小分子化合物P-275抑制胃癌细胞增殖及机制研究

目的研究小分子化合物P-275对人胃癌细胞BGC823、SGC7901、MKN-45增殖的抑制作用及其机制。方法分别用不同浓度的化合物P-275处理人胃癌细胞BGC823、SGC7901和MKN-45,MTT法检测化合物对细胞增殖的影响,流式细胞术检测化合物对细胞周期的影响,Western Blot检测化合物对周期调控蛋白Cyclin D1、CDK4表达的影响。结果化合物P-275能够以剂量依赖的方式抑制人胃癌细胞BGC823、SGC7901及MKN-45的增殖,同时能够抑制上述细胞G1期向S期的转化。Western Blot结果显示P-275能够以剂量依赖的方式下调胃癌细胞SGC7901中周期调控蛋白Cyclin D1、CDK4的表达。结论化合物P-275能够通过下调胃癌细胞中周期调控蛋白Cyclin D1、CDK4的表达,从而抑制胃癌细胞G1期向S期的转化,进而抑制胃癌细胞的增殖。     

小分子化合物E-039抑制胃癌细胞迁移侵袭及其分子机制

目的研究小分子化合物E-039对人胃癌细胞增殖、迁移侵袭的影响及其分子机制。方法用MTT检测不同浓度小分子化合物E-039对胃癌细胞BGC823和MKN-45增殖能力的影响。分别用0、20、40、60μmol/L浓度的E-039处理BGC823和MKN-45两种胃癌细胞,应用Transwell小室检测其对上述细胞迁移侵袭能力的抑制作用,Western Blot检测化合物对金属基质蛋白酶2(MMP2)表达及丝切蛋白(Cofilin)磷酸化水平的影响。结果化合物E-039对于BGC823和MKN-45两种胃癌细胞的增殖能力无明显影响,却能够以剂量依赖的方式抑制BGC823及MKN-45细胞的迁移和侵袭。Western Blot结果显示E-039下调胃癌细胞BGC823中MMP2的表达及Cofilin的磷酸化水平。结论化合物E-039能够通过下调胃癌细胞中MMP2的表达及Cofilin的磷酸化水平,抑制胃癌细胞BGC823、MKN-45的迁移和侵袭。     

小分子化合物M-364抑制胃癌细胞侵袭及机制研究

目的研究小分子化合物M-364对人胃癌细胞BGC823、MKN-45增殖和侵袭能力的影响及其可能机制。方法应用MTT检测不同浓度小分子化合物M-364对于胃癌细胞BGC823和MKN-45增殖能力的影响。分别用0、20、40、60μmol/L浓度的化合物M-364处理BGC823和MKN-45两种胃癌细胞,应用Transwell小室检测其对上述两种细胞侵袭能力的抑制作用,Western Blot检测化合物对金属基质蛋白酶2(MMP2)表达及丝切蛋白(Cofilin)磷酸化水平的影响。结果化合物M-364以剂量依赖的方式抑制BGC823和MKN-45两种胃癌细胞的侵袭能力,但对增殖能力无明显影响。Western Blot结果显示M-364能够下调胃癌细胞BGC823中MMP2的表达及Cofilin的磷酸化水平。结论化合物M-364抑制BGC823、MKN-45胃癌细胞侵袭可能与下调MMP2的表达及Cofilin的磷酸化水平相关。     

小分子化合物G-052抑制胃癌细胞侵袭及其分子机制

目的研究小分子化合物G-052对于人胃癌细胞增殖和侵袭的影响及可能分子机制。方法用MTT检测不同浓度小分子化合物G-052对胃癌细胞BGC823和MKN-45增殖能力的影响。分别用0、20、40、60μmol/L浓度的G-052处理BGC823和MKN-45两种胃癌细胞,应用Transwell小室检测其对上述胃癌细胞侵袭能力的抑制作用,Western Blot检测化合物对金属基质蛋白酶2(MMP2)表达及丝切蛋白(Cofilin)磷酸化水平的影响。结果化合物G-052以剂量依赖的方式抑制BGC823和MKN-45细胞的侵袭能力,但对增殖能力无明显影响。Western Blot结果显示G-052下调胃癌细胞BGC823中MMP2的表达及Cofilin的磷酸化水平。结论 G-052抑制胃癌细胞BGC823、MKN-45的侵袭可能与下调MMP2的表达及Cofilin磷酸化水平相关。     

