PKCγ基因RNAi慢病毒载体的构建

目的 构建蛋白激酶Cγ(PKCγ)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体.方法 针对已经筛选确定的PKCT基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的短发夹RNA(shRNA)寡核苷酸序列(Oligo)DNA,退火形成双链DNA,与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切后的pGCSIL-GFP载体[含U_6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接,转化DH5a大肠杆菌,挑选重组阳性克隆行PCR鉴定和DNA测序.用pGCSIL-GFP、pHelper 1.0和pHelper 2.0三质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒,逐孔稀释滴度法测定病毒滴度.结果 PCR鉴定结果显示,以经双酶切后未插入片断的pGCSIL-GFP空载体(PCR产物为306 bp)为对照,重组细菌克隆的PCR产物为343 bp(插入片段为37 bp),鉴定结果与预期相符.测序结果显示,合成的PKCT基因shRNA寡核苷酸链序列插入正确.包装慢病毒,浓缩慢病毒悬液的滴度为1×10~9 TU/ml.结论 成功构建了PKCT基因shRNA慢病毒载体.     

携带VGLUT3-shRNA重组慢病毒的制备和鉴定

目的 制备携带谷氨酸转运体3( VGLUT3)基因小分子干扰RNA的重组慢病毒.方法 设计合成短发卡RNA (shRNA) VGLUT3对应的两条互补的寡核苷酸链,mU6-MCS-Ubi-EGFP质粒经Hpa Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切与退火后的寡核苷酸连接,目的质粒转化感受态细胞,对克隆的菌落行聚合酶链反应(PCR)鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序,测序正确的重组质粒转染293细胞,同源重组产生Lentivirus-VGL UT3-shRNA并测定病毒滴度.结果 病毒滴度为1.5 × 109 TU/ml.结论 成功制备携带VGLUT3-shRNA的重组慢病毒.     

负载双片段survivin短发夹状RNA质粒载体的构建与鉴定

目的:设计构建负载双片段survivin短发夹状RNA(shRNA)的质粒载体,为进行前列腺癌(PCa)基因治疗的研究奠定基础。方法:分别设计2条靶向survivin基因的shRNA,克隆至质粒载体中,再分别提取质粒酶切后回收、连接,构建重组质粒,提取重组质粒酶切鉴定、测序分析。结果:负载不同单片段survivinshRNA的质粒载体分别用EcoRⅠ及SacⅠ酶切鉴定,证实设计的2条单片段survivinshRNA已经分别插入目的质粒中;基因重组后,重组质粒载体用BamHⅠ酶切鉴定,证实双片段survivinshRNA均已插入重组质粒载体中;测序结果证实重组质粒载体插入的双片段survivinshRNA序列均正确无误。结论:负载双片段survivinshRNA的RNA干扰重组质粒载体构建成功。     

介导大鼠Ppif基因沉默的慢病毒载体转移质粒的构建及鉴定

目的：构建介导大鼠Ppif基因沉默的慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif,为进一步包装慢病毒载体奠定基础.方法：以大鼠Ppif基因为靶基因,根据RNA干扰（RNAi）序列设计原则,设计4对有小发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,双酶切后定向克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif中,构建4个含靶基因片段的重组慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif,并对质粒进行PCR及测序鉴定.结果：Ppif的短发夹RNA（shR-NA）片段被成功克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,4对插入序列与设计的靶基因片段完全一致.结论：构建了能够表达4个含Ppif靶基因片段的慢病毒载体转移质粒,为进一步包装介导Ppif基因沉默的慢病毒载体奠定了基础.     

大鼠诱导型一氧化氮合酶短发夹环RNA质粒的构建及鉴定

目的：构建编码诱导型一氧化氮合酶（iNOS）Jfl动子的shRNA质粒表达载体。为利用基因激活技术治疗勃起功能障碍的研究做准备。方法：根据大鼠iNOS启动子序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段．退火形成双链并克隆进入载体pDC316-EGFP-U6，构建重组质粒，并进行PCR鉴定以及测序分析。结果：PCR鉴定以及测序证实重组质粒构建成功。结论：成功构建了靶向iNOS基因的shRNA质粒表达载体．为进一步探索勃起功能障碍基因治疗奠定了基础。     

