Aminoglycoside ototoxicity in three murine strains and effects on NKCC1 of stria vascularis

Background After establishing a murine model of aminoglycoside antibiotic （AmAn） induced ototoxicity, the sensitivity of AmAn induced ototoxicity in three murine strains and the effect of kanamycin on the expression of Na-K-2Cl cotransporter-1 （NKCC1） in stria vascularis were investigated. Methods C57BL/6J, CBA/CaJ, NKCC1^＋/- mice （24 of each strain） were randomly divided into four experimental groups： A： kanamycin alone; B： kanamycin plus 2,3-dihydroxybenzoate; C： 2,3-dihydroxybenzoate alone; and D： control group. Mice were injected with kanamycin or/and 2,3-dihydroxybenzoate twice daily for 14 days. Auditory brainstem response （ABR） was measured and morphology of cochlea delineated with succinate dehydrogenase staining. Expression of NKCC1 in stria vascularis was detected immunohistochemically. Results All three strains in groups A and B developed significant ABR threshold shifts （P〈0.01）, which were accompanied by outer hair cell loss. NKCC 1 expression in stria vascularis was the weakest in group A （A cf D, P〈0.01） and the strongest in groups C and D （P〈0.05）. CBA/CaJ mice had the highest sensitivity to AmAn. Conclusions Administration of kanamycin established AmAn induced ototoxicity. Kanamycin inhibited the expression of NKCC1 in stria vascularis. 2, 3-dihydroxybenzoate attenuated AmAn induced ototoxicity-possibly by enhancing the expression of NKCC 1. Age related hearing loss did not show additional sensitivity to AmAn induced ototoxicity in murine model.     

后半规管途径导入不同血清型腺相关病毒转染小鼠耳蜗内毛细胞的效果比较

目的 探讨不同血清型的腺相关病毒经后半规管途径导入成年小鼠转染内耳细胞的效率及安全性。 方法 将20只6~8周C57BL/6J小鼠采用数字表法随机分为5组:腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)4组,AAV8病毒注射组、AAV9病毒注射组、AAVie病毒注射组和Anc80L65病毒注射组,均采取后半规管路径进行注射,每只注射病毒溶液2 μL;正常对照组,每只注射0.9%(质量分数)氯化钠注射液2 μL,均以左耳为手术耳。各组于术前1 d及术后2周行听觉脑干反应(auditory brainstem response,ABR)检查,随后取材进行免疫荧光染色观察病毒在基底膜的分布情况。结果 AAV8组:术后2周观察见耳蜗顶中转34.6%±1.8%内毛细胞被转染,中底转39.0%±5.9%内毛细胞表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP);AAV9组:术后2周见耳蜗顶中转92.5%±1.1%内毛细胞被转染,中底转94.6%±1.0%内毛细胞表达GFP; AAVie组:术后2周见耳蜗顶中转96.7%±1.5%内毛细胞被转染,中底转97.7%±0.8%内毛细胞表达GFP; Anc80L65组:术后2周见耳蜗顶中转62.5%±3.3%内毛细胞转染,中底转63.1%±6.1%内毛细胞表达GFP;正常对照组未见GFP表达。 结论 经半规管途径注射AAVie、AAV9病毒溶液可以高效转染到耳蜗内毛细胞,此结果对耳聋疾病的内耳基因治疗具有一定的参考意义。     

miR-140在内耳毛细胞中的表达及其对突触蛋白Dynamin-1的调控作用

目的 研究miR-140在正常小鼠内耳毛细胞的表达分布及其对编码突触蛋白Dynamin-1的Dnm1基因的靶向调控作用.方法 取正常成年C57BL/6小鼠耳蜗基底膜,免疫荧光染色和原位杂交法观察Dynamin-1与miR-140的表达定位情况.构建荧光素酶报告基因载体转染293T细胞,通过荧光素酶活性变化明确Dnm1是否是miR-140的靶基因.携带miR-140前体及空载的腺相关病毒(adenoassociatedvirus,AAV) 通过圆窗膜注射传递到耳蜗中, 14 d后RT-PCR检测miR-140及Dnm1的mRNA表达水平,Western blot检测Dynamin-1蛋白的表达水平.结果 miR-140表达于内外毛细胞细胞质,Dynamin-1主要表达于内毛细胞细胞质;荧光素酶活性检测结果 显示,miR-140抑制Dnm1的3'UTR荧光素酶报告基因活性(P＜ 0.05) .RT-PCR及Western blot检测结果 显示: 转染AAV-miR-140后miR-140的相对表达量明显升高,Dnm1的mRNA及其蛋白表达水平显著降低(P＜ 0.05) .结论 Dnm1是miR-140的靶基因,且miR-140可以抑制内耳毛细胞中Dynamin-1的表达,表明miR-140可能通过抑制Dynamin-1蛋白负向调控内毛细胞突触囊泡内吞过程,进而影响听觉信号的传递.     