RegⅠ在胃泌素促胃癌细胞体外增殖通路中的作用

目的 探讨再生蛋白I (RegⅠ)在胃泌素刺激胃癌细胞增殖通路中的作用.方法 根据RegⅠ cDNA已知序列,在线设计3个小干扰RNA,并经基因库同源性比较,构建其RegⅠ-shRNA表达载体(pSUPER-EGFP-REG/1、pSUPER-EGFP-REG/2和pSUPER-EGFP-REG/3),利用脂质体2000转染试剂分别转染胃癌细胞BGC823细胞株、SGC7901细胞株,同时设转染空质粒的实验对照组和无质粒转染的空白细胞组.后经G418筛选建立稳定转染细胞株.RT-PCR检测RegⅠ基因mRNA的转录水平,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测胃泌素孵育对胃癌细胞增殖的效应.结果 酶切及测序鉴定,插入片段正确,3个RegⅠ-shRNA表达载体构建成功;RT-PCR显示,pSUPER-EGFP-REG/1可有效抑制RegⅠ mRNA在胃癌细胞BGC823、SGC7901的转录.Western boltting结果显示,BGC823和SGC7901细胞的RegⅠ蛋白表达率分别下调到空载体对照组的(45±4)%和(53±4)%;MTT结果显示,RegⅠ基因表达抑制胃癌细胞系的增殖效率均降低(P＜0.05).胃泌素孵育后,胃癌细胞BGC823、SGC7901的增殖效率均增加(P＜0.05),而RegⅠ基因表达抑制的胃癌细胞系增殖效率则无明显改变(P＞0.05).结论 实验成功建立了RegⅠ基因表达抑制的胃癌细胞系; RegⅠ基因可能对胃泌素促胃癌细胞的增殖有促进的作用.     

ZAC基因在奥曲肽抑制胃癌细胞体外增殖通路的作用

目的 探讨ZAC基因在生长抑素类似物奥曲肽（OCT）抑制胃癌细胞增殖通路的作用。方法 分别以不同浓度OCT处理胃癌细胞BGC823和 SGC7901不同时间,MTT法筛选其增殖抑制的有效条件。OCT处理胃癌细胞（有效浓度/不同时间,有效时间/不同浓度）,Western blotting检测
OCT对胃癌细胞ZAC基因的效应。设计3条ZAC基因RNA干扰片段,分别插入pSUPER-EGFP-I载体,构建3个ZAC-shRNA表达载体（pSUPER-EGFP-ZAC/1 pSUPER-EGFP-ZAC/2和pSUPER-EGFP-ZAC/3）。经酶切和序列分析鉴定后,分别转染胃癌细胞BGC823和SGC7901。经G418筛选,RT-PCR鉴定,建立
ZAC基因敲低（knock-down）的胃癌细胞系。以有效条件OCT孵育胃癌细胞（对照组）和ZAC基因敲低胃癌细胞（实验组）,MTT法检测OCT对胃癌 细胞的生长抑制效应。结果 OCT抑制胃癌细胞增殖的有效条件为10nmol/L 孵育24h;OCT以时间和浓度依赖的方式诱导胃癌细胞ZAC基因表达。酶切及序列分析鉴定表明ZAC-shRNA表达载体构建成功。转染shRNA-ZAC/2的胃癌细胞,其ZAC mRNA水平明显降低（P<0.05）,为ZAC基因敲低胃癌 细胞。ZAC基因敲低胃癌细胞的增殖明显高于对应的BGC823细胞和SGC7901细胞（P<0.05）。OCT孵育后,BGC823细胞和SGC7901细胞的增殖明显降低（P<0.05）。然而,ZAC基因敲低胃癌细胞的增殖无明显改变（P>0.05）。结论 OCT以时间和浓度依赖的方式诱导胃癌细胞ZAC基因表达;ZAC 基因在OCT抑制胃癌细胞增殖通路中具有重要作用。     

1α,25（OH）2D3通过阻滞细胞周期抑制胃癌细胞系增殖简

 目的 研究1α,25(OH) 2D3对胃癌细胞增殖和细胞周期的影响,并探讨其相关的作用机制。方法 BGC-823和SGC-7901胃癌细胞株分别给予终浓度为10-10~10-7mol/L的1α,25(OH) 2D3处理72h,用MTT法检测细胞抑制率;用流式细胞仪检测细胞周期;用RT-qPCR技术检测细胞周期相关基因P21、cyclinD1、cyclinE1和CDK6 mRNA表达。 结果1α,25(OH) 2D3对胃癌细胞的增殖抑制率具有浓度依赖性, 1α,25(OH) 2D3干预导致BGC-823和SGC-7901细胞株G1期细胞比例升高,S期细胞比例降低 (P<0.05); 1α,25(OH) 2D3干预后,BGC-823和SGC-7901胃癌细胞P21 mRNA表达升高(P<0.01),而cyclinD1、cyclinE1和CDK6 mRNA表达降低(P<0.01)。结论 1α,25(OH) 2D3抑制胃癌细胞增殖,诱导细胞周期阻滞,可能与上调P21,下调cyclinD1、cyclinE1和CDK6的表达有关。     

