冈田酸诱导大鼠海马神经元Tau 蛋白过度磷酸化

目的研究蛋白磷酸酯酶抑制剂冈田酸(OA)对海马神经元微管相关蛋白(Tau)磷酸化的影响,建立Tau过度磷酸化的大鼠模型。方法实验随机分为正常组、二甲基亚砜(DMSO)对照组、OA模型组。模型组又分为OA12h、24h、48h和2周组。OA模型组大鼠海马CA1区背侧定向注射1.5μl溶于10%DMSO的OA,DMSO对照组注射1.5μl10%DMSO溶液。通过Bielschowski染色、免疫组织化学染色、蛋白免疫印迹分别观察海马神经元形态的改变和磷酸化Tau的表达水平;检测蛋白磷酸酶2A(PP2A)的活性,了解其动态变化与Tau磷酸化的关系。结果OA模型各组与正常组和DMSO对照组比较,Bielschowski染色示海马神经元胞体和突起着色较深,欠均匀,部分神经元轴丘处浓染成斑块状,但各模型组均未见到老年斑和神经元纤维缠结样改变;免疫组织化学染色示模型组海马神经元Thr231和Ser199202磷酸化Tau蛋白表达增加,与DMSO对照组相比具有显著意义(P<0.05);蛋白免疫印迹提示OA可引起Tau蛋白Thr231、Ser396和Ser199/202位点发生磷酸化,且不同位点磷酸化的稳定性不同,注射OA48h后PP2A的活性明显降低,其变化与Tau蛋白Thr231和Ser396位点的磷酸化改变相一致。结论海马CA1区背侧单次注射OA可诱导建立神经元Tau蛋白过度磷酸化的大鼠模型。     

糖尿病大鼠海马组织内Tau蛋白磷酸化水平和糖原合成激酶-3β活性增高

目的研究1型及2型糖尿病对海马组织内Tau蛋白部分位点磷酸化水平的影响,并探讨其作用机制。方法同月龄Wistar大鼠,分为对照组(CTL)、1型(T1DM)及2型(T2DM)糖尿病模型组。葡萄糖氧化酶法检测血糖,放免法检测血浆胰岛素,Western blot分析海马内总Tau以及Tau蛋白上部分位点(pSer199、pThr212、pSer214、pSer396及pSer422)的磷酸化水平。γ32P标记的ATP和特异性底物肽检测海马内胰岛素信号传导系统中的关键酶糖原合成激酶-3β(GSK-3β)活性。结果T1DM及T2DM组血糖水平显著高于CTL组(P<0.001);T2DM组血浆胰岛素水平显著高于CTL组(P<0.001),而T1DM组显著低于CTL组(P<0.01);T2DM组胰岛素抵抗指数显著高于T1DM及CTL组(P<0.001)。T1DM及T2DM组大鼠海马组织内总Tau蛋白水平与CTL比较无显著差异,但阿尔茨海默病相关的Tau蛋白磷酸化位点pS199、pT212及pS396在T1DM及T2DM组都呈现过度磷酸化状态。同时,GSK-3β活性在这两种糖尿病大鼠模型的海马组织内明显增高(P<0.01,P<0.001)。结论糖尿病大鼠海马组织内Tau蛋白部分位点磷酸化水平增高。胰岛素信号系统功能低下而导致传导途径中GSK-3β活性上调,这可能是引起大鼠海马内Tau蛋白磷酸化的一个主要原因。     

SH—SY5Y细胞高表达糖原合成激酶3β对tau蛋白磷酸化和微管稳定性的影响术

目的：构建高表达糖原合成激酶3β（GSK3β）的SH—SY5Y（人骨髓神经母细胞瘤细胞）转基因细胞模型，观察GSK3β高表达对宿主细胞tau蛋白磷酸化、微管稳定性的影响。方法：构建GSK3β真核表达质粒，转染SH—SY5Y细胞，使GSK3β在SH—SY5Y细胞中得到高表达，应用蛋白免疫印迹方法，观察tau蛋白磷酸化、总tau蛋白、微管蛋白乙酰化水平的变化情况。结果：GSK3β真核表达质粒转染SH—SY5Y细胞36h后，GSK3β在SH—SY5Y细胞中的表达达到高峰，tau蛋白Ser^199/202、Thr^231、Thr^205等位点的磷酸化水平在转染后48h达到高峰；tau蛋白总量未有明显变化。转染后60h，微管蛋白乙酰化水平明显减低。结论：高表达GSK313的SH—SY5Y细胞可使tau蛋白的磷酸化水平增高，从而降低tau蛋白结合和稳定微管蛋白的能力，导致微管蛋白乙酰化水平明显减低。     

