核蛋白14对黑素瘤新生血管形成的影响及机制研究

目的 分析核蛋白14 （NOP14）对黑素瘤血管形成的影响。方法 收集2016年1月至2018年12月在广州市第一人民医院经病理确诊的40例黑素瘤患者的黑素瘤组织,免疫组化检测NOP14和CD31［以微血管密度（MVD）表示］的表达。将黑素瘤细胞A375和SK-MEL-1细胞分别分为4组,分别转染空载体（空载体组）、NOP14过表达载体（NOP14组）、靶向NOP14的siRNA（siNOP14组）和阴性对照siRNA（siNC组）。荧光定量PCR和Western印迹检测各组NOP14 mRNA和蛋白的表达,Western印迹和ELISA检测细胞及其培养基中血管内皮生长因子（VEGF）和血管内皮生长因子受体（VEGFR）的表达。利用Transwell小室构建以上各组A375、SK-MEL-1细胞与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）共培养模型,利用CCK8、Transwell小室和Matrigel血管拟态实验检测共培养后各组HUVEC的增殖、迁移、侵袭和管腔形成能力。采用线性回归模型分析黑素瘤组织中NOP14表达水平与MVD的关系,多因素方差分析检验细胞增殖活性的差异,其余实验指标的两组之间比较采用独立样本t检验。结果 NOP14高表达组（20例）黑素瘤组织MVD为44 ± 13,中表达组（17例）为58 ± 16,低表达组（3例）为62 ± 11,且NOP14表达和MVD呈负相关（r = -0.525,P = 0.017）。与空载体组相比,NOP14组A375和SK-MEL-1细胞及培养基中VEGF和VEGFR的表达水平均显著降低（P < 0.05）。与siNC组相比,siNOP14组A375和SK-MEL-1细胞及培养基中VEGF和VEGFR的表达水平均显著升高（P < 0.05）。在A375与HUVEC共培养模型中,与空载体共组相比,NOP14组HUVEC的增殖活性（F = 131.85,P < 0.05）和迁移细胞数［22 ± 5比63 ± 8,t = 7.07,P = 0.002）、侵袭细胞数（14 ± 5比45 ± 10,t = 4.94,P = 0.008）及分支节点数（8 ± 2比14 ± 3,t = 5.06,P < 0.001）均显著下降;与siNC组相比,siNOP14组HUVEC的增殖活性（F = 79.92,P < 0.01）和迁移细胞数（152 ± 30比59 ± 4,t = 5.36,P = 0.006）、侵袭细胞数（134 ± 21比50 ± 8,t = 6.40,P < 0.001）及分支节点数（27 ± 3比15 ± 4,t = 6.10,P < 0.001）显著升高。在SK-MEL-1细胞与HUVEC共培养模型中,各组HUVEC的增殖、迁移和侵袭活性以及管腔形成能力和与各组A375细胞共培养的HUVEC变化趋势一致。结论 黑素瘤组织中 NOP14表达和MVD呈负相关,NOP14具有抑制黑素瘤血管新生的作用。     

核转录因子E2F6通过β联蛋白信号通路调控恶性黑素瘤细胞增殖和转移的机制研究

【摘要】 目的 研究核转录因子E2F6在人恶性黑素瘤组织和细胞系中的表达,及其对恶性黑素瘤细胞A375增殖、迁移和侵袭的影响。方法 收集重庆市中医院2012年1月至2017年12月皮肤科确诊的50例皮肤恶性黑素瘤和30例色素痣冻存组织及石蜡切片。通过 qRT-PCR分析 E2F6 mRNA在人恶性黑素瘤和色素痣组织及7株恶性黑素瘤细胞系（HM、A375、WM451、WM35、SK-MEL-1、Hs-695T、MDA-MB-435s）和色素痣细胞中的表达,免疫组化和Western印迹检测E2F6、β联蛋白在人恶性黑素瘤组织中的表达。采用脂质体转染法将E2F6抑制质粒和对照质粒转染至A375细胞,通过qRT-PCR和Western印迹验证E2F6基因的敲减效率。通过CCK8、软琼脂平板克隆实验、Transwell迁移和侵袭实验、3D细胞培养实验检测E2F6基因敲减对A375细胞增殖、迁移和侵袭的影响,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率,通过Western印迹检测总β联蛋白、活化β联蛋白、c-Myc和细胞周期蛋白D1等水平。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验;采用Pearson相关系数分析皮肤恶性黑素瘤中E2F6和β联蛋白表达的相关性。结果 7株恶性黑素瘤细胞系E2F6 mRNA相对表达水平均高于色素痣细胞（均P < 0.001）。qRT-PCR显示,皮肤恶性黑素瘤组织中E2F6 mRNA的相对表达（0.000 55 ± 0.000 17）高于色素痣组织（0.000 18 ± 0.000 09,t = 3.22,P < 0.001）。免疫组化、Western印迹显示,皮肤恶性黑素瘤组织中E2F6的相对表达水平高于色素痣组织（均P < 0.001）,而β联蛋白的相对表达水平低于色素痣组（均P < 0.001）。相关性分析显示,恶性黑素瘤组织中E2F6蛋白与β联蛋白的表达呈负相关（免疫组化：r = -0.56,Western印迹：r = -0.63,均P < 0.01）。敲减A375细胞E2F6基因后,E2F6抑制组E2F6 mRNA、蛋白相对水平低于对照组（t = 3.38、2.76,P < 0.001）。CCK-8实验显示,继续培养后48 h,E2F6抑制组细胞增殖能力低于对照组（t = 4.58,P < 0.01）;软琼脂平板实验显示,E2F6抑制组细胞相对克隆比低于对照组（t = 2.26,P＜0.001）;迁移实验显示,E2F6抑制组穿出小室细胞数（165 ± 23）低于对照组（376 ± 22,t = 3.14,P < 0.01）;侵袭实验显示,E2F6抑制组穿出小室细胞数（96 ± 11）低于对照组（315 ± 31,t = 2.12,P < 0.01）;3D细胞培养实验显示,E2F6抑制组细胞形态发生明显变化,侵袭性伪足消失。流式细胞仪检测显示,E2F6抑制组G0 - G1期细胞比例、细胞凋亡率均高于对照组（均P < 0.001）。Western印迹显示,E2F6抑制组β联蛋白水平、活化β联蛋白水平及其下游靶基因蛋白c-Myc、细胞周期蛋白D1水平均低于对照组（P < 0.001）,P21蛋白水平高于对照组（P＜0.001）;E2F6抑制组上皮-间质转化相关分子波形蛋白、神经钙黏着蛋白水平低于对照组（P < 0.001）,而上皮钙黏着蛋白水平高于对照组（P < 0.001）。结论 核转录因子E2F6在恶性黑素瘤中高表达,敲减A375细胞E2F6基因可能通过拮抗β联蛋白信号抑制细胞增殖、迁移和侵袭。     

