异种骨移植材料制备及其骨诱导活性实验研究

目的 采用酶处理法去除猪骨组织中的主要异种抗原--α-半乳糖抗原(α-Gal),探讨不同处理方式对其力学性能和骨诱导活性的影响.方法 取新鲜猪髂骨用α-半乳糖苷酶处理去除α-Gal,冷冻干燥后辐照灭菌.根据处理方法不同,将猪髂骨分为:A组新鲜骨、B组去抗原骨、C组冻干去抗原骨及D组冻干辐照去抗原骨.取B组骨扫描电镜观察,Smile View软件测量骨髓腔大小;采用ELISA法检测A、B及D组骨块α-Gal含量:检测A、B、C及D组力学性能;将去抗原脱矿骨(实验组)及脱矿骨(对照组),植入Wistar大鼠股部肌袋,于术后3、4、5、6周取出植入骨行组织学观察及ALP活性检测.结果 制备的B组骨呈三维网状结构,与人松质骨类似,骨髓腔大小为150～600μm.A、B、D组α-Gal吸光度值分别为0.358±0.027、0.191±0.011和0.190±0.009,组间差异有统计学意义(P<0.05).A、B、C、D组间力学性能比较差异无统计学意义(P>0.05).实验组植入3周,骨内长入的间充质细胞转变成软骨细胞并开始分泌软骨基质,4周骨内形成软骨组织,6周骨边缘成骨活跃,形成类骨质,骨内可见成熟软骨组织:对照组植入3～6周显示植入骨吸收,未见成骨迹象.实验组植入3～6周的ALP活性均显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 酶处理法能有效去除猪骨组织中的主要异种抗原,保留了其力学性能与骨诱导活性,有望成为一种骨移植替代材料.     

重组合异种骨在小鼠体内诱导成骨活性的剂量依赖性研究

本文是本所重组合异种骨（ＲＢＸ）的系列研究之一。采用碱性磷酸酶和钙量测定，成骨量微机图像分析，对牛骨形态发生蛋白含量不同的ＲＢＸ诱导成骨活性进行了研究。结果提示了ｂＢＭＰ含量不同的ＲＢＸ诱导面骨能力的差异及其下限，并认为实验采用的成骨定量方法，是较可靠易行的指标。     

重组合异种骨移植对IL—2生成影响的研究

采用重组合异种骨移植建立ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠股后肌袋模型，以研究对Ｔ淋巴细胞分泌Ｉ－２的功能变化及对细胞免疫的影响。结果显示：（１）ＲＢＸ移植后２天ＩＬ－２升高是由于手术他伤刺激所致的应激反应。（２）术后７￣１４天ＲＢＸ，ｂＢＭＰ对ＩＬ－２ 显著的抑制作用，２８￣４２天回升。（３）对Ｔ淋巴细胞功能的抑制作用主要是ＢＭＰ所致，经处理的牛板质骨泣不具免疫源性。提示：ＲＢＸ移植无明显免疫排异反应。ＢＭＰ能抑     

重组合异种骨的实验研究与临床应用

本文作者以牛ＢＭＰ与同源松质骨组合研制成重组合异种骨。将３６只新西兰家兔桡骨制成１５ｍｍ的骨缺损。Ａ组左侧植入重组合异种骨８０ｍｇ，左侧植入单纯松质骨。Ｂ组左侧植入重组合异种骨和自体红骨髓左侧植入生物陶瓷颗粒。术后１６周内，经放射学、组织学、四环素荧光双标记及免疫光检测。结果提示重组合异种骨的良好的填充修复骨缺损能力。临床应用３８例，其中随防６个月以上者３０例。除１例外，其余２９例均获得满意的骨愈     