SH-SY5Y细胞高表达糖原合成激酶3β对tau蛋白磷酸化和微管稳定性的影响

目的：构建高表达糖原合成激酶3β（GSK3β）的SH-SY5Y（人骨髓神经母细胞瘤细胞）转基因细胞模型,观察GSK3β高表达对宿主细胞tau蛋白磷酸化、微管稳定性的影响。 方法：构建GSK3β真核表达质粒,转染SH-SY5Y细胞,使GSK3β在SH-SY5Y细胞中得到高表达,应用蛋白免疫印迹方法,观察tau蛋白磷酸化、总tau蛋白、微管蛋白乙酰化水平的变化情况。 结果：GSK3β真核表达质粒转染SH-SY5Y细胞36 h后,GSK3β在SH-SY5Y细胞中的表达达到高峰,tau蛋白Ser199/202、Thr231、Thr205等位点的磷酸化水平在转染后48 h达到高峰; tau蛋白总量未有明显变化。转染后60 h,微管蛋白乙酰化水平明显减低。 结论：高表达GSK3β的SH-SY5Y细胞可使tau蛋白的磷酸化水平增高,从而降低tau蛋白结合和稳定微管蛋白的能力,导致微管蛋白乙酰化水平明显减低。     

金雀异黄酮对去卵巢后不同时间大鼠抗氧化作用的影响

目的研究雌激素剥夺后大鼠血清抗氧化作用的变化及金雀异黄酮(Gs)的治疗作用,探讨使用Gs进行雌激素替代治疗的可行性和最佳时间点。方法40只3月龄健康雌性SD大随机分为去卵巢对照组(OVX)、假手术组(sham)、金雀异黄酮组(Gs组)及苯甲酸雌二醇组(EB组),给予相应的手术和药物替代治疗。在术后第1、2、4、6周检测和分析血清超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的水平。结果术后第1～2周,各组大鼠血清SOD和MDA都逐渐上升,至第2周时达高峰,以后sham组、Gs组及EB组逐渐恢复到术后第1周水平,且各组之间均无显著性差异。但OVX组血清SOD活性持续下降,至术后第6周显著低于其它组(P<0.05);MDA值不断升高,在术后第4周(P<0.01)和第6周(P<0.05)都显著高于其它组。结论去卵巢2周后大鼠血清SOD活性逐步降低,氧化损伤程度不断增高;Gs具有与EB相似的抗氧化作用,可用于更年期后女性氧化损伤相关疾病的防治;雌激素替代疗法宜及早进行。     

人参皂苷Rg1通过调节GSK-3β/PP2A活性减轻皮层神经元Tau蛋白过度磷酸化

目的 探讨人参皂苷Rg1是否通过调节GSK-3β/PP2A活性而减轻凝聚态Aβ25～35诱导的胎鼠皮层神经元Tau蛋白过度磷酸化.方法 选用孕期(18±2)d的SD大鼠,分离纯化胎鼠皮层神经元.实验分为阴性对照组、模型组、LiCl处理组、Rg1预处理组.阴性对照组不加任何处理因素;模型组用20μmol/L Aβ25～35作用于皮层神经元12h;LiCl处理组用10mmol/L LiCl和20μmol/L Aβ25～35共同作用于皮层神经元12h;Rg1预处理组分别用5、10、20、40、80μmol/L Rg1预处理皮层神经元24h,再加入20μmol/L Aβ25～35作用12h.通过免疫印迹法和免疫细胞化学染色法检测皮层神经元Tau蛋白磷酸化水平、总Tau蛋白水平和糖原合成酶3β(GSK-3β)表达水平,通过非放射性免疫法检测皮层神经元蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)活性.结果 模型组Tau蛋白在Ser396、Ser199/202和Thr231位点的磷酸化水平、总Tau蛋白水平和GSK-3β的蛋白表达水平均增加,但PP2A的活性不受影响;LiCl处理组和Rg1预处理组,Tau蛋白在Ser396、Ser199/202和Thr231位点的磷酸化水平、总Tau蛋白水平和GSK-3β的蛋白表达水平均降低(P＜0.05).在Rg1预处理组中,以20μmol/L Rg1预处理后Tau蛋白磷酸化水平、总Tau蛋白水平和GSK-3β的表达水平下降最为明显,而且PP2A的活性明显增强(P＜0.01).结论 人参皂苷Rg1可通过上调PP2A活性和下调GSK-3β活性从而减轻凝聚态Aβ25～35所诱导的皮层神经元Tau蛋白过度磷酸化.     

