blot法检测Smad3、Smad3中间连接区p Smad3-L(p Ser204)和p Smad3-L(p Ser208)表达情况。结果:RT-PCR和Western Blot结果均显示:PP2Ac过表达质粒转染HK-2细胞再予TGF-β1刺激24h后,PP2Ac表达较TGF-β1组升高,同时FN、Col-Ⅰ和a-SMA表达明显上调,E-cadherin表达下调;而PP2Ac小干扰RNA转染HK-2细胞后再予TGF-β1刺激24h,较TGF-β1组,PP2Ac表达降低,FN、Col-Ⅰ和α-SMA表达减少,E-cadherin表达增高(P0.05)。Western Blot结果显示:TGF-β1刺激HK-2细胞1h时PP2Ac和Smad3中间区磷酸化的蛋白表达均达到峰值;HK-2细胞转染PP2Ac过表达质粒再予TGF-β1刺激1h后,与单纯TGF-β1刺激组比较,核蛋白中p Smad3-L(p Ser204)和p Smad3-L(p Ser208)表达均下降;而PP2Ac小干扰RNA转染HK-2细胞再予TGF-β1刺激1h后,核蛋白中p Smad3-L(p Ser204)和p Smad3-L(p Ser208)蛋白表达均增加(P0.05)。结论:PP2Ac促进肾小管上皮细胞外基质的生成及EMT;PP2Ac介导肾小管上皮细胞Smad3中间连接区去磷酸化。     

骨成形蛋白7拮抗转化生长因子β1致肾小管上皮细胞细胞外基质分泌的作用

目的:观察骨成形蛋白7(BMP-7)拮抗转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)细胞外基质(ECM)分泌作用,并对相关信号通路进行研究,对BMP-7抗纤维化机制进行深入探讨。方法:将不同浓度BMP-7预处理HK-2细胞,随后予以5ng/mlTGF-β1刺激,利用荧光实时定量PCR和Western印迹检测ECM表达、利用Western印迹和凝胶迁移滞后实验(EMSA)检测相关信号通路蛋白表达。结果:荧光实时定量PCR和Western印迹结果表明,BMP-7可以浓度依赖方式下调TGF-β1刺激后HK-2细胞I型胶原,III型胶原,纤维连接蛋白在mRNA和蛋白水平表达。TGF-β1可促进HK-2细胞Smad2、Smad3磷酸化。但TGF-β1上调的Smad2、Smad3磷酸化可被BMP-7抑制,差异有统计学意义(P<0.05和P<0.01)。EMSA结果表明,BMP-7则可抑制TGF-β1上调的NF-κB活性。结论:BMP-7可通过抑制Smad2/3磷酸化、抑制NF-κB的DNA结合活性达到阻断TGF-β1诱导HK-2分泌ECM的效应。     

lncRNA ZFAS1吸附miR-34b-5p抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)锌指结构反义转录本(ZFAS)1、miR-34b-5p对高糖诱导的肾小管上皮细胞(HK-2)损伤的影响。方法 将HK-2细胞分为对照组(Con, 5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG,25 mmol/L葡萄糖)、HG+pcDNA组、HG+pcDNA-ZFAS1组、HG+anti-miR-NC组、HG+anti-miR-34b-5p组、HG+pcDNA-ZFAS1+miR-NC组、HG+pcDNA-ZFAS1+miR-34b-5p组。试剂盒检测白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平,流式细胞术检测细胞凋亡,实时定量PCR(RT-qPCR)检测ZFAS1和miR-34b-5p表达水平。双荧光素酶报告实验确定ZFAS1和miR-34b-5p的靶向关系。结果 高糖诱导后HK-2细胞凋亡率、培养液中IL-6和TNF-α水平显著升高,ZFAS1表达显著降低,miR-34b-5p表达显著升高(P<0.05)。过表达ZFAS1后,高糖诱导的HK-2细胞培养液中IL-6和TNF-α水平显著降低,细胞凋亡率显著降低(P<0.05)...     