Nogo受体特异性RNA干扰载体合成

目的构建表达Nogo受体(NgR)特异性siRNA199的重组质粒。方法按照Elbashir等设计原则和siRNA表达载体的要求,在合成、筛选出基因沉默效率较高的siRNA199基础上,设计带有BamH I、HindⅢ酶切黏性末靖、终止识别序列和LOOP环的shRNA,并将其克隆入载体pRNAT-U6．1/Neo,构建成NgR特异siRNA199重组质粒,然后进行酶切鉴定及基因测序。结果设计的shRNA成功克隆人载体pRNAT-U6．1/Neo,构建成NgR特异siRNA199重组质粒,酶切鉴定及基因测序表明设计序列完全相符,目的基因序列准确无误。结论重组质粒构建成功,为构建病毒载体及观察重组质粒抑制大鼠NgR基因的表达对脊髓损伤的修复作用奠定了基础。     

携带DNMT3b—shRNA干扰序列真核表达载体的构建及筛选

目的：构建携带针对靶基因DNA甲基转移酶3b（DNA methyltransferase 3b,DNMT3b）mRNA的shRNA真核表达载体,并从构建成功的重组质粒中筛选出沉默效应最强的干扰质粒。方法：以基因DNMT3bmRNA为靶序列设计三条shRNA序列,应用基因重组技术将其克隆到真核表达载体pGensil-1中,构建重组质粒pGensil-1-DNMT3b-shRNA1、pGensil-1-DNMT3bshRNA2、pGensil-1-DNMT3b—shRNA3;经酶切鉴定和测序分析后,将重组质粒分别转染T24细胞中,应用RT—PCR和Western—blot检测各组质粒对DNMT3bmRNA和蛋白的表达抑制情况,并筛选最有效的干扰序列。结果：各重组质粒经酶切鉴定和测序分析显示插入完全正确。RT—PCR结果经图像分析,shRNA1、shRNA2和shRNA3对DNMT3bmRNA的抑制率分别为20．44％、79．91％和54．48％;Western blot结果经图像分析,shRNA1、shRNA2和shRNA3对DNMT3b蛋白的抑制率分别为17．27％、77．74％和56．79％。结论：成功构建了质粒pGensil-1-DNMT3bshRNA（1,2,3）,并筛选出pGensil-1-DN—MT3bshRNA2为沉默效应最强的质粒。     

NYD-SP5基因发夹结构小干扰RNA真核表达载体的构建

目的:NYD-SP5基因是在人睾丸cDNA微阵列差异杂交的基础上,克隆的一个新的成人睾丸高度表达的基因。它由3598个核苷酸组成,包括一个编码1027个氨基酸的开放阅读框架。NYD-SP5基因是一条人-小鼠同源基因。结构域分析推测NYD-SP5蛋白是一种跨膜蛋白。本研究构建NYD-SP5基因发夹结构小干扰RNA(shRNA)表达质粒,拟为下一步建立基因NYD-SP5的转基因小鼠模型及研究该基因的功能奠定基础。方法:根据NYD-SP5基因mRNA序列,设计有小发夹结构的4条寡核苷酸序列,克隆到空载体pGPU6/GFP/Neo中,构建重组质粒,同时设计构建分别针对人GAPDH的干扰质粒作为阳性对照,不针对任何特异基因的质粒作为阴性对照。通过酶切鉴定和测序验证阳性克隆。结果:经重组质粒筛选及测序鉴定证实,重组质粒与设计的shRNA转录模板序列相同,提示重组质粒构建成功。结论:利用RNA干扰技术路线可成功构建NYD-SP5的发夹结构小干扰RNA表达载体。     

pSIREN-survivin/shRNA表达载体的构建与鉴定

目的：构建pSIREN-survivin/shRNA重组质粒并鉴定, 为探索瘢痕疙瘩基因治疗的RNA干扰（RNAi）途径奠定基础。 方法：根据基因库survivin cDNA序列及Reynolds设计原则, 设计并合成两端有酶切位点的65个碱基的寡核苷酸链, 退火成互补双链后用T4DNA酶克隆至线性化的RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express质粒中; 转化大肠杆菌DH-5a菌株, 提取质粒行酶切鉴定, 测序分析。 结果：PCR扩增片断出现465 bp大小的目的基因条带与预期结果相符; 双酶切见约65 bp目的基因条带; 插入片断测序结果与合成的寡核苷酸序列一致。 结论：成功构建重组质粒pSIREN-survivin/shRNA, 为下一步用脂质体转染瘢痕或肿瘤细胞的研究奠定基础。     