重组合异种骨移植对IL－2生成影响的研究

采用重组合异种骨（ＲＢＸ）移植建立ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠股后肌袋模型，以研究对Ｔ淋巴细胞分泌ＩＬ－２的功能变化及对细胞免疫的影响，结果显示：（１）ＲＢＸ移植后２天ＩＬ－２升高是由于手术创伤刺激所致的应激反应；（２）术后７～１４天ＲＢＸ、ｂＢＭＰ对ＩＬ－２产生有显著的抑制作用，２８～４２天回升：（３）对Ｔ淋巴细胞功能的抑制作用主要是ＢＭＰ所致，经处理的牛板质骨粒不具免疫源性。提示：ＲＢＸ移植无明显免疫排异反应，ＢＭＰ能抑制Ｔ细胞的活化增殖，使细胞因子分泌减少，因而降低厂细胞免疫水平，ＢＭＰ可能属于一种新的兔疫调节因子。实验结果对ＲＢＸ移植既能成骨又不发生明显的免疫排异的机理是一种有意义的探讨。     

异种骨基质明胶骨诱导活性的实验研究

按Urist方法制备了人、兔、猪和羊四种骨基质明胶,并分别将其植入25只成年SD大鼠的胸部和股部肌肉内。在植入手术的2、4、6和8周后取标本,通过光学显微镜观察各种骨基质明胶在肌肉内的免疫排斥反应和诱导成骨性。结果表明,异种骨基质明胶(BMG)具有一定的诱导成骨能力,但在BMG周围亦存在程度不同的排斥反应。如能进一步改进制作方法,提高其诱导成骨活性,降低BMG的抗原性,异种BMG将具有重要的临床应用价值。     

自身骨泥成骨活性的实验研究

目的：观察长管状骨钻孔产生的骨泥的成骨活性。方法：选健康家兔２２只,桡骨中段连续钻孔采集骨泥,植入兔股四头肌。２周取５只兔做ＥＣＴ检查,１、２、３周分别做组织学检查、Ｅｌｉｖｉｓｉｏｎ二步法免疫组化染色及碱性磷酸酶测定。结果：自身骨泥具有良好的异位诱导成骨活性。植入区放射性浓聚程度明显高于对侧正常组织（Ｐ＜００５）。植入１周软骨生成,３周网织骨形成。组织碱性磷酸酶活性明显高于正常肌肉（Ｐ＜００１）,免疫组化发现细胞及组织ＢＭＰ强阳性。结论：长管状骨钻孔产生的自身骨泥具有诱导成骨作用,可做为需少量植骨的植骨材料。     

冻干同种异体骨与冻干异种骨移植治疗骨缺损的比较实验研究

目的：对比观察冻干同种异体骨和冻干异种骨骨移植治疗骨缺损的效果。方法：48只中国大白兔一侧桡骨造成1cm骨缺损，随机分为同种异体骨组和异种骨组，每组24只，分别植入两种移植骨，术后4、8、12周分批取材，进行X线片和组织学检查，然后做对比分析。结果：术后4周异种骨组的X线片，Gary X线评分与同种异体骨组有统计学差异，而术后8周同种异体骨组组织学检查以及组织学评分与异种骨组有统计学差异，在其他时期两组比较无统计学差异。结论：冻干异种骨具有很好的成骨效果，可以作为修复骨缺损的移植材料。     

重组合异种骨移植同源抗原刺激对脾细胞上清中IL—2的影响

为探讨重组合异种骨（ＲＢＸ）移植后对机体细胞免疫功能的影响，实验将ＲＢＸ、牛ＢＭＰ、经处理的同源松质骨粒、羟基磷灰石移植建立４组ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠股后肌袋模型，术后２、７、１４、２８、４２天取鼠脾细胞培养上清，３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测体内植骨及体外同源抗原刺激后ＩＬ－２的生物学活性。结果表明，各组移植后２天体内ＩＬ－２均一过性升高；７、１４天ＲＢＸ、牛ＢＭＰ组显著降低；体外抗原刺激３Ｈ－ＴｄＲ掺入ＣＰＭ值明显降低，且与抗原量呈剂量依赖关系。上述结果提示，ＲＢＸ移植对Ｔ淋巴细胞和ＩＬ－２诱导ＣＴＬＬ增殖有明显的抑制效应，可能对ＩＬ－２也有直接的抑制作用；而术后２天各组ＩＬ－２普遍升高可能与手术局部刺激应激反应有关。本研究对ＲＢＸ移植后既能成骨又不发生明显免疫排异的机理提出了初步解释。     