1α,25(OH)_2D_3通过阻滞细胞周期抑制胃癌细胞系增殖

目的研究1α,25(OH)2D3对胃癌细胞增殖和细胞周期的影响,并探讨其相关的作用机制。方法 BGC-823和SGC-7901胃癌细胞系分别给予终浓度为1×10-10～1×10-7mol/L的1α,25(OH)2D3处理72 h,用MTT法检测细胞抑制率;用流式细胞仪检测细胞周期;用RT-qPCR技术检测细胞周期相关基因P21、cyclin D1、cyclin E1和CDK6 mRNA表达。结果 1α,25(OH)2D3对胃癌细胞的增殖抑制率具有浓度依赖性,1α,25(OH)2D3干预导致BGC-823和SGC-7901细胞系G1期细胞比例升高,S期细胞比例降低(P0.05);1α,25(OH)2D3干预后,BGC-823和SGC-7901胃癌细胞P21 mRNA表达升高(P0.01),而cyclin D1、cyclin E1和CDK6 mRNA表达降低(P0.01)。结论 1α,25(OH)2D3抑制胃癌细胞增殖,诱导细胞周期阻滞,可能与上调P21,下调cyclin D1、cyclin E1和CDK6的表达有关。     

地高辛对人胃癌SGC7901细胞生长和凋亡的影响

目的:探究地高辛对人胃癌SGC7901细胞生长和凋亡的影响,并探讨其分子机制。方法:选取人胃癌细胞SGC7901作为研究对象,采用CCK-8法检测地高辛的细胞毒作用并测定IC_(50),采用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期,采用Western blot法检测c-Src、p-c-Src(Tyr416)、Akt、p-Akt(Ser473)、ERK1/2和p-ERK1/2(Tyr204)的蛋白水平,采用RT-PCR法检测c-Src的mRNA表达水平。结果:随着地高辛浓度逐渐升高,自50nmol/L开始,SGC7901细胞的存活率逐渐降低(P0.05),当地高辛浓度达到500 nmol/L时SGC7901细胞的存活率降至最低(P0.05),地高辛作用24 h的IC_(50)为191.45 nmol/L;200 nmol/L地高辛作用SGC7901细胞24 h后,与对照组相比,细胞凋亡率显著升高(P0.05),G_0/G_1期细胞比例明显升高(P0.05),c-Src、ERK1/2和Akt蛋白的磷酸化水平显著下降(P0.05),c-Src的mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P0.05),细胞迁移率降低(P0.05)。结论:地高辛可在体外诱导人胃癌细胞SGC7901的凋亡和G0/G1期阻滞,这可能与其下调c-Src基因表达以及抑制ERK1/2和Akt蛋白磷酸化有关。     

过表达miR-146a通过靶向SOX5抑制胃癌MKN-45细胞增殖和侵袭

目的 探讨过表达miR-146a对胃癌MKN-45细胞增殖、侵袭的影响及可能机制.方法 利用瞬时转染将miR-146a mimics(过表达miR-146a组)和miR-NC(阴性对照组)分别转染胃癌MKN-45细胞,建立过表达miR-146a胃癌MKN-45细胞系,采用MTT法检测转染后MKN-45细胞增殖能力,Transwell实验检测转染后MKN-45细胞侵袭能力.Western blot检测转染后MKN-45细胞中SOX5蛋白表达,通过网站Targetscan预测SOX5是否为miR-146a的靶基因,双荧光素酶实验进行验证.结果 miR-146a过表达抑制MKN-45细胞增殖、侵袭能力,miR-146a过表达使MKN-45细胞中SOX5蛋白表达下降,Targetscan网站分析及双荧光素酶实验证实SOX5为miR-146a的靶基因.结论 过表达miR-146a可以抑制胃癌MKN-45细胞增殖及侵袭能力,其机制可能与下调SOX5的表达有关.     

IFN-γ上调人胃癌细胞株PD-L1表达

 目的：研究不同人胃癌细胞株表面程序性死亡配体1（PD-L1）表达及干扰素γ（IFN-γ）对其表达的诱导情况。方法：分别培养不同人胃癌细胞株AGS、BGC823、MGC803和SGC7901,经不同浓度IFN-γ、作用不同时间后,利用流式细胞术及real-time PCR检测胃癌细胞株PD-L1在蛋白和mRNA水平的表达情况。结果：流式细胞术显示AGS、BGC823、MGC803和SGC7901细胞PD-L1蛋白表达率分别为（1.567±0.109）%、（2.640±0.577）%、（1.760±0.236）%和（16.030±1.289）%;不同胃癌细胞株对IFN-γ反应不同,经不同浓度IFN-γ刺激后均可不同程度上调PD-L1的表达（P<0.05）;real-time PCR显示10 μg/L IFN-γ刺激各胃癌细胞株12 h后PD-L1 mRNA水平上调（P<0.05）。结论：胃癌细胞株组成性表达PD-L1;IFN-γ可上调胃癌细胞株PD-L1的表达,呈现浓度、时间依赖性;其中以SGC7901细胞（来源于转移淋巴结）表达最高,推测胃癌细胞中PD-L1的表达与肿瘤分化程度无关,与组织来源和淋巴结转移有关;IFN-γ上调胃癌细胞PD-L1,表明IFN-γ并非都是抑制肿瘤增殖、生长,可能参与介导肿瘤免疫逃逸,故临床运用IFN-γ辅助治疗胃癌时应慎用。     