携带TPH-2基因小分子干扰RNA表达载体的构建与鉴定

目的 构建携带色氨酸羟化酶(TPH)-2基因的小分子干扰RNA表达载体.方法 设计并合成shRNA TPH-2对应的两条互补的寡核苷酸链,pU6-CMV-GFP质粒经Age Ⅰ和EcoRⅠ双酶切与退火后的寡核苷酸连接,目的 质粒转化感受态细胞,对长出的克隆应用菌落聚合酶链反应(PCR)鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析.结果 经PCR、酶切及测序证实,pU6-CMV-GFP-TPH-2 shRNA表达载体片段大小为332 bp,其中插入的片段序列和位点与预期完全一致.结论 实验成功构建pU6-CMV-GFP-TPH2 shRNA表达载体.     

单核细胞趋化蛋白-1小分子干扰RNA真核表达质粒的构建及意义

目的构建单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）小分子干扰RNA（siRNA）表达载体，为进-步研究其对动脉粥样硬化（AS）的防治作用提供手段。方法设计并合成两端含有酶切位点两条DNA序列，经退火成互补双链，再克隆至载体pSilencer2．0-U6中构建重组表达载体，转化DH-5α菌株，提取质粒行双酶切鉴定，并进行序列测定。结果双酶切证实MCP-1siRNA表达载体克隆构建成功，插入片段测序结果与合成的siRNA结果-致。结论成功构建MCP—siRNA表达载体，为动脉粥样硬化的防治奠定实验基础。     

Livin基因siRNA重组表达载体的构建

目的构建针对人抑凋亡基因Livin的小干扰RNA（siRNA）重组表达质粒载体。方法通过分子克隆技术,设计并合成具有基因特异性的3组寡核苷酸片段,克隆到pmU6质粒载体,并经菌落PCR鉴定及测序鉴定,Livin的siRNA序列成功克隆到重组表达质粒载体中。结果经菌落PCR鉴定及测序鉴定证实,人Livin的siRNA序列成功克隆到表达载体中,插入序列正确。结论成功构建了Livin siRNA质粒表达载体,为后续研究降低或沉默Livin基因表达后能否有效抑制膀胱癌细胞增殖和促进细胞凋亡奠定了基础。     

大鼠永生化神经前体细胞CDH1小干扰RNA真核载体的构建

目的 构建大鼠永生化神经前体细胞(INPC)CDH1小干扰RNA(siRNA)真核载体.方法 根据大鼠CDH1基因的编码序列设计3个小发夹RNA(shRNA)干扰序列及1个阴性对照序列,根据pENTR/H1/TO中间载体说明书设计并合成相应的DNA单链,退火后分别连接到pENTR/H1/TO线性载体上,形成完整载体,提取CDH1 siRNA真核载体后(分别为CDH1 siRNA1、CDH1 siRNA2、CDH1siRNA3和CDH1 siRNA对照),进行DNA测序鉴定.采用Lipofectamine 2000法,分别将成功构建的CDH1siRNA真核载体转染大鼠INPC,于转染24 h和48 h时计算INPC转染效率=INPC成功转染数/细胞总数,于转染48 h时提取细胞总RNA,采用实时定量PCR法检测INPC CDH1 mRNA的表达.结果 经DNA测序鉴定构建的3个CDH1 siRNA真核载体和1个阴性对照载体所插入的RNA干扰序列均正确,无碱基突变或缺失;INPC转染24 h与48 h时转染效率分别为(54±5)%和(36±4)%;CDH1 siRNA2转染INPC 48 h时INPC CDH1 mRNA表达水平较CDH1 siRNA3降低,且两者均低于CDH1 siRNA1(P<0.05).结论 本研究成功构建大鼠INPC CDH1 siRNA真核载体.     