Smad锚着蛋白在高糖诱导人肾小管上皮细胞细胞外基质沉积中的作用

目的:阐明Smad锚着蛋白(Smad anchor for receptor activation,SARA)在高葡萄糖诱导的人近端肾小管上皮细胞系(HK-2细胞)细胞外基质(ECM)沉积中的作用及分子机制,探讨以SARA为靶点抑制高葡萄糖诱导的HK-2细胞ECM沉积的策略.方法:用高浓度葡萄糖(30 mmol/L D-葡萄糖)刺激HK-2细胞,通过Western Blot及实时定量PCR( Real-time PCR)检测纤维连接蛋白(FN)和I型胶原(Col I),进而检测转化生长因子β1( TGF-β1)、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3的表达变化,通过细胞免疫荧光、Western Blot、Real-time PCR检测SARA的表达变化;分别转染全长SARA质粒[SARA(WT)]及敲除SBD结构域的SARA质粒[SARA(dSRD)],检测转染后高糖诱导HK-2细胞FN及Col I表达的变化.结果:Western Blot及Real-time PCR结果显示,30mmol/L D-葡萄糖刺激后,HK-2细胞Col I蛋白及mRNA表达呈时间依赖性升高.高糖可诱导TGF-β1、Smad3蛋白及其mRNA表达呈时间依赖性上调;Smad2 mRNA表达呈时间依赖性上调,而其蛋白表达呈时间依赖性下调;高糖可促进Smad2和Smad3磷酸化,但Smad3的活化时间更长.而SARA的蛋白及mRNA表达呈时间依赖性降低,细胞免疫荧光结果亦证实高糖刺激后SARA表达下降.与高糖组相比,转染SARA(WT)可使HK-2细胞FN和 Col I表达下调;转染SARA (dSBD)对高糖诱导的HK-2细胞FN和ColI表达无明显影响.结论:高糖诱导的HK-2细胞ECM沉积过程中,TGF-β1信号通路活化,SARA的表达下调;过表达SARA可能通过上调Smad2的蛋白表达,抑制TGF-β31信号传导,从而减少高糖诱导的HK-2细胞ECM分泌.     

miR-200c改善转化生长因子－β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化的机制

目的探讨miR-200c是否通过调节自噬缓解转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肾小管上皮细胞纤维化。方法不同浓度(0、5、10、15、20、30 ng/ml)TGF-β1刺激HK2细胞48 h后倒置显微镜下观察细胞形态,CCK-8检测细胞增殖情况。选择致HK2细胞增殖最快的TGF-β1浓度(c)进行转染实验:细胞转染40 nmol/L无意义序列RNA(NC组);细胞转染40 nmol/L无意义序列RNA后c浓度TGF-β1处理细胞48 h(NC+T组);细胞转染40 nmol/L miR-200c mimics(M组);细胞转染40 nmol/L miR-200c mimics后c浓度TGF-β1处理细胞48 h(M+T组)。qRT-PCR检测miR-200c转染效率。Western blotting检测4组细胞Smad通路蛋白Smad2和Smad3、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、钙黏蛋白(E-cad)表达量,以及自噬相关蛋白LC3(包括LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值)和P62。结果 10 ng/ml的TGF-β1刺激HK2细胞48 h后增殖最快,镜下细胞形态由正常的卵圆形铺路石状变为长梭形,纤维化形态最明显。qRT-PCR显示M组miR-200c表达量是NC组(212.42±12.25)倍(t=24.41,P=0.000),说明转染有效。Western blotting结果显示,与NC组比较,NC+T组加入10 ng/ml TGF-β1的HK2细胞Smad2、Smad3和α-SMA表达量增加,E-cad蛋白表达量降低(P0.05)。与NC+T组比较,M+T组Smad2、Smad3和α-SMA表达量减少,E-cad表达量增加(P0.05),提示miR-200c表达增加抑制了纤维化。进一步发现,M组较NC组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平增加,P62表达水平降低,提示自噬活性增加;M+T组较NC+T组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平增加,P62表达水平降低,提示miR-200c表达升高缓解了纤维化程度。结论 miR-200c可能通过激活细胞自噬缓解TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化。     