miR-203调控锌指蛋白281表达对黑素瘤细胞增殖、迁移的影响

【摘要】 目的 初步探究微小RNA-203（miR-203）调控锌指蛋白281（ZNF281）对黑素瘤细胞增殖、迁移的影响。方法 常规培养人血管内皮细胞系ECV304、人黑素瘤细胞系A375、M14、SK-MEL-28、SK-MEL-2,实时荧光定量PCR检测各细胞系中miR-203表达情况,Western免疫印迹法检测各细胞系中ZNF281蛋白水平。A375、M14细胞分别分为5组：对照组（细胞正常培养）、miR-203模拟物对照组（加入miR-203模拟物阴性对照）、miR-203抑制剂对照组（加入miR-203抑制剂阴性对照）、miR-203模拟物组（加入miR-203模拟物）、miR-203抑制剂组（加入miR-203抑制剂）。实时荧光定量PCR检测各组A375、M14细胞中miR-203的表达,CCK8法检测各组A375、M14细胞增殖活性,Transwell实验检测各组A375、M14细胞迁移数量,Western免疫印迹法检测各组A375、M14细胞中ZNF281蛋白的表达。双荧光素酶验证miR-203与ZNF281的靶向关系。多组比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q法。结果 与血管内皮细胞系ECV304相比,黑素瘤细胞系A375、M14、SK-MEL-28、SK-MEL-2中miR-203表达水平较低（均P < 0.05）,ZNF281蛋白水平较高（均P < 0.05）。与对照组、miR-203模拟物对照组、miR-203抑制剂对照组相比,miR-203模拟物组A375、M14细胞中miR-203水平均显著升高（F = 487.632、68.454,均P < 0.05）,细胞迁移数量均显著降低（均P < 0.05）,ZNF281蛋白表达均显著降低（均P < 0.05）;miR-203抑制剂组A375、M14细胞中miR-203表达均显著降低（均P < 0.05）,细胞迁移数量均显著增加（均P < 0.05）,A375细胞中ZNF281蛋白表达显著升高（均P < 0.05）,36、48、60、72 h A375细胞增殖活性显著升高（均P < 0.05）,24、36、48、60、72 h M14细胞增殖活性均显著升高（均P < 0.05）。miR-203与ZNF281之间存在靶位点。结论 上调miR-203表达可抑制黑素瘤细胞增殖、迁移,下调miR-203表达可促进黑素瘤细胞增殖、迁移,可能通过调控ZNF281的表达实现。     