同种异体与异种骨移植免疫反应的比较研究

目的比较分析同种异体与异种骨移植后的免疫反应,观察IL-4和IL-10对免疫反应的影响。方法取C57BL/6小鼠和新西兰兔作为同种异体和异种骨供体,分别制成新鲜骨和冻干骨。于股后肌袋内分别植入新鲜同种异体、新鲜异种、新鲜异种(给予IL-4和IL-10治疗)、冻干同种异体及冻干异种骨。结果在植入新鲜骨的各组中,新鲜异种组早期细胞刺激反应较新鲜同种组强(P< 0.05)。1周时新鲜异种组CD4 T细胞亚群和CD4/CD8比值与新鲜同种组间差异无显著性,但2周时明显低于新鲜同种组。细胞因子检测显示,新鲜异种组的IL-2分泌较新鲜同种组多(P< 0.05),而且IFN-γ分泌少,IL-4分泌多(P<0.05)。组织学检查发现,新鲜异种组细胞浸润多,且以单核、巨噬细胞为主。与新鲜异种组相比,用IL-4和IL-10治疗后明显抑制了骨抗原二次刺激引起的细胞增殖(P<0.01);早期IFN-γ分泌增加,2周时IFN-γ和IL-4分泌均明显减少(P<0.05);组织学检查显示,注射IL-4和IL-10后植骨处局部炎细胞浸润减少,诱导成骨增多。而在植入冻干骨的各组中,冻干异种组的细胞刺激反应始终比冻干同种组强(P<0.05),而且其CD4 和CD8 T细胞亚群及IL-2分泌均高于同种异体组(P<0.05)。结论新鲜异种骨移植早期排斥反应强、后期弱,早期以Th2反应为主,而同种异体骨移植免疫排斥以Th1反     

猪骨-rhBMP-2复合重组人工骨的研制及临床应用研究

目的：选择猪骨作为rhBMP-2的载体,经去抗原处理,复合重组人工骨,观察该种人工骨临床应用骨缺损修复,促进骨折愈合及诱导成骨的能力,方法：选择猪骨经透析冻干法脱脂,脱蛋白及部分脱钙处理后与成品rhBMP-2按一定比例组成具有生物活性的猪骨－rhBMP-2复合人工骨,先行动物模型实验,随后以自愿随机的原则,临床应用32例,术后,1,4,8,12周进行X线检查,观察临床表现,功能恢复情况,结果：临床32例,34块骨,35处植入,随访31例,随访率96．7％,最长24个月,最短3个月;骨的愈合及缺损修复满意,临床无不良反应,结论：经透析冻干冻处理的猪骨能成为rhBMP-2的理想载体,与rhBMP－2复合后具有良好的成骨诱导活性,无免疫排斥反应,具有广泛的临床应用前景。     

复合羧甲基纤维素重组合异种骨骨泥的制备

[目的]在制备重组合异种骨的基础上,加入塑型剂,探索其合适的成分比例,研究小牛脱钙骨泥的制备方法。[方法]分别制备小牛松质骨的完全脱钙颗粒和生化方法提取纯化牛骨形态发生蛋白(BMP),通过真空冻干机将松质骨和BMP充分复合后冻干,制成重组合异种骨(RBX)骨粉,按一定比例加入羧甲基纤维素(CMC)作为塑形剂无菌分装,使用时加适量生理盐水或自体血液即制备成骨泥。电镜下观察其孔径、BMP复合情况,大体观察其塑形性。[结果]制备的小牛脱钙骨泥极易塑形,塑形后不易松散,并且具有一定的弯曲强度,一侧应力后材料不会出现裂隙。骨泥复合材料经电镜观察,载体孔隙较多,孔径多在100μm以上,BMP与载体复合良好。[结论]复合BMP小牛脱钙骨泥物理性状稳定,可塑性强,使用方便。骨泥材料经电镜扫描有良好的孔隙结构,BMP与载体复合良好。     