BMP-7过表达抑制大鼠肝星状细胞上皮-间叶转化

目的观察慢病毒介导的BMP-7高表达是否能抑制大鼠HSC-T6细胞发生上皮-间叶转化（epithelial to mesenchymal tran-sition,EMT）,并能拮抗TGF-β1的促EMT作用。方法构建大鼠BMP-7慢病毒表达载体,体外感染HSC-T6细胞株,将成功感染BMP-7重组慢病毒的细胞给予TGF-β1（5 ng/mL）或溶酶体处理。Real-time PCR检测α-SMA、S100A4、E-cadherin mRNA转录水平。Western blotting检测α-SMA、S100A4、E-cadherin、Ⅰ型胶原蛋白表达水平。结果 BMP-7慢病毒感染HSC-T6后,无论TGF-β1存在与否,real-time PCR检测到α-SMA、S100A4 mRNA转录下调,E-cadherin转录上调。Western blotting显示α-SMA、S100A4及Ⅰ型胶原蛋白表达下调,E-cadherin蛋白表达上调。实验组与空病毒对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）,空病毒对照组与空白组比较,差异无统计学意义。结论 BMP-7能有效拮抗TGF-β1对HSC-T6的促EMT作用,可能成为肝纤维化治疗的新途径。     

表达持续活化型ALK3抑制大鼠肝星状细胞活化

背景肝纤维化与肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)上皮细胞间充质转化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)相关, TGF-β1在其中起着重要的作用,而BMP7能够拮抗TGF-β1,目前主要研究的是TGF-β/BMPs-Smad信号通路, ALK3属于BMPs的持续活化Ⅰ型受体,在肝纤维化分子研究机制中较少运用.目的观察大鼠HSCs中稳定表达持续活化型ALK3时Smad1磷酸化及纤维化相关基因E-cadherin、α-SMA、col1A2等表达情况,探讨BMP-7信号转导在肝纤维化发生发展过程中拮抗TGF-β1信号及其抗肝纤维化机制.方法建立体外培养大鼠HSCs (HSC-T6)持续活化型ALK3的稳定表达细胞株, MTT检测细胞的增殖; RT-PCR检测col1A2等相关分子mRNA水平; Western blotting检测Samd1、E-cadherin、α-SMA、col1A2蛋白表达和Smad1磷酸化;显微镜下观察细胞形态.结果稳定表达持续活化型ALK3的HSC-T6细胞增殖受到抑制, Smad1磷酸化显著升高,α-SMA, col1A2表达下调, E-cadherin表达上调.结论 BMP-7信号转导通过增强Samd1的磷酸化而拮抗TGF-β1致纤维化作用,抑制大鼠HSCs的活化.     

沉默转化生长因子β1表达与抑制肾小管上皮细胞(HK-2)Notch信号通路的相关性研究

目的探讨沉默转化生长因子β1(TGF-β1)表达与抑制肾小管上皮(HK-2)细胞Notch信号通路的相关性。方法检测TGF-β1在DN的表达;TGF-β1小干扰RNA(TGF-β1-siRNA)和阴性对照(siRNA-NC)转染HK-2,空脂质体转染细胞为对照,检测各组TGF-β1;将HK-2分为低糖、高糖、siRNA-NC+高糖和TGF-β1-siRNA组+高糖组,检测细胞存活,凋亡及Cleaved caspase 3、Notch1和Hes1表达。结果 TGF-β1在DN表达高于正常肾组织(P0.05);TGF-β1-siRNA组TGF-β1表达低于对照组(P0.05);高糖组细胞存活低于低糖组,凋亡率、Cleaved caspase 3、Notch1和Hes1高于低糖组(P0.05),siRNA-NC+高糖组细胞存活、凋亡及Cleaved caspase 3、Notch1和Hes1表达与高糖组相当(P0.05);TGF-β1-siRNA+高糖组细胞存活高于高糖组,凋亡及Cleaved caspase 3、Notch1和Hes1低于高糖组(P0.05)。加入GSI细胞存活、凋亡及Cleaved caspase 3、Notch1和Hes1表达与沉默TGF-β1一致。结论 TGF-β1在DN高表达,高糖能抑制HK-2的存活,促进凋亡,沉默TGF-β1能减弱这种效果,可能与Notch信号通路调控有关。     