RNA干扰趋化因子受体CXCR7基因对黑素瘤M14细胞侵袭和迁移的影响

目的 探讨靶向沉默趋化因子受体CXCR7基因对黑素瘤细胞株M14侵袭和迁移能力的影响。方法 采用Western印迹实验检测黑素瘤M14和A375细胞CXCR7蛋白的表达,选取高表达CXCR7蛋白的M14细胞作为研究对象。将M14细胞分为实验组、阴性对照组和空白对照组：实验组转染CXCR7-siRNA,阴性对照组转染阴性对照siRNA,空白对照组不做任何处理。采用实时定量PCR和蛋白质印迹法分别检测CXCR7 mRNA和蛋白在M14细胞中的表达水平, Transwell小室法及细胞划痕法检测干扰前后细胞侵袭及迁移能力的变化。 结果 实验组M14细胞CXCR7 mRNA及蛋白相对表达量分别为0.412 ± 0.023、0.144 ± 0.005,明显低于阴性对照组（1.211 ± 0.117、1）以及空白对照组（1.000 ± 0.102、1.016 ± 0.004）,差异均有统计学意义（F值分别为30.068、11 485.5,P值分别为0.001、0.000）。实验组M14细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数为（20.617 ± 1.503）个,明显少于阴性转染对照组［（42.000 ± 6.018）个］和空白对照组［（43.627 ± 2.152）个］,3组间比较差异有统计学意义（F = 32.416,P = 0.001）。划痕实验中,实验组每高倍视野（× 200）下细胞迁移数为15.00 ± 1.10,明显少于阴性对照组（44.90 ± 2.20）和空白对照组（45.30 ± 2.30）,3组间比较差异有统计学意义（F = 2 411.945,P = 0.000）。 结论 靶向沉默CXCR7能显著抑制黑素瘤M14细胞的侵袭和迁移,有望为皮肤黑素瘤提供潜在的治疗靶点。     

抑癌基因DKK3过表达抑制人皮肤黑素瘤细胞迁移和侵袭的机制探讨

目的 探讨DKK3 在人皮肤恶性黑素瘤细胞及组织中的表达及转染DKK3对人黑素瘤细胞A375迁移与侵袭的影响。方法 通过Western印迹法分析DKK3在人黑素瘤细胞系（HM、A375、WM451、SK?MEL?1、Hs?695T、MDA?MB?435s、WM35）及色素痣细胞中的表达,实时荧光定量PCR检测2014 年8月至2017年6月在重庆市中医院皮肤科收集的58例恶性黑素瘤（包括原发性黑素瘤与转移性黑素瘤）和30例色素痣组织中DKK3 mRNA的相对表达水平。分别转染pcDNA3.1（+）?Flag?Vector质粒（对照组）和pcDNA3.1（+）?Flag?DKK3 质粒（转染组）至恶性黑素瘤 A375 细胞中,通过实时荧光定量PCR和Western印迹法验证 DKK3 的过表达,及DKK3过表达对黑素瘤细胞迁移和侵袭相关的分子表达水平的影响;通过细胞平板划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验分析DKK3对A375细胞迁移及侵袭的影响。采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,两独立样本间的比较采用t检验;多组数据的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD?t检验。结果 DKK3蛋白在人黑素瘤细胞系中表达缺失或低表达,在色素痣组织中高表达。原发性黑素瘤、转移性黑素瘤与色素痣中DKK3 mRNA表达水平（2?ΔΔCt）分别为（0. 325 ± 0.150） × 10?3、（0. 142 ± 0.210） × 10?3、（0. 634 ± 0.120） × 10?3,差异有统计学意义（F = 46.57,P < 0.05）,转移性黑素瘤表达水平低于原发性黑素瘤和色素痣 （LSD?t分别为2.48、3.12,均P < 0.05）。A375 细胞转染DKK3后,细胞划痕迁移率（22.11% ± 5.11%）低于对照组（54.36% ± 23.22%）（t = 2.36,P < 0.001）;迁移及侵袭实验中,转染组穿出小室细胞数（265 ± 33、76 ± 18）低于对照组（429 ± 41、135 ± 21）,差异有统计学意义（t值分别为1.24、1.35,均P < 0.001）。转染组A375细胞过表达DKK3后,上皮钙黏着蛋白和mRNA表达上升,神经钙黏着蛋白、波形蛋白、基质金属蛋白酶2（MMP2）、MMP7、MMP11蛋白和mRNA的表达下降。结论 DKK3在黑素瘤细胞系和组织中表达下调,DKK3过表达后A375 细胞的迁移和侵袭受到明显抑制,DKK3可能是抑制皮肤恶性黑素瘤转移的靶点。     