重组合异种骨植骨修复骨囊肿所致骨缺损

2001年10月～2003年9月,笔者共收治28例骨囊肿患者,均采用病灶刮除,瘤腔灭活和重组合异种骨植骨治疗,获得满意疗效,体会如下。     

Treatment of tibial defect and bone nonunion with limb shortening with external fixator and reconstituted bone xenograft

Objective: To explore the effect of external fixator and reconstituted bone xenograft (RBX) in the treatment of tibial bone defect, tibial bone nonunion and congenital pseudarthrosis of the tibia with limb shortening. Methods : Twenty patients ( 13 males and 7 females)with tibial bone defect, tibial bone nonunion or congenital pseudarthrosis of the tibia with limb shortening were treated with external fixation, Two kinds of external fixators were used: a half ring sulcated external fixator used in 13 patients and a combined external fixator in 7 patients.Foot-drop was corrected at the same time with external fixation in 4 patients. The shortened length of the tibia was in the range of 2-9 cm, with an average of 4.8 cm. For bone grafting, RBX was used in 12 patients, autogenous ilium was used in 3 patients and autogenous fibula was implanted as a bone plug into the medullary canal in 1 case,and no bone graft was used in 4 patients. Results: All the 20 patients were followed-up for 8 months to 7 years, averaging 51 months. Satisfactory function of the affected extremities was obtained. All the shortened extremities were lengthened to the expected length. For all the lengthening area and the fracture sites,bone union was obtained at the last. The average healing time of 12 patients treated with RBX was 4.8 months. Conclusions: Both the half ring sulcated external fixator and the combined external fixator have the advantages of small trauma, simple operation, elastic fixation without stress shielding and non-limitation from local soft tissue conditions, and there is satisfactory functional recovery of affected extremities in the treatment of tibial bone defects, tibial bone nonunion and congenital pseudarthrosis of the tibia combined with limb shortening.RBX has good biocompatibility and does not cause immunological rejections. It can also be safely used in treatment of bone nonunion and has reliable effect to promote bone healing.     

Evaluation of a novel reconstituted bone xenograft using processed bovine cancellous bone in combination with purified bovine bone morphogenetic protein

Long B, Dan L, Jian L, Yunyu H, Shu H, Zhi Y. Evaluation of a novel reconstituted bone xenograft using processed bovine cancellous bone in combination with purified bovine bone morphogenetic protein. Xenotransplantation 2012; 19: 122–132. © 2012 John Wiley & Sons A/S. Abstract: Background: Xenogeneic grafting represents an alternative to autogenous grafting in osseous reconstruction and exhibits many beneficial properties. However, the usefulness of xenogeneic bone relies on necessary processing procedures for removing antigens and viruses, and preserving biological activities simultaneously. By chemical treatment of bovine cancellous bone to make it an antigen‐free scaffold, and extraction of bone morphogenetic protein (BMP) from bovine cortical bone, followed by recombination of the scaffold with the BMP, we developed a new grafting material, reconstituted bone xenograft (RBX). Methods: In this study, scanning electron microscope and energy dispersive X‐ray were first employed to observe the structure and components of RBX. Then the biomechanical property was evaluated by applying compression in a materials testing machine. Subsequently, the immunologic evaluation was performed by measuring galactose‐alpha‐1,3‐galactose (α‐gal) epitope in vivo and proinflammatory cytokine (TNF‐α) secreted by human monocytic cell line (THP‐1) in vitro. Finally, this RBX was implanted into segmental radial defects in a rabbit model, and its ability to treat large bone defects was specifically evaluated. Results: Although the compressive strength of RBX was 10% lower than that of unprocessed bovine cancellous bone (UBCB), the basic porous structure and natural components were still kept in this composite. The α‐gal xenoantigen level was significantly lower in RBX (P < 0.05) compared with UBCB. Moreover, the TNF‐α level was significantly (P < 0.05) reduced compared with UBCB when THP‐1 was exposed to RBX. On the other hand, RBX appeared to induce cartilage formation from immature cell populations and resulted in osteogenesis through endochondral‐like ossification from 4 to 12 weeks in repairing segmental bone defects. Conclusions: These results demonstrate that RBX, with its natural microstructure and components, certain mechanical strength and strong osteoinductivity without evoking immune rejection, has significant potential for the treatment of bone defects.     