金雀异黄酮对去卵巢大鼠脑抗氧化作用的影响

目的研究金雀异黄酮对去卵巢大鼠大脑抗氧化作用的影响,为使用植物雌激素防治女性更年期后老年性痴呆提供依据。方法40只3月龄雌性SD大鼠,随机分为假手术组、去卵巢对照组、金雀异黄酮组和苯甲酸雌二醇组,给予相应手术和治疗。术后6周分析大鼠额叶、颞叶、海马和基底前脑的SOD和MDA值。结果假手术组颞叶和海马的SOD值低于基底前脑(P<0.05);额叶和颞叶的MDA值高于海马和基底前脑(P<0.05);去卵巢对照组基底前脑的SOD值显著低于假手术组、金雀异黄酮组和苯甲酸雌二醇组(P<0.05),MDA值显著高于假手术组、金雀异黄酮组和苯甲酸雌二醇组(P<0.05);假手术组、金雀异黄酮组及苯甲酸雌二醇组之间SOD值和MDA值差异无统计学意义(P>0.05)。结论去卵巢对照组大鼠基底前脑抗氧化能力显著降低,氧化损伤程度显著升高,金雀异黄酮替代治疗可增加去卵巢大鼠基底前脑的抗氧化能力,降低基底前脑的氧化损伤,可用于女性更年期后老年性痴呆的防治。     

神经生长因子预处理阿尔茨海默病大鼠海马神经原磷酸化Tau蛋白的变化

背景：神经生长因子能够促进胆碱能神经元的分化,决定轴突的生长,并可参与损伤神经的再生和功能修复。 目的：进一步验证神经生长因子预处理对拟阿尔茨海默病模型大鼠脑内神经原纤维缠结和磷酸化Tau蛋白表达的影响。 方法：将3-5月龄雄性Wistar大鼠随机分为3组：模型组将冈田酸微量注射至拟大鼠海马CA1区建立拟阿尔茨海默病大鼠模型;预处理组于造模前将神经生长因子注射至侧脑室;对照组用同样方法注入等体积的二甲亚砜作为对照。通过Morris水迷宫观察上述大鼠的行为学变化,分别用改进的Bielschowsky染色观察海马CA1区神经原纤维缠结,用免疫组织化学和免疫印迹法观察海马区磷酸化Tau蛋白表达的变化。 结果与结论：拟阿尔茨海默病模型组大鼠出现认知、学习记忆能力减退;与对照组比较,模型组海马CA1区出现较多神经原纤维缠结, 而且磷酸化的Tau蛋白表达增多;神经生长因子预处理组大鼠的上述症状明显改善。提示神经生长因子预处理可以显著改善拟阿尔茨海默病模型大鼠的学习记忆能力,抑制神经原纤维缠结的形成,减少磷酸化Tau蛋白的表达。     