泛素结合酶2S在恶性黑素瘤中的表达及其对黑素瘤细胞生物学行为的影响

【摘要】 目的 探讨恶性黑素瘤（MM）组织中泛素结合酶2S（UBE2S）的表达及其对黑素瘤细胞生物学行为的影响。方法 应用免疫组化检测UBE2S在128例原发性MM、64例转移性MM、16份非瘤组织（8份瘤旁组织、8份正常表皮组织）芯片中的表达。实时定量PCR检测A375、MUM?2B及MUM?2C黑素瘤细胞株中UBE2S mRNA表达水平。将黑素瘤A375及MUM?2B细胞株分别分为两组,干扰组使用含有UBE2S RNA干扰序列的慢病毒转染,对照组使用含有对照序列的慢病毒转染, 72 h后实时定量PCR检测 A375和MUM?2B黑素瘤细胞株中UBE2S mRNA表达水平。用试剂盒检测各组细胞caspase3/7活性,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率及周期分布;应用Transwell法及Western印迹分别检测敲减UBE2S对A375细胞迁移侵袭能力及N-钙黏蛋白表达的影响。使用SPSS 22.0软件进行统计学分析,正态分布数据组间比较采用独立样本t检验,计数资料采用卡方检验,非正态分布数据比较采用Mann?Whitney U检验,通过Spearman系数评估UBE2S表达水平与T分期的相关性。结果 UBE2S在98例（51.0%）MM组织中高表达,16例非瘤组织中均低表达,两组间高表达率差异有统计学意义（χ2 = 11.905,P＜0.01）;UBE2S表达水平与肿瘤T分期呈负相关（ρ = -0.210,P = 0.043）。A375、MUM?2B、MUM?2C细胞间UBE2S mRNA相对表达量差异有统计学意义（F = 817.228,P＜0.01）。Caspase3/7活性在干扰组A375细胞（t = 17.572,P＜0.01）与干扰组MUM?2B细胞（t = 24.552,P＜0.01）分别较相应对照组明显增加;干扰组A375细胞较对照组G1期细胞比例明显升高（t = 7.365,P＜0.01）,而S期比例明显降低（t = -9.190,P＜0.01）,G2/M期无明显变化（t = -0.227,P＞0.05）;干扰组MUM?2B细胞G1期（t = 12.676,P＜0.01）、G2/M期（t = 13.045,P＜0.01）细胞比例高于对照组,但S期比例低于对照组（t = -15.718,P＜0.01）。Transwell实验显示,干扰组较对照组A375细胞迁移（t = -35.727,P＜0.05）及侵袭（t = -125.000,P＜0.01）能力降低。Western印迹检测显示,干扰组较对照组A375细胞N-钙黏蛋白表达下调。结论 UBE2S在黑素瘤组织过表达,其表达水平与肿瘤分期相关;敲减UBE2S对黑素瘤细胞凋亡、细胞周期、细胞迁移及侵袭能力均有影响,并且可能通过调控N-钙黏蛋白表达促进MM细胞转移。     

Lyn抑制剂Bafetinib对恶性黑素瘤细胞株UACC62增殖和凋亡的影响

目的：明确Lyn抑制剂Bafetinib对恶性黑素瘤细胞株UACC62增殖和凋亡的影响。方法：体外培养UACC62细胞，用不同浓度的Bafetinib处理，应用CCK-8实验和克隆形成实验检测细胞增殖能力，观察Bafetinib的效应以及是否具有剂量依赖性，并选择出合适的浓度进一步实验。Western blot检测Lyn、凋亡相关蛋白（Bax、Beclin、Bcl-2）及信号转导通路蛋白的表达。结果：Bafetinib能够抑制黑素瘤细胞UACC62的活力，并呈一定的剂量依赖性；Bafetinib处理组细胞的OD值为1.05±0.08，低于对照组的2.04±0.07 ( P＜0.05)；Bafetinib处理组细胞克隆数为49±8.53，低于对照组的288±7．68( P＜0.05)。Bafetinib处理组细胞中P-ERK、Beclin1、Bax、Bcl-2、Lyn蛋白的表达量分别是对照组的0.30，3.25, 2.23，0.53, 0.29倍( P＜0.05)。结论：Lyn抑制剂Bafetinib能够抑制恶性黑素瘤细胞UACC62的增殖，并通过ERK信号通路诱导细胞凋亡。     

沉默ATAD3A对黑素瘤A375细胞增殖、侵袭和迁移的影响及机制研究

【摘要】 目的 探讨沉默三磷酸腺苷酶家族蛋白3A（ATAD3A）对黑素瘤A375细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法 2019年8 - 12月在重庆市渝北区人民医院收集经病理确诊的3例黑素瘤患者的黑素瘤组织及癌旁组织 ，应用Western印迹检测ATAD3A在上述组织中的表达。分别采用沉默ATAD3A慢病毒和空载慢病毒感染黑素瘤A375细胞系，构建沉默ATAD3A（shATAD3A）实验组和空载对照（shCtrl）组，经实时荧光定量聚合酶链反应（qRT?PCR）和Western印迹验证干扰效率。采用CCK?8实验、克隆形成实验比较两组细胞的增殖能力和克隆形成能力，采用Transwell细胞侵袭实验、划痕实验比较两组细胞的侵袭、迁移能力，采用Western印迹检测两组细胞自我更新相关蛋白（NANOG、SOX2、OCT4）和侵袭、迁移相关蛋白［基质金属蛋白酶2（MMP2）、波形蛋白、SLUG］的表达水平。两组间各指标的比较采用独立样本t检验。结果 Western印迹显示，相对于癌旁组织，ATAD3A在3例黑素瘤组织中高表达（t = 10.825，P < 0.001）。qRT?PCR和Western印迹显示，shATAD3A组A375细胞ATAD3A mRNA为0.230 ± 0.073，shCtrl组为1.000 ± 0.244，两组比较，t = 9.461，P < 0.001，蛋白表达水平分别为0.279 ± 0.267和0.867 ± 0.115，t = 8.595，P = 0.002， 表明成功构建沉默ATAD3A的黑素瘤A375细胞系。克隆形成实验和CCK?8实验显示，shATAD3A组克隆形成率低于shCtrl组（22.667% ± 2.510%比43.667% ± 5.030%，t = 6.464，P = 0.003），且细胞增殖活性自第2天开始直至第4天均显著低于shCtrl组。划痕实验及Transwell细胞侵袭实验显示，与shCtrl组相比，shATAD3A组划痕愈合减慢，划痕愈合率自第12 h开始（32.920% ± 4.642%比49.302% ± 1.448%，t = 5.835，P = 0.004）至24 h明显降低，通过Transwell小室下室的侵袭细胞数减少（68.330 ± 13.050比234.330 ± 19.139，t = 12.411，P < 0.001）。Western印迹显示，shATAD3A组细胞NANOG、SOX2、OCT4、MMP2、波形蛋白、SLUG的表达水平均显著下降（P < 0.05或0.001）。结论 ATAD3A在黑素瘤组织中高表达，沉默ATAD3A能抑制黑素瘤A375细胞的增殖、侵袭和迁移能力。     