miR-33-5p对糖尿病肾脏疾病大鼠肾纤维化影响机制的研究

目的探讨miR-33-5p对DKD大鼠肾纤维化的影响机制。方法选取60只SD大鼠中未经任何处理的15只为正常对照(NC)组,其余45只建立DKD大鼠模型,造模成功后随机分为DKD模型组(DKD)、miR-33-5p拮抗剂组(miR-33-5p antagomir)及其阴性对照(antagomir-NC)组,每组各15只。antagomir-NC、miR-33-5p antagomir组尾静脉注射antagomir-NC或miR-33-5p antagomir,每周1次,持续12周。检测各组FPG、24 hUAlb、BUN和血肌酐(Scr)含量。Masson染色观察各组肾纤维化程度。qRT-PCR检测肾组织中miR-33-5p、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ)mRNA表达水平。Western blot检测肾组织中TGF-β1、Smad同源物3(Smad3)、Smad2、p-Smad3、p-Smad2、平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)等蛋白表达水平。结果与DKD组比较,miR-33-5p antagomir组肾脏间质胶原纤维减少,24 hUAlb、FPG、BUN、Scr含量降低[(36.22±2.41)vs(19.24±1.25)mg/24 h,(29.15±1.53)vs(14.25±1.76)mmol/L,(18.33±3.16)vs(13.73±0.68)mmol/L,(60.17±2.37)vs(39.42±1.74)μmol/L,P0.05],肾组织中miR-33-5p、CollagenⅠmRNA、CollagenⅢmRNA降低[(5.19±0.20)vs(1.88±0.27),(3.44±0.21)vs(1.28±0.08),(4.71±0.32)vs(2.06±0.12),P0.05],TGF-β1、p-Smad3/Smad3、p-Smad2/Smad2、α-SMA等蛋白表达水平降低(P0.05)。antagomir-NC、DKD组各指标比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结论抑制miR-33-5p表达可改善DKD大鼠肾纤维化,其作用机制可能与阻断TGF-β/Smad信号通路有关。     

去甲斑蝥素不依赖钙调蛋白磷酸酶信号通路抑制高糖刺激肾小管上皮细胞细胞外基质的表达

目的:在证实去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)能减轻糖尿病肾病(DN)大鼠肾间质纤维化和抑制高糖刺激的肾小管上皮细胞细胞外基质表达的基础上,观察NCTD对高糖刺激的肾小管上皮细胞钙调蛋白磷酸酶(calcineurin,CaN)通路的影响,探讨NCTD抗DN肾小管间质纤维化与其抑制CaN的关系。方法:常规培养人肾小管上皮细胞(HK-2),转染CaN siRNA,细胞分五组:(1)正常糖组(D-glucose5.5mmol/L);(2)高糖组(HG,D-glucose30mmol/L);(3)高糖+CaN siRNA组;(4)高糖+CaN siRNA+NCTD(5mg/L)组;(5)高糖+NCTD(5mg/L)组。采用Western-blot、免疫荧光和实时定量PCR,观察NCDT对HK-2细胞CaN/NFAT通路的影响,明确CaN siRNA的干扰效果。采用Western blot,检测NCTD对转染CaN siRNA后的HK-2细胞纤维连接蛋白(FN),胶原蛋白IV(Collagen IV,Col IV)及转化生长因子β1(TGF-β1)蛋白表达的影响。结果:高糖可促进HK-2细胞CaNmRNA及蛋白的表达,NCTD可在基因及蛋白水平抑制CaN的表达(P0.05)。免疫荧光发现CaN下游活化T细胞核因子(NFATc)在正常对照组中存在于胞质,高糖刺激后细胞核内开始表达,高糖刺激30min后发生明显的核转位,NCTD能在一定程度上抑制核转位的发生,并能减少高糖刺激后核内NFATc蛋白的表达。转染CaN siRNA后,高糖刺激后HK-2细胞中CaN mRNA以及蛋白表达均降低,而FN,Col IV以及TGF-β1蛋白水平表达都明显增强(P0.05)。NCTD可抑制转染CaN siRNA后高糖刺激的HK-2细胞FN,Col IV和TGF-β1的表达。结论:NCTD能下调肾小管上皮细胞CaN表达,阻断CaN/NFATc信号通路;但NCTD抑制高糖刺激后肾小管上皮细胞细胞外基质的表达,与其阻断CaN/NFATc信号通路无关。     