Correlation of PDCD5 and apoptosis in hair cells and spiral ganglion neurons of different age of C57BL/6J mice

This study examined the expression pattern of programmed cell death 5 (PDCD5) in co-chlear hair cells and spiral ganglion neurons (SGNs) and its association with age-related hearing loss in mice.Sixty C57BL/6J (C57) mice at different ages were divided into four groups (3,6,9 or 12 months).PDCD5 expression was detected by using immunohistochemistry,real-time PCR and Western blot.Morphological change of the cochleae was also evaluated by using immunoassay.The results showed that the expression of PDCD5 had a gradual increase with ageing in both protein and RNA levels in C57 mice,as well as gradually increased apoptosis of cochlear hair cells and SGNs.In addition,we also found that caspase-3 activity was enhanced and its expression was enhanced with ageing.It is implied that overexpression of PDCD5 causes the increase in caspase-3 activity and the subsequent increase of apoptosis in cochlear hair cells and SGNs,and thereby plays a role in the pathogenesis of presbycusis.Thus,PDCD5 may be a new target site for the treatment and prevention of age-related hearing loss.     

Fmr1基因敲除小鼠耳蜗的GABAa1受体的表达

目的 对4周龄Fmr1基因敲除小鼠耳蜗的GABAa1受体表达进行观察,探讨耳蜗GABAa1受体的表达是否受FMRP的影响。方法使用PCR技术对Fmr1基因敲除小鼠鉴定后,对4周龄的Fmr1基因敲除小鼠和野生型小鼠进行耳蜗的GABa1受体免疫组织化学的表达观察,数据采用多因素方差分析处理。结果耳蜗HE染色结果：4周龄组KO鼠较WT鼠形态学观察无差异。4周龄KO小鼠的耳蜗中GABAa1受体表达的平均阳性细胞数均低于WT小鼠,P〈0.01,差异具有统计学意义。结论GABAa1受体表达的降低可能与FMR1基因KO小鼠听源性惊厥发病有关。     

新生小鼠耳蜗基底膜体外培养观察

目的建立新生昆明小鼠耳蜗基底膜体外培养的模型并观察耳蜗基底膜培养的组织学形态。方法取出生2³ d的昆明小鼠耳蜗基底膜,置入24孔细胞培养板,在含有体积分数10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔/F12培养基中进行培养。采用四甲基异硫氰酸罗丹明标记的鬼笔环肽荧光染色毛细胞,抗神经丝蛋白荧光染色听神经纤维及螺旋神经节。观察耳蜗毛细胞、听神经纤维及螺旋神经节的生长情况。结果耳蜗基底膜经培养6 d,基底膜保持结构完整,毛细胞和螺旋神经节生长良好。结论本培养方法简便易行,可用于耳蜗基底膜体外培养实验研究。     

蛋白酶TMPRSS3在小鼠耳蜗中的表达分析

目的:观察跨膜丝氨酸蛋白酶3（transmembrane protease,serine 3,TMPRSS3）在小鼠耳蜗组织中的表达与分布,分析不同年龄阶段耳蜗TMPRSS3 mRNA表达情况,初步探讨内耳蛋白酶TMPRSS3的作用.方法:采用免疫组织化学结合免疫荧光双标技术观察C57/BL小鼠耳蜗组织TMPRSS3蛋...     