siRNA干扰Gadd45α表达对皮肤鳞状细胞癌A431细胞侵袭和迁移的影响北大核心CSCD

目的探讨靶向沉默生长抑制和DNA损伤诱导45蛋白α（Gadd45α）对皮肤鳞状细胞癌（简称鳞癌）细胞株A431侵袭和迁移的影响。方法采用实时荧光定量PCR、Western印迹检测A431和Colon16细胞Gadd45α基因和蛋白的表达,选取高表达Gadd45α的A431细胞株作为研究对象。将A431细胞分为实验组、阴性对照组和空白对照组：实验组转染Gadd45α-siRNA-1,阴性对照组转染阴性对照siRNA,空白对照组不做任何处理。采用实时荧光定量PCR和Western印迹法分别检测干预后Gadd45αmRNA和蛋白的表达,Transwell小室法及细胞划痕法检测干预对A431细胞株侵袭及迁移能力的影响。结果A431细胞高表达Gadd45α基因和蛋白。干预后实验组A431细胞Gadd45αmRNA及蛋白相对表达量分别为0．286±0．013、0．33±0．007,明显低于阴性对照组组（1．028±0．183、0．87±0．002）以及空白对照组（1．001±0．057、0．86±0．004）,差异均有统计学意义（F值分别为5893．857、2763．000,均P〈0．001）。实验组A431细胞株穿过聚碳酸酯膜的细胞数为66．33±3．79,明显多于阴性对照组（26．00±4．36）和空白对照组（28．33±4．16）,3组间差异有统计学意义（F=20．084,P=0．002）。划痕实验中,实验组每高倍视野下细胞迁移数为315．33±6．66,明显多于阴性对照组（154．67±2．08）和空白对照组（130．67±3．51）,3组间差异有统计学意义（F=1676．255,P〈0．001）。结论A431细胞株高表达Gadd45α,靶向沉默Gadd45α表达能增强A431细胞株的侵袭和迁移能力。     

2-甲氧基雌二醇对恶性黑素瘤B16细胞株增殖与凋亡的影响北大核心CSCD

目的 探讨2-甲氧基雌二醇（2-ME）对小鼠恶性黑素瘤B16细胞增殖与凋亡的影响,并初步探讨其机制.方法 选用小鼠B16细胞进行体外培养,实验分为阴性对照组和药物处理组,药物处理组加入2-ME,使其终浓度分别为5、10、20、40 μmol/L,阴性对照组不加2-ME.作用不同时间后,倒置相差显微镜下观察细胞形态变化;根据磺酰罗丹明B方法测得的各组A490值绘制生长曲线;采用磺酰罗丹明B法检测黑素瘤细胞活性;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡;逆转录PCR和实时PCR法分析凋亡诱导基因（gadd45b）及原癌基因（c-myc）的表达情况.结果 重复测量的方差分析显示,5、10、20、40 μmol/L的2-ME作用于黑素瘤细胞不同时间后对其增殖的抑制作用差异有统计学意义（F=1170.94,P＜ 0.01）;上述浓度的2-ME作用24、48、72 h对黑素瘤细胞增殖的抑制作用差异亦有统计学意义（F=1843.04,P＜ 0.01）;药物浓度和培养时间存在交互作用（F=272.79,P＜ 0.01）.10、20、40μmol/L 2-ME作用48 h后,B16细胞的凋亡率分别上升至（4.13±1.12）％、（11.25±2.38）％、（19.46±2.9）％,与阴性对照组[（0.23±0.5）％]相比,差异均有统计学意义（P＜0.01）;细胞出现G0/G1期阻滞,对照组细胞、10、20、40 μmol/L 2-ME处理组细胞G0/G1期比例分别为（44.1±3.4）％、（59.5±5.6）％、（63.4±8.2）％、（70.8±4.4）％,且随着浓度的增加,G0/G1期细胞明显增加,各处理组及对照组间比较,G0/G1期细胞比例差异有统计学意义（F=13.56,P＜ 0.05）.与阴性对照组相比,20 μmol/L和40 μmol/L 2-ME作用24 h可升高gadd45b的表达（均P＜ 0.01）,10、20、40μmol/L 2-ME均可降低c-myc基因的表达,差异均有统计学意义（均P＜0.05）.结论 2-ME在体外能够抑制小鼠恶性黑素瘤B16细胞的增殖,能够使c-myc基因的表达降低,使gadd45b基因的表达升高.     