miR-206-3p通过LXRα调控糖尿病心肌病心肌细胞凋亡的研究

目的:探究微RNA(miR)-206-3p是否通过调控肝X受体α基因(LXRα)发挥高糖情况下的促心肌细胞凋亡作用。方法:根据不同培养基培养以及是否加LXRα激动剂GW3965将H9C2心肌细胞分为:低糖对照组(5.5mmol/L低糖完全培养基培养)、HM组(加甘露醇的33mmol/L高渗低糖完全培养基培养)、HG组(33mmol/L高糖完全培养基培养)、HG+GW3965-1μM组(HG组加1μmol/L GW3965激动剂)。构建miR-206-3p激活及抑制模型后,根据处理方案分为:低糖对照组(转染miR-inhibitor NC质粒+5.5mmol/L低糖培养基)、HG组(转染miR-inhibitor NC质粒+33mmol/L高糖培养基)、HG+inhibitor组(转染miR-206-3p inhibitor质粒+33mmol/L高糖培养基)。比较各组间心肌细胞凋亡情况、miR-206-3p和LXRα蛋白质相对表达水平,验证miR-206-3p对LXRα的靶向关系。结果:HG组心肌细胞miR-206-3p表达量显著高于低糖对照组[(6.775±0.615)比(0.976±0.781),P=0.001],HG+miR-206-3p inhibitor组凋亡细胞水平显著低于HG组[(0.059±0.001)比(0.123±0.074),P=0.001];双荧光素酶活性实验证实miR-206-3p同LXRα相结合。激活LXRα可减少高糖导致的心肌细胞凋亡。结论:高糖情况下miR-206-3p表达显著升高并通过靶向下调LXRα促进了高糖介导的心肌细胞凋亡。     

SB431542对高糖环境中小鼠足细胞Cdk5/p35表达的影响

目的应用SB431542及Roscovitine处理高糖培养的足细胞,观察抑制转化生长因子(TGF)-β1通路对高糖培养足细胞中Cdk5/p35表达的影响及抑制Cdk5激酶活性对高糖和TGF-β1诱导足细胞凋亡的影响。方法采用不同浓度SB431542(0.1,1.0,10μmol/L)处理高糖培养的足细胞,Western印迹法及RT-PCR技术检测各处理组Cdk5及p35蛋白和mRNA的表达变化情况。应用流式细胞术检测Roscovitine对高糖及TGF-β1刺激足细胞凋亡的影响。结果高糖(HG组)Cdk5和p35的蛋白及mRNA表达水平明显增高,显著高于正常血糖组(NG)组和甘露醇组(M组)(P0.05),并且呈时间依赖性升高。加入SB431542后,高糖培养导致的足细胞内Smad-2蛋白磷酸化水平明显降低。同时,HG+SB431542组足细胞内Cdk5和p35的蛋白及mRNA表达水平呈浓度依赖性显著降低,明显低于HG组(P0.05)。加入Roscovitine后,高糖及TGF-β1诱导足细胞的足细胞凋亡水平显著下降(P0.05)。结论高糖可能通过活化TGF-β1通路上调Cdk5/p35表达从而诱导足细胞凋亡。     

长链非编码生长停滞特异性蛋白6反义RNA1靶向miRNA-374a-3p调控高糖诱导的人肾小管上皮细胞损伤及纤维化分子机制的研究

目的 探讨长链非编码生长停滞特异性蛋白6反义RNA1(LncRNA DLX6-AS1)对高糖诱导的人肾小管上皮细胞HK-2损伤及纤维化的影响及其可能作用机制。方法 高糖诱导HK-2细胞建立细胞损伤模型，实验分为正常对照（Con）组、高糖组（HG）、LncRNA DLX6-AS1小分子干扰RNA阴性对照（si-NC）+HG组（si-NC+HG组）、LncRNA DLX6-AS1小分子干扰RNA(si-LncRNA DLX6-AS1)+HG组（si-LncRNA DLX6-AS1+HG组）、miR-374a-3p寡核苷酸模拟物阴性对照mimic NC序列（miR-NC）+HG组（miR-NC+HG组）、miR-374a-3p寡核苷酸模拟物（miR-374a-3p mimics）+HG组（miR-374a-3p+HG组）、miR-374a-3p特异性寡核苷酸抑制剂阴性对照（anti-miR-NC）+si-LncRNA DLX6-AS1+HG组（anti-miR-NC+si-LncRNA DLX6-AS1+HG组）、miR-374a-3p特异性寡核苷酸抑制剂（anti-miR-374a-3p）...     