CTLA4-Ig和IL-4诱导异种骨移植免疫耐受的体外研究

目的探讨CTLA4Ig和IL4在诱导异种骨移植免疫耐受中的作用。方法反应细胞为BALB/c小鼠脾淋巴细胞,刺激细胞为新西兰白兔血淋巴细胞,刺激抗原为兔骨上清液。采用经典的混合淋巴细胞培养法及骨上清液与淋巴细胞混合培养法作为异种骨移植的体外实验模型。在各培养液中分别加入CTLA4Ig、IL4及两者联合应用,通过测定其3HTdR掺入率,观察不同细胞因子对刺激淋巴细胞增殖的影响。结果1细胞刺激组CTLA4Ig和IL4均对淋巴细胞增殖有显著抑制作用P<0.001),CTLA4Ig与IL4联合应用并未显示出比CTLA4Ig单独应用更为明显的细胞增殖抑制作用(P>0.05)。2骨上清液刺激组:CTLA4Ig对细胞增殖无抑制作用(P>0.05),而IL4则有较为显著地细胞增殖抑制作用(P<0.05);CTLA4Ig与IL4联合应用也未产生比单独应用IL4更为明显的细胞增殖抑制作用(P>0.05)。结论CTLA4Ig对由细胞刺激产生的淋巴细胞增殖抑制效果较好,而IL4则对骨上清液刺激的细胞增殖抑制作用更好;CTLA4Ig与IL4联合应用并未产生协同抑制作用。     

庆大霉素重组合异种骨复合体的制备及相关研究

目的研制既有抗感染能力又有较高成骨活性的新型骨移植材料。方法用高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）测定庆大霉素重组合异种骨（ＧＲＢＸ）在小鼠肌袋内药物释放度,并在污染的兔桡骨骨缺损模型中观察其抗感染与骨修复功能。结果明胶包裹４ｍｇ庆大霉素的ＧＲＢＸ具有良好的药物缓释功能,在植入部位周围软组织中维持有效浓度可达１７天,提高明胶浓度能进一步延缓药物释放度。ＧＲＢＸ植入３×１０７ＣＦＵ金葡菌污染的兔桡骨干１．５ｃｍ骨缺损模型可有效抑制感染,１６周后获得完全骨连接。结论局部应用抗生素与骨移植相结合有可能改进开放性骨损伤及感染后骨不连骨缺损的治疗。     

抗感染活性骨治疗慢性血源性骨髓炎临床应用研究

[目的]观察和研究抗感染活性骨(anti-infective reconstituted bone xenograft,ARBX)I期植骨治疗慢性血源性骨髓炎的疗效。[方法]在获得总后卫生部军内临床试用研究许可的基础上,自2001年9月起将ARBX用于临床治疗慢性血源性骨髓炎24例,对其中17例获得12个月以上系统随访的患者进行疗效分析。[结果]17例中除1例骨髓炎未能治愈,1例骨髓炎治愈后复发,1例骨髓炎合并大段骨缺损在术后发生骨不连外;其余14例骨髓炎均获得完全治愈,病变部位均获得确实骨修复,无骨髓炎复发。本组慢性骨髓炎总治愈率为82.4%,远高于传统治疗方法。[结论]ARBX具有高效诱导成骨活性和强效抗感染能力,能I期植骨有效治疗慢性血源性骨髓炎。