线粒体去乙酰化蛋白SIRT3在噪声诱导隐匿性听力损失中的作用

目的 探讨线粒体去乙酰化蛋白(sirtuin-3,SIRT3)在噪声性隐性听力损失(noise-induced hidden hearing loss, NIHHL)中的作用。方法 将注射过SIRT3抑制剂[3-(1H-1,2,3-triazol-4-yl) pyridine,3-TYP]与未经处理的C57BL/6J小鼠分别于100 dB白噪声下暴露2 h,并在噪声暴露 (noise exposure, NE) 后1 d和14 d进行测听。利用免疫荧光染色观察内毛细胞 (inner hair cell, IHCs)带状突触(ribbon synapses, RS)的变化。冰冻切片下,4-羟基壬烯醛 (4-hydroxynonenal, 4-HNE)染色观察耳蜗内活性氧(reactive oxygen species, ROS) 的累积。结果 与对照组相比,噪声组及3-TYP组小鼠均在噪声后出现短暂性听力阈值的升高,ROS的累积及带状突触的丢失。与噪声组小鼠相比,3-TYP组小鼠在噪声后第14天听力未恢复正常,带状突触丢失明显,且伴有ROS的显著累积。结论 NE诱发了内耳的氧化应激反应,SIRT3可能通过抵抗氧化应激作用来保护耳蜗带状突触及听功能。     

TRPV1在正常BALB/c小鼠耳蜗中的定位表达

目的 研究瞬时受体电位通道蛋白V1(TRPV1)在正常小鼠耳蜗中的定位观察.方法 选择10只健康成年BALB/c小鼠,应用免疫荧光染色方法观察TRPV1在耳蜗中的定位与表达,同时结合电生理指标听脑干反应(auditory brainstem response,ABR)测试小鼠的听力.结果 TRPV1在小鼠耳蜗螺旋器的内、外毛细胞、螺旋神经节细胞和血管纹边缘细胞等都有表达,且主要定位于细胞膜;蛋白质印迹检测结果亦显示小鼠耳蜗中有TRPV1的表达.结论 TRPV1在正常BALB/c小鼠耳蜗的多种细胞中均有表达,这为深入TRPV1在内耳听觉生理和病理生理中的作用奠定基础.     

Caveolin-1敲除对C57BL/6小鼠繁殖性能及子代离乳前体质量的影响

目的探讨小窝蛋白Caveolin-1敲除对C57BL/6小鼠离乳前繁殖性能及体质量的影响。方法分别对Caveolin-1基因敲除小鼠和同源C57小鼠进行体质量、初产日龄、胎次间隔时间、平均产仔数及离乳存活率的观察及分析。结果 C57BL/6小鼠鼠仔平均体质量均高于Caveolin-1基因敲除鼠,在1、7、14 d时两者比较差异无统计学意义(P>0.05);21 d时,两者差异具有统计学意义(P<0.05);两组初产日龄、胎次间隔时间及平均产仔数差异无统计学意义(P>0.05),但C57BL/6小鼠离乳存活率明显高于基因敲除鼠,两者差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 Caveolin-1敲除小鼠的体质量下降、繁殖性能下降。     

神经生长因子在小鼠耳蜗中的表达分布及年龄相关性变化

目的探讨神经生长因子(NGF)在小鼠耳蜗中的表达分布与年龄的相关性变化。方法选取5、7月龄的快速老化小鼠亚系8(SAMP8)作为实验组,而同龄抗快速老化小鼠亚系1(SAMR1)作为对照组。分别观察其耳蜗中NGF免疫组化染色及增龄性变化情况。结果在小鼠耳蜗中,NGF在螺旋神经节细胞、内外毛细胞、听神经纤维及血管纹中均有表达,且螺旋神经节细胞及内外毛细胞为主要表达部位。耳蜗螺旋神经节细胞及内外毛细胞NGF免疫组化染色平均光密度值:NGF蛋白在不同月龄快速老化小鼠耳蜗组织中螺旋神经节细胞及毛细胞均有表达,第5、7月龄SAMP8小鼠耳蜗螺旋神经节细胞及毛细胞中的NGF蛋白表达较同龄SAMR1小鼠明显降低(P<0.05)。结论 NGF蛋白在小鼠耳蜗中有表达并且表达水平随着小鼠年龄增长而降低,说明NGF蛋白可能与维持耳蜗的功能状态有关。     

慢性肾功能不全对大鼠耳蜗影响的实验研究

目的 研究慢性肾功能不全（ＣＲＦ）对耳蜗的影响。方法 应用５／６肾切除法制造大鼠ＣＲＦ模型,检测茯肾功能及肾脏组织形态变化,观察ＣＲＦ对实验动物脑干听觉诱发电位（ＡＢＲ）阈及耳蜗螺旋器表面超微结构的影响。结果 模型组ＡＢＲ阈值提高明显低于对照组（Ｐ〈０．０１）,对螺旋器表面超微结构的损伤,主要表现为耳蜗各回内毛细胞静纤毛的不同程度缺失,外毛细胞静纤毛较少受损。结论 ＣＲＦ可影响其耳蜗听毛细胞的细胞     