运用亚细胞蛋白质组学方法发现胃腺癌潜在标志物UCHL1

目的:通过对胃腺癌细胞系SGC7901和永生化胃正常上皮细胞系GES胞浆组分蛋白进行差异蛋白质组学分析,为胃腺癌诊断提供候选生物标志物,进而为阐明胃腺癌发病机理提供新的线索和思路。方法:运用亚细胞蛋白组份分离结合双向凝胶电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALD I-TOF-MS)技术筛选鉴定出SGC7901和GES细胞系胞浆蛋白组分间的差异蛋白质,并且利用免疫印迹和半定量RT-PCR方法对得到的差异蛋白进行验证。结果:筛选得到10个差异蛋白,进一步证实,差异蛋白泛素羧基末端水解酶-L1(UCHL1)在蛋白质和mRNA水平上,在胃癌细胞系SGC7901、AGS、BGC823和MKN45中的表达水平均低于胃正常上皮细胞系GES;其在胃癌组织中的表达水平也远远低于癌旁正常胃组织中的水平。结论:UCHL1蛋白质分子具有作为胃腺癌诊断检测标志物的潜在应用价值,为开发胃腺癌诊断标志物提供了新的候选蛋白。     

Gastric cancer cells in collagen gel matrix: three-dimensional growth and differential expression of adhesion molecules (CD44s, CD54, E-cadherin)

To characterize the growth of human gastric cancer cells in collagen gel matrix and adhesive status of the cells in comparison with conventional monolayer cells. Three kinds of human gastric cancer cell lines (BGC823, SGC7901, and MKN28) were cultured alone or co-cultured with normal human fibroblasts in collagen gel matrix, and their cell cycle, metabolic function, and the expression of adhesive molecules (CD44s, CD54, and E-cadherin) were analyzed by flow cytometry or other methods. Two of three cell lines (BGC823 and SGC7901) and their co-cultures showed multilayer growth in collagen gel matrix, and their growth and metabolism rate became slow and the cell adhesion molecules (CAMs) expression was down regulated. Gastric cancer cell alone or with fibroblasts in collagen gel matrix showed distinct growth feature when compared with monolayer cells, which represent two kinds of different experimental models. BGC823 and SGC7901 cells growing in three-dimension may recur some characteristics of their original solid tumor in vivo with the invasive or metastatic ability. According to different aims, it should pay great care in choice of experimental model to get more reasonable results.     

Effect of bone morphogenetic protein-2 on proliferation and apoptosis of gastric cancer cells

Objective: To investigate the effects of bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) on the proliferation, differentiation and apoptosis of normal human gastric mucosal cells and gastric cancer cells.Methods: Poorly differentiated gastric cancer BGC823 cells, moderately differentiated gastric cancer cells and normal human gastric mucosal epithelial GES-1 cells were independently treated with recombinant human BMP-2 or its inhibitor Noggin. MTT assay was performed to detect the proliferation, flow cytometry done to measure the cell cycle and apoptosis and immunohistochemistry carried out to determine the expression of cyclin-dependent kinase 4 (CDK4).Results: BMP-2 exerted inhibitory effect on the growth of all types of cells and the inhibition become more evident with the increase of BMP-2 dose. After treatment with 200 ng/ml BMP-2, cancer cells arrested in G1 phase and those in S phase reduced. Gastric cancer cells had higher CDK4 expression than GES-1 cells. BMP-2 decreased CDK-4 expression in cancer cells but had no influence in GES-1 cells. Noggin conferred promotive effect on the growth of 3 types of cells. In 2 types of cancer cells, treatment with 2000 ng/ml Noggin significantly increased the proportion of cells in S phase but reduced that in G1 phase. However, Noggin did not affect the cell cycle of GES-1 cells. The CDK4 expression was markedly increased in 2 types of cancer cells but that of GES-1 remained unchanged after treatment with 2000 ng/ml Noggin.Conclusions: BMP-2 may inhibit the proliferation of both normal and malignant gastric epithelial cells, down-regulate CDK4 expression in gastric cancer cells and arrest gastric cancer cells in G1-phase in cell cycle. Through antagonizing BMP-2, Noggin, may accelerate the proliferation of gastric cancer cells. Thus, the abnormality of BMP signaling pathway may play an important role in the pathogenesis of gastric cancer.