Tau蛋白过度磷酸化诱导Aβ生成抑制THP-1细胞ABCA1的表达

目的：探讨过度磷酸化Tau蛋白在动脉粥样硬化发生中的作用及其可能机制。方法：体外培养人单核细胞系THP-1,经佛波酯诱导分化为巨噬细胞,建立人盐洗血小板与THP-1（人单核细胞）源性巨噬细胞共孵育生成泡沫细胞的体外模型。免疫细胞化学法检测过磷酸化Tau蛋白和β淀粉样蛋白的生成。用岗田酸（OA）诱导其Tau蛋白过磷酸化,Western blot观察Tau蛋白T231和S396两个位点磷酸化程度及β淀粉样蛋白水平,RT-PCR法检测三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）mRNA表达水平。结果：OA引起Tau蛋白剂量依赖的过度磷酸化,并增加β淀粉样蛋白的生成,同时下调ABCA1 mRNA水平的表达（P〈0．05）。结论：Tau蛋白过度磷酸化诱导β淀粉样蛋白的生成并下调ABCA1 mRNA水平的表达,可能是动脉粥样硬化斑块形成和发展的机制之一。     

氯胺酮上调GSK-3β活性加重Aβ25-35诱导的大鼠PC12细胞Tau蛋白过度磷酸化

目的 探讨氯胺酮对凝聚态Aβ<,25-35>诱导的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)Tau蛋白过度磷酸化的影响及可能作用的机制.方法 将培养的PC12细胞随机分为对照组(C)、10 μmol/L Aβ<,25-35>(A组)、1 mmol/L氯胺酮(K组)、氯胺酮和Aβ<,25-35>(AK组),作用时间均为6 h....     

Tau antigenic changes induced by glutamate in rat primary culture model: A biochemical approach

Primary neuronal cultures were treated with glutamate to induce an increase of Tau immunoreactivity similar to that observed in Alzheimer's disease. The Tau profile of neurones in culture before and after exposure to glutamate was analyzed on immunoblots with anti-Tau, anti-paired helical filaments (PHF) and antibody specific for modified Tau. Differences were observed between treated and control cultures: glutamate induced a shift of immunodetection from the lowest to the highest molecular weight Tau isoform and an acidification of Tau proteins. However, these modifications are not exactly those observed in Alzheimer's disease since we were not able to detect ‘Alzheimer-type’ epitopes on Tau proteins after the glutamate exposure.     

14-3-3ζ Facilitates GSK3β-catalyzed tau phosphorylation in HEK-293 cells by a mechanism that requires phosphorylation of GSK3β on Ser

Hyperphosphorylated tau is the prominent component of paired helical filaments, which are the major component of neurofibrillary tangles associated with Alzheimer's disease (AD). Glycogen synthase kinase 3β (GSK3β) is implicated to phosphorylate tau in normal and AD brain. Previously, we isolated a large multiprotein complex containing tau, Ser⁹-phosphorylated GSK3β and 14-3-3ζ from bovine brain microtubules. We showed that within the complex, 14-3-3ζ binds to tau and GSK3β and mediates GSK3β-catalyzed tau phosphorylation. A recent report however indicated that 14-3-3ζ does not bind to tau or GSK3β and does not increase tau phosphorylation by GSK3β in cell models [T.A. Matthews, G.V.W. Johnson, Neurosci. Lett. 384 (2005) 211–216]. In the current study we have thoroughly analyzed the binding of 14-3-3ζ with tau and GSK3β and evaluated the effect of 14-3-3ζ on tau phosphorylation by GSK3β in HEK-293 cells. We found that 14-3-3ζ binds to tau and Ser⁹-phosphorylated GSK3β. Nonphosphorylated GSK3β phosphorylates tau without being influenced by 14-3-3ζ. Ser⁹-phosphorylated GSK3β on the other hand phosphorylates tau significantly only in the presence of 14-3-3ζ. Our data demonstrate that 14-3-3ζ mediates tau phosphorylation by Ser⁹-phosphorylated GSK3β in HEK-293 cells.     

电磁场生物效应的细胞膜及蛋白激酶信号转导机制研究

环境中低强度的电磁场通常通过细胞膜将物理信号转化成生物信号,进而经细胞内信号 转导途径,尤其是蛋白激酶相关途径进行传递,最终产生生物效应的模式是可能的作用机制,也是目前 生物电磁学研究的热点之一。本文就电磁场与细胞膜及蛋白激酶相关的信号转导的研究作了综述。     

Differential modulation of pharmacologically distinct components of Ca2+ currents by protein kinase C activators and phosphatase inhibitors in nerve-growth-factor-differentiated rat pheochromocytoma (PC12) cells