miR-21对肝星状细胞的增殖和成纤维化的影响

目的研究miR-21对肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)的增殖和成纤维化的影响。方法将大鼠HSC-T6传代分为四组,分别为正常组、酒精组、miR-21模拟物组、miR-21抑制剂组。其中正常组不做处理;miR-21模拟物组和miR-21抑制剂组分别将miR-21模拟物和miR-21抑制剂瞬时转染入细胞;然后,再用含有酒精的培养基诱导酒精组、miR-21模拟物组、miR-21抑制剂组的HSC的活化;48 h后,分别做两部分实验,一部分是细胞增殖测试实验(cell counting kit-8,CCK8);另一部分是提取各组细胞蛋白,Western blotting检测因子增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)、Smad3、平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscles actin,α-SMA)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的表达变化。结果CCK8结果显示,miR-21模拟物能够促进HSC的增殖与活化,从而促进纤维化的进展;而miR-21抑制剂能够抑制HSC的活化,降低HSC的活力值,缓解纤维化的进展。Western blotting检测结果显示,PCNA、TGF-β1、Smad3、α-SMA、CTGF在酒精组的表达量明显比正常组高(P<0.05),而在miR-21模拟物组则比酒精组高(P<0.05),miR-21抑制剂组比酒精组明显降低(P<0.05)。结论miR-21能够促进HSC的增殖,促进HSC成纤维化的进展。     

低密度脂蛋白诱导大鼠肾小管上皮细胞转分化的作用机制研究

目的探讨低密度脂蛋白(LDL)对大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)转分化的影响及其作用机制。方法将体外培养的NRK-52E细胞分为4组:正常对照组、洛伐他汀(Lov,1μmol/L)组、LDL(250 mg/L)刺激组、LDL(250mg/L)+Lov(1μmol/L)组。应用倒置显微镜观察细胞形态学改变;RT-PCR检测NRK-52E细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad2、Smad3和整合素链接酶(ILK)mRNA表达;West-ern blot检测α-SMA、E-cadherin及磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)蛋白表达;ELISA检测上清液TGF-β1。结果加入LDL培养24 h后,NRK-52E细胞由立方形或多角形变为长梭形,α-SMA、TGF-β1、Smad2、Smad3和ILK mRNA的表达上调,E-cadherin mRNA的表达下调,与对照组比较差异均有统计学意义(P0.01);α-SMA和p-Smad2/3蛋白表达量显著高于对照组(P0.01),E-cadherin蛋白表达量显著低于对照组(P0.01);细胞上清液TGF-β1浓度显著高于对照组(P0.01)。LDL+Lov组与LDL组比较,NRK-52E细胞α-SMA、TGF-β1、Smad2、Smad3、ILK mRNA的表达及α-SMA、p-Smad2/3的蛋白表达均明显降低,E-cadherin mRNA和蛋白表达明显增强。结论LDL可诱导肾小管上皮细胞转分化,其机制可能是激活TGF-β1/Smads/ILK信号通路,而Lov能部分阻断LDL诱导的小管上皮细胞转分化。     