生存素小分子干扰RNA对皮肤鳞状细胞癌A431细胞生存素基因表达及生物学功能的影响

目的 探讨生存素小分子干扰RNA（siRNA）对皮肤鳞状细胞癌A431细胞生存素基因表达及细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭力的影响。方法 培养的A431细胞分为3组：生存素siRNA组、阴性对照组和空白对照组,分别用50.0 nmol/L脂质体包裹的生存素基因序列特异性siRNA、无关序列siRNA阴性脂质体及预制囊泡转染。实时定量反转录-聚合酶链反应（RT?PCR）、Western印迹法分别检测A431细胞生存素mRNA及蛋白的表达。采用MTT比色法检测细胞增殖,流式细胞仪膜联蛋白Ⅴ/碘化丙锭双染法检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭力,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果 转染后48 h,生存素siRNA组、阴性对照组、空白对照组A431细胞中生存素mRNA水平分别为0.56 ± 0.15、0.88 ± 0.37、0.90 ± 0.43,蛋白表达水平分别为0.59 ± 0.04、0.86 ± 0.05、0.91 ± 0.07,差异均有统计学意义（F = 276.67、243.61,均P < 0.001）,且生存素siRNA组生存素mRNA和蛋白表达水平均显著低于阴性对照组和空白对照组,差异均有统计学意义（P < 0.05）,而阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义（均P > 0.05）。重复测量方差分析显示,转染生存素siRNA能抑制A431细胞增殖（F = 13.19,P = 0.004）,且生存素siRNA组A431细胞增殖抑制率明显高于阴性对照组和空白对照组（均P < 0.05）,而阴性对照组与空白对照组比较,差异无统计学意义（P > 0.05）。转染后24 h, 3组间A431细胞凋亡率差异有统计学意义（F = 83.97,P = 0.002）,且生存素siRNA组A431细胞凋亡率显著高于阴性对照组（P < 0.05）和空白对照组（P < 0.05）,而阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义（P > 0.05）。转染后48 h,生存素siRNA组G2/M期细胞比例显著高于阴性对照组（P < 0.05）和空白对照组（P < 0.05）,而生存素siRNA组A431细胞迁移数及侵袭数均显著低于空白对照组（均P < 0.05）和阴性对照组（均P < 0.05）。结论 生存素序列特异性siRNA能抑制A431细胞生存素基因表达和细胞增殖,促进细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭,提示生存素可成为皮肤鳞状细胞癌基因治疗的靶点。     

过表达Beclin1可促进黑色素瘤A375细胞的自噬并抑制其上皮间质转化

目的 探讨Beclin1的过表达对黑色素瘤A375细胞自噬及EMT过程的影响。方法 采用脂质体转染法将人恶性黑色素瘤细胞A375分为3组,分别为空白组(只转染试剂,无质粒)、NC组(转染空质粒)、转染组(转染携带Beclin1质粒),3组细胞分别接种于3组裸鼠皮下,观察成瘤后21 d各组移植瘤的生长情况。采用RT-PCR和Western blotting分别检测各组肿瘤组织中Beclin1、LC3Ⅱ、Vimentin、N-cadherin和E-cadheirn mRNA及蛋白表达水平。结果 3组接种A375细胞的裸鼠成瘤率100%,转染组肿瘤生长速度低于空白组和NC组,差异具有统计学意义(P<0.05);RT-PCR结果显示,空白组与NC组比较,各基因mRNA的表达无明显差异(P>0.05);相对于空白组与NC组,转染组Beclin1、LC3Ⅱ和E-cadherin的mRNA表达均升高,Vimentin和N-cadherin的mRNA表达均降低,差异具有统计学意义(均P<0.05)。Western blotting结果显示,空白组与NC组比较,各基因蛋白的表达无明显差...     

HPV16E7靶向小干扰RNA对SiHa细胞增殖凋亡及6种抑癌基因的影响

目的：探讨HPV16E7在SiHa细胞株中对抑癌基因（MT1G、NMES1、RRAD、SFRP1、SPARC、TFPI2）的表达及细胞增殖能力和凋亡水平的影响。方法 SiHa细胞转染E7SiRNA 48 h后,qPCR检测E7及6种抑癌基因mRNA水平变化,CCK?8检测细胞增殖能力改变,流式细胞仪检测细胞凋亡水平。结果 SiHa细胞转染后48 h,qPCR结果显示实验组E7 mRNA显著降低（0.25±0.036,P<0.05）;6种抑癌基因的mRNA水平均显著增加（MT1G 1.403±0.190、NMES11.720±0.060、RRAD 1.390±0.160、SFRP11.493±0.120、SPARC 2.157±0.144、TFPI22.060±0.122,P<0.05）。细胞增殖结果显示,与阴性对照组及空白组比较,实验组细胞增殖能力显著降低（0.554±0.130,P<0.05）,阴性对照组和空白组之间差异无统计学意义（P>0.05）。细胞凋亡结果提示,实验组细胞凋亡细胞频率为9.222%较阴性对照组（0.246%）及空白组（0.123%）明显增加（P<0.05）,空白组与阴性对照组差异无统计学意义（P>0.05）。结论 HPV16导致细胞恶性转化过程中,E7可能通过抑制（MT1G、NMES1、RRAD、SFRP1、SPAR、TFPI2）6种抑癌基因的表达参与作用。     