We have studied the effects of protein kinase C (PKC) activators 4-phorbol 12-myristate 13-acetate (4-PMA) and 1-oleoyl-2-acetylglycerol (OAG) and of phosphatase inhibitors (okadaic acid and calyculin A) on voltage-activated Ca²⁺ and K⁺ channels in nerve growth factor-(NGF)-differentiated pheochromocytoma (PC12) cells. Whole-cell Ba²⁺ and K⁺ currents were recorded at room temperature with the patch-clamp technique. By using -conotoxin (CgTX) and isradipine, two specific Ca²⁺ channel blockers, we found three types of Ba²⁺ currents (I _Ba): (1) a -CgTX-sensitive I _Ba; (2) an isradipine-sensitive I _Ba; and (3) a -CgTX plus isradipine-resistant I _Ba. The external application of 4 -PMA or OAG down-modulated the isradipine-sensitive I _Ba whereas the two other I _Ba were not affected. 4-PMA-induced inhibition of I _Ba was prevented by staurosporine (a protein kinase inhibitor) and PKC (19–31) (a specific PKC inhibitor). The delayed rectifier K⁺ current (I _K) was unaffected by PKC activators. Both okadaic acid and calyculin A affected the components of the I _Ba in different manners. The presence of okadaic acid decreased the isradipine-sensitive I _Ba more than the -CgTX-sensitive I _Ba. The -CgTX plus isradipine-resistant I _Ba was not affected. Calyculin A down-modulated all three components of I _Ba to a similar degree. Our results suggest a differential modulation of voltage-activated Ca²⁺ and K⁺ channels by the PKC signalling pathway in NGF-differentiated PC12 cells.     

EGF和bFGF诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化后对Tau和神经元特异性烯醇化酶表达的影响

目的：观察表皮细胞生长因子（BGF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）体外诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为神经细胞后,神经元微管相关蛋白Tau和神经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达。方法：取P4代MSCs分为EGF、bFGF和EGF＋bFGF及对照组;免疫细胞化学法检测Tau蛋白和NSE表达,ELISA法分析各组细胞Tau蛋白含量。结果：免疫细胞化学检测显示EGF＋bFGF811Tau蛋白和神经元特异性烯醇化酶NSE阳性细胞率最高,bFGF组、EGF组和对照组依序递减;各组Tau蛋白含量结果与Tau蛋白阳性细胞率一致。结论：EGF和bFGF均可促进MSCs向神经细胞分化,并表达Tau蛋白和NSE,二者具有协同作用。     

Sildenafil ameliorates cognitive deficits and tau pathology in a senescence-accelerated mouse model

Aging is associated with a deterioration of cognitive performance and with increased risk of neurodegenerative disorders. In the present study we tested whether the specific phosphodiesterase 5 inhibitor sildenafil could ameliorate the age-dependent cognitive impairments shown by the senescence-accelerated mouse prone-8 (SAMP8). Sildenafil administration (7.5 mg/kg for 4 weeks) to 5-month-old SAMP8 mice attenuated spatial learning and memory impairments shown by these mice in the Morris Water Maze. Tau hyperphosphorylation (AT8 but not PHF-1 epitope) shown by SAMP8 mice at this age was also decreased in the hippocampus of sildenafil-treated mice, an effect probably related to a decrease in cyclin-dependent kinase 5 protein expression and activity (p25/p35 ratio). Interestingly, sildenafil also phosphorylated Akt, which was associated with an increase of glycogen synthase kinase-3β phosphorylation, providing a plausible explanation for the reductions in tau hyperphosphorylation (AT8 and PHF-1 epitopes) and attenuation of cognitive deficits shown by 9-month-old SAMP8 mice. Overall, sildenafil might be beneficial in age-related brain dysfunction and could be an emerging candidate for the treatment of other neurodegenerative diseases.     