SOD1基因缺陷型小鼠耳蜗毛细胞和螺旋神经节及神经纤维的定量观察

定量观察了出生后１３个月的先天缺失ＳＯＤ１基因小鼠的耳蜗毛细胞以及螺旋神经蕞和疆孔内的神经纤维,并与同龄野生型和出生后２个月的野生型小鼠进行了比较。发现毛细胞和螺旋神经节的缺损约为５０％,神经纤维的减少则超过５０％,提示由于与铜和锌相结合的过氧化物歧化酶的缺失导致了耳蜗神经与终器的严重退变。     

表皮生长因子在小鼠耳蜗发育中的表达

运用免疫组织化学技术（LSAB法），对表皮生长因子（EGF）在昆明种小白鼠内耳发育中的表达进行研究。结果显示：EGF在小鼠胚胎第13d和14d的耳蜗上应及螺旋神经节的神经细胞中有阳性表达，但在前庭感觉器官的上皮中表达很弱。EGF在内耳间充质及内耳软骨包囊中无表达。结果表明：EGF在小鼠耳蜗上皮发育中的表达呈现明显的阶段性及组织特异性分布的特点，说明EGF参与小鼠耳蜗上皮的发育过程，其在小鼠耳蜗上皮发育的增殖期有阳性表达。     

丹参对耳蜗辐射防护作用的实验研究

In order to evaluate the preventive and therapeutic effects of Radix Salvia Miltiorrhizae on radiation damage of the cochlea, guinea pigs were divided into 3 groups. Group 1 was treated by radiation added with Radix Salvia Miltiorrhizae. Group 2 was radiated alone, and Group 3 was control. Group 1 and Group 2 were radiated with a single dose of gamma radiation(60 Gy). Morphological and functional observation of the cochleae was performed in two weeks after radiation. The result showed that the changes of complex action potential(CAP) and the cochlear structure were slight in Group 1, but obvious changes were found in Group 2. There was a significant difference in CAP response threshold and incidence of the cochlear hair cell loss between Group 1 and Group 2 (P < 0.01). These results suggest that Radix Salvia Miltiorrhiza may prevent radiation-induced cochlea damage. Its protective mechanisms may be cleaning free radicals, blocking calcium channel and improving microcirculation of the cochlea.     

生姜对C57小鼠毛发生长影响的研究

目的：探讨生姜对C57BL/6J小鼠毛发生长的促进作用。方法：C57BL/6J小鼠背部脱毛,给予不同浓度的生姜汁,观察其对小鼠毛发生长周期和生长速度的影响;组织学检查其对毛囊和黑色素的影响。结果：14 d后生姜各组皮肤开始变黑,19 d后生姜皮肤各组开始长出毛发,29 d生姜各组均长满毛发。与空白对照组对比,均具有显著性差异,与阳性对照组相比,在生长初期和中期,促毛发生长作用较弱,后期则达到相同的效果;对毛发的生长速度影响在高中剂量的范围内呈现剂量依赖性;病理切片显示,用药组可增加小鼠皮肤真皮层黑色素分布,刺激毛囊生长,使其进入生长期,而同期空白组仍然处于毛发休止期。结论：生姜具有明显的促毛发生长作用。     

瞬时性受体电位通道香草酸受体亚型6基因敲除小鼠模型的建立

目的 建立Trpv6基因剔除小鼠模型,为在体研究Trpv6的生物学功能及其与骨代谢关系创造条件。 方法 从Ensembl数据库中获得小鼠Trpv6基因组序列。设计基因剔除策略,构建基因剔除载体pBR322-MK-Trpv6。以电穿孔方法将基因剔除载体导入ES细胞,用G418和Ganciclovoir进行正负筛选,获得双抗性克隆。PCR鉴定出正确同源重组的胚胎多能干细胞（ES细胞）克隆。将正确同源重组的ES细胞注射到C57BL/6J小鼠的囊胚中,获得嵌合体小鼠。挑选嵌合率在50%的雄鼠与C57BL/6J小鼠交配,获得的灰鼠,PCR鉴定为杂合子小鼠。杂合子小鼠交配后获得纯合子小鼠。 结果 成功构建了打靶载体pBR322-MK-Trpv6。电穿孔后,共获得24个正确同源重组的克隆,同源重组效率为25%。同源重组的克隆经显微注射后,共获得4只嵌合率大于50%的雄鼠。嵌合鼠与野生型C57BL/6J交配,获得57只来源于ES细胞的灰鼠,PCR鉴定证实17只为杂合子小鼠,阳性率为33.3％。杂合子小鼠交配获得纯合子小鼠。经Western印迹证实纯合子小鼠无Trpv6蛋白的表达。 结论 已成功建立了Trpv6基因剔除小鼠模型,其中纯合子小鼠未出现胚胎致死现象。     