尖锐湿疣角质形成细胞中陷窝蛋白1的表达与细胞增殖和凋亡的相关性

目的 探讨陷窝蛋白1在尖锐湿疣角质形成细胞中的表达及其与角质形成细胞增殖和凋亡的相关性.方法 免疫组化En Vision法和TUNEL技术检测40例尖锐湿疣皮损组织和10例健康人包皮组织中角质形成细胞陷窝蛋白1、增殖细胞核抗原的表达和细胞凋亡,计算陷窝蛋白1平均吸光度、增殖指数和凋亡指数,比较两组之间的差异,并分析尖锐湿疣组中陷窝蛋白1表达与增殖指数、凋亡指数的相关性.针对陷窝蛋白1基因设计3条siRNA,用脂质体转染法将siRNA导人HaCaT细胞,用荧光定量PCR方法筛选出于扰效果最佳的siRNA,转染HaCaT细胞为实验组,转染非特异序列的细胞为阴性对照组,未转染的细胞为空白对照组.Western印迹和免疫荧光检测转染48 h后陷窝蛋白1的表达水平;MTS法分别测定干扰陷窝蛋白1基因24、48、72 h后HaCaT细胞增殖的变化;流式细胞仪(FCM)检测干扰陷窝蛋白1基因48 h后HaCaT细胞的凋亡情况.结果 尖锐湿疣角质形成细胞中陷窝蛋白1的表达(0.042±0.021)显著低于正常包皮组织(0.181±0.075),差异有统计学意义(t=5.843,P＜0.001).尖锐湿疣皮损中角质形成细胞的增殖指数(65.63％±19.86％)和凋亡指数(24.12％±10.86％)均显著高于正常包皮组织(23.51％±4.00％,3.13％±1.12％),两组差异有统计学意义(t=12.440、11.970,均P＜ 0.001).尖锐湿疣组陷窝蛋白1表达与增殖指数呈显著负相关(r=-0.798,P＜0.05),与凋亡指数呈显著正相关(r=0.825,P＜ 0.05).荧光定量PCR显示siRNA-2在浓度25 nmol/L下抑制效果最佳.Western印迹和免疫荧光显示,转染siRNA 48 h后,实验组陷窝蛋白1的表达显著低于空白对照组和阴性对照组(P＜0.05).MTS结果显示,实验组细胞24、48和72 h时的A值分别为0.563±0.013、0.628±0.006和0.811±0.018,高于空白对照组(0.541±0.009、0.575±0.012和0.722±0.004)和阴性对照组(0.536±0.006、0.571±0.015和0.719±0.002),差异有统计学意义(均P＜0.05),空白对照组和阴性对照组间差异无统计学意义(P＞0.05).实验组HaCaT细胞凋亡率为(8.90％±0.06％),低于空白对照组(20.59％±0.87％)和阴性对照组(20.64％±0.09％),差异有统计学意义(均P＜ 0.05),空白对照组和阴性对照组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 尖锐湿疣角质形成细胞中陷窝蛋白1表达下降,可能与角质形成细胞增殖加快、细胞凋亡减少有关.     

转染反义微小RNA-155对人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431生长的影响

目的 观察转染反义微小RNA?155（miRNA?155）对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株增殖、凋亡以及细胞迁移和侵袭的影响。方法 A431细胞分为3组,采用脂质体介导法转染无义序列miRNA?155（无义序列组）、反义序列 miRNA?155（反义序列组）或仅用含Lipofectamine 2000的DMEM（空白对照组）处理。实时定量聚合酶链反应检测转染后各组A431细胞miRNA?155的表达水平,噻唑蓝法检测转染后24、36、72、96、120 h细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期变化和凋亡情况,Transwell法检测细胞迁移与侵袭力。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD?t检验。结果 转染后,无义序列组、反义序列组与空白对照组中A431细胞miRNA?155相对表达量分别为0.98 ± 0.02、0.28 ± 0.18、1.00 ± 0.01,3组差异有统计学意义（F = 634.57,P < 0.001）,反义序列组低于空白对照组和无义序列组,均P < 0.05。孵育72、96、120 h时,3组细胞存活率差异均有统计学意义（均P < 0.05）,反义序列组细胞存活率在3个时间点均低于空白对照组和无义序列组（均P < 0.05）;3组细胞G0/G1期细胞比例、S期细胞比例、细胞增殖指数差异均有统计学意义（F = 23.46、36.81、19.35,P < 0.01）。反义序列组G0/G1期细胞比例（74.63% ± 2.13%）高于空白对照组（62.92% ± 2.56%）和无义序列组（63.75% ± 3.06%）,均P < 0.05;S期细胞比例及细胞增殖指数（9.88% ± 1.83%、25.36 ± 2.13）低于空白对照组（18.86% ± 2.78%、37.08 ± 2.56）和无义序列组（18.33% ± 3.72%、36.25 ± 3.06）,均P < 0.05;反义序列组迁移细胞数和侵袭细胞数低于空白对照组和无义序列组（均P < 0.05）。结论 皮肤鳞状细胞癌A431细胞转染反义miRNA?155可减少miRNA?155的表达,有效抑制A431细胞增殖、迁移、侵袭,促进其凋亡。     