shRNA慢病毒表达载体对人结肠癌细胞CXCR7表达的影响

目的 探讨CXCR7的shRNA慢病毒表达载体对人结肠癌细胞HT-29 CXCR7表达的影响.方法 设计CXCR7的3条siRNA的靶点序列,合成含干扰序列的双链DNA发卡结构shRNA,分别与双酶切后的plVTHM载体连接,构建3种重组穿梭质粒plVTHM shRNA1,plVTHM shRNA2和plVTHM shR-NA3,并转化于DH5α感受态细胞,Amp筛选阳性克隆,抽取质粒行酶切鉴定并测序.分别将3种重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,生产慢病毒颗粒,并检测病毒滴度.将3种重组慢病毒及阴性对照病毒分别感染人结肠癌细胞HT-29,实时定量PCR和Western blot分别检测CXCR7 mRNA和蛋白的沉默效果.结果 酶切鉴定及测序结果 证实3种慢病毒载体均包装成功,滴度分别为6×107 TU/mL,4×107 TU/mL和5×107 TU/mL.感染HT-29后,CXCR7 mRNA及蛋白的表达量均较阴性对照组和未感染组明显降低(P＜0.05);其中以LV-CXCR7 shRNA-2和LV-CXCR7 shRNA-3作用显著,mRNA表达分别下调72%和67%,蛋白表达下调68%和55%(P＜0.05);而阴性感染对照组和未感染组相比差异无统计学意义(P＞0.05)结论 成功构建了3种CXCR7 shRNA慢病毒表达,可有效下调HT-29细胞CXCR7mRNA和蛋白的表达,其为进一步研究以CXCR7为靶点的结肠癌基因治疗提供稳定转染细胞的载体奠定基础.     

人膀胱癌bcl-2-siRNA慢病毒载体的构建及稳定转染细胞株的建立

目的 构建表达人膀胱癌bcl-2基因的小分子RNA(siRNA)的慢病毒载体并建立稳定转染细胞株.方法 根据GenBank提供的bcl-2 cDNA序列,设计3条针对bcl-2 siRNA序列,分别构建pSIH1-H1-copGFP重组质粒.筛选出最有效沉默靶基因的siRNA后,将携带目的 序列的慢病毒载体转染到293T细胞中,感染膀胱癌细胞株T24,建立稳定转染细胞株.结果 设计的针对bcl-2的序列中第3条的抑制效果最好,下调59.0%.以此目的 序列构建稳定转染细胞株,对bcl-2 mRNA抑制率达65.6%,对bcl-2蛋白的抑制率高达74.5%.结论 成功构建表达人膀胱癌bcl-2-siRNA的慢病毒载体,它能有效沉默bcl-2基因在膀胱癌细胞株T24中的表达并建立了稳定转染细胞株.

Abstract：

Objective To obtain small interfering RNA (siRNA) sequences that can stably block the expression of bcl-2 in the bladder cancer cells, construct the bcl-2-siRNA lentiviral vector and establish a stably transfected cell line. Methods According to genetic information, 3 siRNA targeting bcl-2 were designed. The corresponding pSIH1-H1-copGFP recombinant plasmids were constructed. After the most effective siRNA was achieved, the shuttle plasmid pSIH-bcl-2-siRNA with lentiviral packaging plasmid was mixed, and 293T cells were transfected. Virus solution was collected to infect T24 cells and a stably transfected cell line was established. Results The third siRNA sequence, located in bcl-2 1210-1228, showed the best gene silencing effect as 59. 0%. The lentiviral vector was constructed successfully and the inhibition ratio was 65. 6% for bcl-2 mRNA and 74. 5% for bcl-2 protein. Conclusion It is successful to obtain bcl-2-siRNA lentiviral vector that can stably block the expression of bcl-2 in the bladder cancer cell line T24 and establish a stably transfected cell line which provides foundation for further experimental studies on the function of bcl-2.     

靶向人SIRT1基因的shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建针对人SIRT1基因的shRNA真核表达质粒,并筛选出对胰腺癌细胞系PANC-1基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体。方法针对SIRT1基因的mRNA序列设计,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经大肠杆菌扩增,酶切,PCR,测序鉴定,转染胰腺癌PANC-1细胞,实时荧光定量PCR和Western blot检测SIRT1 mRNA和蛋白的被抑制情况。结果经测序证实,成功构建SIRT1-shRNA真核表达质粒,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致。重组质粒转染PANC-1细胞后,SIRT1 mRNA和蛋白水平明显下调;其中以1号重组质粒效应最强。结论成功构建了携带以SIRT1为靶向的shRNA的重组质粒。其对胰腺癌PANC-1细胞SIRT1的表达具有显著抑制效应。该实验为进一步研究SIRT1的功能和肿瘤的基因治疗提供了实验基础。