慢性次声暴露对豚鼠听阈及耳蜗毛细胞的影响

目的　观察慢性次声暴露对豚鼠听阈及耳蜗毛细胞形态学的影响和作用特点 .方法　通过听觉脑干诱发电位测试 (ABR)及扫描电镜分别观察了豚鼠在 8Hz,1 2 5 d B SPL ,1次· d- 1 ,2 h/次的次声暴露条件下 ,其听阈和耳蜗毛细胞听毛形态的变化情况 .结果　豚鼠在 click声及 9个频率的短纯音的听阈均有升高 ,最大阈移为 2 6 d B (4k Hz短纯音 ) ,最小阈移为 1 8d B(click声 ) ;豚鼠听阈的升高缺乏频率选择性 ,各频率阈移间无显著差异 .扫描电镜观察可见耳蜗毛细胞出现了以外毛细胞为主的损伤表现 ,且由底周至顶周外毛细胞听毛的损伤逐渐加重 .结论　慢性次声暴露确可使豚鼠听力出现下降 ,但与白噪声相比其又有自己的声损伤特点 ,可能在声损伤机制上二者是有差别的 .     

腺伴随病毒携带神经营养因子-3对庆大霉素致聋豚鼠耳蜗的保护作用

目的 探讨采用腺伴随病毒(AAV)携带神经营养因子-3(NT-3)对庆大霉素(GM)致聋豚鼠的局部基因治疗及其对耳蜗功能及形态的保护作用.方法 选用18只杂色健康豚鼠,用GM按80 mg/kg·d连续肌肉注射4 d后随机分为3组:AAV-NT-3治疗组(A组)7只,AAV对照组(B组)7只,GM对照组(C组)4只.A、B组动物在埋植微量渗透泵后继续肌肉注射GM 10 d,C组动物继续注射GM 10 d.AAV-NT-3及空白AAV载体滴度均为1.1×1010pfu/ml.对A、B两组注射GM前及术后10 d、C组注射GM后14 d进行听性脑干反应测听(ABR)及畸变产物耳声发射(DPOAE)测定.而后将动物麻醉处死取听泡,行基底膜铺片和毛细胞计数,计算外毛细胞损失率.结果 实验组与对照组相比听功能(ABR及DPOAE)及耳蜗毛细胞生存率均有显著性差异(P＜0.05).结论 腺伴随病毒介导NT-3转基因治疗可用于保护受氨基甙类药物损害的豚鼠听功能和耳蜗毛细胞;在行局部耳蜗转基因治疗中应严格遵循无菌原则.     

Bcl-2和Bax蛋白在糖尿病大鼠耳蜗中的表达

目的：探讨糖尿病耳聋大鼠的耳蜗病变与凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的相关性。方法： 35只大鼠随机分为糖尿病组和对照组。糖尿病组（25只）采用STZ腹腔一次性注射制备，对照组(10只)注射等量生理盐水。在成模后3个月时采用免疫组织化学方法，对大鼠耳蜗组织进行Bcl-2和Bax的表达检测。结果：糖尿病大鼠耳蜗结构未见异常的形态学改变。对照组大鼠耳蜗内、外毛细胞及血管纹、螺旋神经元均有少量的Bcl-2表达，糖尿病组仅血管纹组织表达的Bcl-2明显高于正常组，毛细胞和螺旋神经元的表达与正常对照组比较差异无显著性（P>0.05）。计算机定量分析显示，糖尿病组和对照组耳蜗血管纹的Bcl-2表达灰度值分别为135.32±21.69和45.32±9.08,两组比较差异有显著性 (P<0.01)。糖尿病组与对照组大鼠耳蜗组织均不表达Bax蛋白。结论：糖尿病大鼠血管纹组织表达过量的Bcl-2蛋白可能是糖尿病耳蜗早期病变的影响因素之一。