PAI-1引起2型糖尿病合并NAFLD小鼠肝脏炎性反应和纤维化的机制研究

目的探讨纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)对2型糖尿病(T2DM)合并非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)小鼠肝脏脂质沉积,炎性反应,纤维化等的影响。方法以C57BL/KSJ-Lepdb雄性小鼠作为T2DM合并NAFLD组(db/db组),同周龄C57BKS db/m雄性小鼠作为对照组(db/m组)。采用苏木素-伊红染色,油红О染色等方法检测小鼠肝组织切片脂质沉积;采用ELISA检测肝组织甘油三酯含量。以小鼠正常肝细胞NCTC1469作为研究对象,分为5组:对照组给予25 mmol/L葡萄糖(NG组)高渗对照组给予25 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇(HMA组)、高糖高脂组给予50mmol/L葡萄糖+0.75 mmol/L棕榈酸(HG+PA组)、高糖高脂+RNA干扰对照组(HG+PA+Si-NC组)用NC siRNA瞬时转染细胞并给予高糖高脂干预,高糖高脂+PAI-1沉默组(HG+PA+Si-PAI-1组)用PAI-1的siRNA瞬时转染细胞并给予高糖高脂干预。采用实时定量PCR和Western印迹方法检测炎性因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素-1β(IL-1β),肝纤维化相关指标转化生长因子-B(TGF-3),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(Col I)以及PAI-1的表达情况。结果与db/m组相比,db/db组小鼠肝组织中出现明显脂质聚集和纤维组织增生,甘油三酯含量增加,且MCP-1,IL-1β、TGF-β,a-SMA,ColⅠ和PAI-1的mRNA和蛋白水平均明显上调(均P<0.05)。与NC组细胞相比,HG+PA组MCP-1、IL-1β、TGF-β、α-SMA、Col Ⅰ、PAI-1表达量均明显上调(均P<0.05);与HG+PA组相比,HG+PA+si-PAI-1组PAI-1、MCP-1、IL-β、TGF-β、α-SMA和ColⅠ等表达量均明显下调(均P<0.05)。结论T2DM合并NAFLD小鼠模型肝组织中PAl-1表达明显增加,抑制PAI-1表达可明显改善肝组织炎性反应和纤维化水平。     

全反式维甲酸对转化生长因子诱导的肾小球系膜细胞环氧化酶2表达的影响

目的:研究仝反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)对转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)刺激系膜细胞环氧化酶2(COX-2)及Smad3,Smad7蛋白表达的影响,探讨ATRA在TGF-β/Smad信号通路中对系膜细胞表达COX-2的影响作用. 方法:取培养第4代的大鼠肾小球系膜细胞分组:(1)对照组;(2)TGF-β刺激组(5、10 ng/ml);(3)TGF-β+NS398[COX-2抑制剂组(10 μmol/L NS398+10 ng/m 1TGF-β)];(4)TGF-β+Staurosporine(Smad抑制剂)组(5 nmol/ml Staurosporine+10 ng/ml TGF-β);(5)药物组:ATRA(10~(-3)、10~(-6)、10~(-9)moL/L)组,在不同的作用时间(4h,12h,24h),Western Blot印迹法测定各组COX-2、Smad3、Smad7蛋白的表达变化. 结果:(1)在外源性TGF-β刺激下,COX-2、Smad3、Smad7蛋白的表达明显增加,各组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).(2)加入COX-2抑制剂NS-398和Smad抑制剂Staurosporine后,COX-2、Smad3、Smad7表达均减少,与TGF-β组比较,差异有统计学意义(P<0.05).(3)ATRA各浓度组和TGF-β组比较COX-2、Smad3、Smad 7蛋白的表达明显减少(P<0.05),呈时间和浓度依赖性.(4)COX-2蛋白的表达与Smad3、Smad7蛋白的表达均呈显著正相关(r=0.978,r=0.942,P<0.05). 结论:ATRA可能通过TGF-β/Smad信号通路抑制系膜细胞COX-2的表达,显示其具有良好的抗纤维化和抗细胞增殖作用.     

miR-133a-3p重组腺相关病毒的构建及抑制LX-2细胞α-SMA基因表达

目的构建miR-133a-3p重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)过表达载体并转染肝星状细胞,鉴定其转染及干预作用。方法体外培养肝星状细胞株LX-2细胞,试验分为DMEM对照组,AAV8-Scrambled对照组,AAV8-miR-133a-3p组,应用qRT-PCR法检测miR-133a-3p转染表达量,检测胶原蛋白(COL1A1)、-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)和TGF-β/Smad信号通路基因的表达量。结果重组腺相关病毒成功构建并转染LX-2细胞,AAV8-miR-133a-3p转染LX-2细胞组的miR-133a-3p相对表达量为11 000±343.10,与DMEM对照组比较差异有统计学意义(t=32.07,P0.01)。AAV8-miR-133a-3p转染组与DMEM组α-SMA mRNA的相对表达量分别为0.42±0.06 vs 1.00±0.09(t=5.72,P0.05),COL1A1 mRNA的相对表达量为0.34±0.03 vs 1.00±0.04(t=12.66,P0.01)。结论重组腺相关病毒成功转染LX-2细胞,且能抑制肝星状细胞纤维化标志物α-SMA的表达,为探讨miR-133a-3p在调控肝星状细胞所致纤维化中的作用奠定了理论基础。     