过表达RhoD对人黑素瘤A375细胞骨架和迁移侵袭的影响

目的：探讨RhoD对人黑素瘤细胞株A375细胞骨架、迁移和侵袭能力等的影响及作用机制。方法实验分为A375?RhoD组和A375?增强型绿色荧光蛋白（EGFP）组，分别用携带RhoD的慢病毒载体和阴性对照慢病毒载体转染。罗丹明标记鬼笔环肽染色观察细胞骨架，Transwell小室实验检测细胞的迁移和侵袭能力，流式细胞仪检测细胞周期，Western印迹法检测丝切蛋白、磷酸化丝切蛋白、Diaph2和RhoD的表达。结果与A375?EGFP组细胞相比，A375?RhoD组细胞体积增大，应力纤维变细，软弱无力，黏着斑增多；丝状伪足形成增加；皱褶缘和板状伪足无明显变化。Transwell迁移实验显示，A375?EGFP组和A375?RhoD组平均每200倍视野下穿膜细胞数分别为152.67±11.23和72.67±5.03，两组间差异有统计学意义（t =11.25，P <0.05）。Transwell人工基底膜侵袭试验显示，A375?EGFP组和A375?RhoD组平均每200倍视野下穿膜细胞数分别为78.33±12.34和9.00±1，两组间差异有统计学意义（t=9.70，P<0.05）。A375?EGFP和A375?RhoD两组间G1期、S期和G2期细胞所占百分比差异均无统计学意义（P>0.05）。Western印迹结果显示，A375?RhoD组细胞可在RhoD的刺激下激活下游信号效应分子Diaph2，促进其表达，而A375?EGFP组未能激活，两组间丝切蛋白和磷酸化丝切蛋白表达差异不显著。结论 RhoD过表达可能通过下游效应分子Diaph2调节细胞骨架进而抑制A375细胞的迁移和侵袭能力。     

miRNA211在人皮肤黑素瘤的表达及功能研究

目的 探讨miRNA211（miR?211）在恶性黑素瘤进展过程中的表达以及靶分子MMP?16与miR?211表达的相关关系。方法 实验分阴性对照组、空载体对照组、miR?211过表达组。TaqMan荧光定量PCR检测miR?211在黑素细胞、黑素瘤细胞的表达,以及在痣、黑素瘤组织中的表达。SRB试验和流式细胞仪分别检测细胞增殖和细胞周期分布。甲基纤维素克隆形成试验和Transwell迁移试验研究细胞克隆形成和细胞迁移。用集落大小衡量克隆形成力,而同一迁移距离下的相对细胞数用来衡量细胞迁移能力。TaqMan荧光定量PCR检测比较miR?211表达增加前后MMP?16 mRNA表达的变化。结果 miR?211在黑素瘤细胞G361、C32和A375表达量分别是0.09 ± 0.02,0.000 52 ± 0.000 20,0.000 03 ± 0.000 01（F = 10410,P < 0.01）。miR?211在黑素瘤标本的表达量（0.17 ± 0.03）显著低于痣的表达量（0.87 ± 0.08）,t = 9.118,P < 0.01。在体外,miR?211表达上调的黑素瘤细胞miR?211过表达组与阴性对照组及空载体对照组比较,细胞增殖与细胞周期分布,差异无统计学意义。miR?211过表达组、空载体对照组的克隆形成力分别是0.49 ± 0.05、0.85 ± 0.09,两组比较,差异有统计学意义（t = 2.19,P < 0.05）。miR?211过表达组、空载体对照组的克隆形成力分别是0.49 ± 0.06、0.82 ± 0.09,两组比较,差异有统计学意义（t = 3.15,P < 0.05）。而空载体对照组与阴性对照组比较,差异无统计学意义。转染miR?211 mimics后24 h,在miR?211过表达组和空载体对照组的MMP?16 mRNA水平比较分别是0.33 ± 0.02和0.91 ± 0.03,两组比较,t = 11.30,P < 0.01;48 h分别是0.52 ± 0.01和0.96 ± 0.02,两组比较,t = 5.02,P < 0.05;72 h分别是0.71 ± 0.01和0.97 ± 0.03,两组比较,t = 3.85,P < 0.05。空载体对照组与阴性对照组在3个时间点的比较,差异均无统计学意义。结论 miR?211在恶性黑素瘤的细胞水平和组织水平低表达。miR?211抑制黑素瘤细胞的锚着非依赖性生长及细胞的迁移。miR?211表达上调后,MMP?16 mRNA表达下调,可能是miR?211下游的靶分子从而影响黑素瘤的侵袭转移。