Effects of age on glycogen synthase and phosphorylase activities in rat liver

Six exopeptidases present in human diploid fibroblasts were identified by separation on polyacrylamide gel electrophoresis and their activity profiles against 17 dipeptides, two tripeptides and L-leucine-p-nitroanilide determined. No differences in relative activity or in the electrophoretic patterns of any of the six exopeptidases were detected with ageing. Aminoacylarylamidase activity assayed spectrophotometrically showed significantly increased activity in the middle age-group cells as opposed to the enzyme isolated from young and old cells. Heat-inactivation studies using the same substrate suggested the possibility of an increased proportion of heat-labile enzyme in the old cells but interpretation of the data was difficult because of the complex nature of the inactivation curves obtained. Overall, the results tended to refute the hypothesis that age-related changes in the free amino acid pool of human diploid fibroblasts were associated with significant alterations in the activities of cellular exopeptidases.     

Genistein对HIV-1gp120抑制鼠LTP的实验研究

目的为了探讨酪氨酸蛋白激酶抑制剂Genistein对人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV1)的包膜糖蛋白gp120引起大鼠海马脑片CA1区的长时程增强效应(Longtermpotentiation,LTP)作用的影响。方法应用离体脑片记录技术,记录大鼠海马CA1区的兴奋性突触后电位EPSP,研究了Genistein对gp120引起的大鼠海马脑片CA1区的突触传递和可塑性变化的影响。结果gp120对高频电刺激(HFS,100Hz,1000ms×2,串间隔20s,共2次)Schaffer侧支引起的大鼠海马CA1区LTP产生抑制作用,而对PTP没有影响。酪氨酸蛋白激酶抑制剂Genistein可以反转这种抑制效应。结论gp120可能通过抑制海马CA1区LTP而参与艾滋病痴呆(HIV1associateddementia,HAD)的形成,且这种抑制作用可能与酪氨酸蛋白激酶抑制剂Genistein有关。     

抑制JNK信号通路对致痫后海马神经元损伤的保护作用

目的：探讨抑制C—Jun氨基末端激酶通路（JNK）对减轻癫痫持续状态（SE）大鼠海马神经元损伤的作用和机制。方法：建立氯化锂-匹罗卡品SE模型,其中24只鼠为单纯模型组;另24只鼠为抑制组,即在注射氯化锂-匹罗卡品之前,预先用特异抑制剂SP600125作侧脑室注射。另用6只鼠作正常对照,不制模,用生理盐水代替氯化锂一匹罗卡品,用二甲基亚砜（DMS0）溶液代替SP6001250。3组都在不同时间点用免疫组化法检测海马CA1区磷酸化JNK（P—JNK）的表达,并将抑制组与模型组、对照组相比较,观察组织病理学改变。结果：正常对照组JNK极少活化;模型组在SE后30min时点JNK在海马神经元强烈激活,2h时达到高峰,6h后明显减少;抑制剂组JNK激活明显减少。模型组海马CA1区可见到神经元发生变性和坏死,抑制剂组这种变化则较轻。结论：SE后JNK信号转导（transduction）通路被激活,并可致发作后海马神经元损伤;抑制剂SP600125则抑制JNK信号转导通路,对海马神经元起一定保护作用。     

西洛他唑对冠心病合并2型糖尿病患者血小板活化和超敏C反应蛋白的影响

目的观察西洛他唑对冠心病（CHD）合并2型糖尿病（2-DM）患者血小板聚集率（PAG）、血小板α颗粒膜糖蛋白（CD62p）和超敏C反应蛋白（hs—CRP）的影响,探讨各项指标的相关性及预后的关系。方法80例冠心病合并糖尿病患者随机分为两组,A组：阿司匹林0．1Qd;B组：阿司匹林0．1Qd＋西洛他唑50mg,Bid;并设健康对照组。分别于入院第二天及用药1周后测定二磷酸腺苷（ADP）、花生四烯酸（AA）诱导的PAG变化,以及CD62p和hs—CRP水平。结果用药前A、B两组PAG（ADP、AA诱导）、CD62p及hs—CRP水平均高于对照组,两组之间无统计学差异;治疗1周后B组的PAG、CD62p及hs—CRP水平较A组显著降低,但CD62p及hs—CRP仍高于对照组。B组用药前后hs-CRP与ADP及AA诱导的PAG、CD62p呈正相关;B组6个月临床观察终点事件的发生率显著低于A组。结论西洛他唑可抑制合并2-DM冠心病患者PAG,降低CD62p及hs—CRP水平,改善预后。