微小RNA-182通过靶基因Rac1调控高糖诱导的心肌细胞肥大

目的 探讨微小RNA(miR)-182调控高糖诱导的心肌细胞肥大的机制.方法 利用生物信息学方法预测调控Ras相关的C3肉毒素底物1(Rac1)的候选miR.在糖尿病组小鼠(db/db小鼠)和对照组小鼠(db/m小鼠)心肌组织中验证所有候选miR的表达,并分别与Rac1 mRNA做Pearson相关性分析.体外实验,将原代培养的乳鼠心肌细胞分为对照组(葡萄糖浓5 mmol/L)和高糖组(葡萄糖浓度33 mmol/L,HG组).光镜下观察各组乳鼠心肌细胞的形态学变化.采用实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测两组乳鼠心肌细胞中miR-182和Rac1 mRNA表达水平.再将原代乳鼠心肌细胞分为4组,分别为正常糖组(葡萄糖浓度5 mmol/L,对照组)、高糖组(葡萄糖浓度33mmol/L,HG组)、正常糖+miR-182模拟物组(miR-182组)和高糖+miR-182模拟物组(HG+ miR-182组).采用Lipofectamine2000转染miR-182模拟物(终浓度为100 nmol/L).分别采用RT-PCR和蛋白免疫印迹法检测乳鼠心肌细胞中Rac1、β-肌球蛋白重链(β-MHC)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA和蛋白表达水平.结果 生物信息学方法预测到参与调控Rac1的候选miR共6个,分别为miR-182、miR-142-3p、miR-140、miR-101a、miR-429和miR-200b.糖尿病组小鼠心肌组织中miR-182和miR-142-3pmRNA表达水平均明显低于对照组(P均＜0.05),且miR-182、miR-142-3p mRNA均与Rac1 mRNA表达水平呈负相关(相关系数分别为r=-0.89102,r=-0.837 19),miR-182与Rac1负相关性最为显著.体外实验结果显示HG组乳鼠心肌细胞中miR-182 mRNA表达水平明显低于对照组(P＜0.05),Rac1 mRNA表达水平则明显高于对照组(P＜0.05);光镜下观察HG+ miR-182组乳鼠心肌细胞肥大程度轻于HG组;HG+ miR-182组乳鼠心肌细胞Rac1和β-MHC mRNA及蛋白表达水平均明显高于HG组(P均＜0.05).结论 miR-182可能通过其靶基因Rac1对高糖诱导的心肌细胞肥大进行调控.     

miR-7-5p调控NF-κB/RelA信号通路对Ⅱ型肺泡上皮细胞间质转化的作用机制研究

目的探讨miR-7-5p对Ⅱ型肺泡上皮细胞(A549细胞)间质转化的影响及其作用机制。方法10 ng/mL TGF-β1处理A549细胞12 h、24 h和48h后,利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)检测细胞中miR-7-5p和RelA的表达量,Western blot检测EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达量;过表达或下调miR-7-5p后,Transwell实验检测miR-7-5p对A549细胞侵袭的影响;细胞划痕愈合实验检测miR-7-5p对A549细胞迁移的影响;Western blot检测miR-7-5p对A549细胞内E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表达和NF-κB通路的影响;TargetScan预测miR-7-5p和RelA的靶向关系,双荧光素酶报告基因实验分析miR-7-5p和RelA之间的关系;RT-qPCR和Western blot检测过表达或下调miR-7-5p对RelA的影响。检测下调RelA表达后,A549细胞的侵袭、迁移和EMT能力。结果10 ng/mL TGF-β1处理A549细胞12 h、24 h和48h后,E-cadherin表达明显下调(P<0.01),N-cadherin和Vimentin表达明显上调(P<0.01),miR-7-5p表达明显降低(P<0.01),RelA表达明显升高(P<0.01)。过表达miR-7-5p抑制了A549细胞侵袭、迁移与EMT,p-TAK1/TAK1和NF-κB p-p65/NF-κB p65比值明显降低,下调miR-7-5p则起到促进作用;miR-7-5p靶向且负调控RelA表达;下调RelA抑制了A549细胞侵袭、迁移与EMT。结论miR-7-5p调控NF-κB/RelA信号通路促进A549细胞的上皮间质转化。