Alu-LTR PCR方法检测HAART治疗系列各细胞亚群的整合型HIV-1 DNA

目的应用Alu-LTR PCR方法对高效抗反转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy,HAART)系列的CD4+T,CD8+T及B细胞进行检测,明确不同细胞亚群及HAART治疗的不同阶段是否存在整合的HIV-1 DNA。方法收集20例HIV-1感染患者HAART治疗过程中0、4、12周及10例健康对照的抗凝血标本,纯化CD4+T,CD8+T及B细胞并提取DNA,应用Alu-LTR PCR方法进行检测。结果 20例HIV-1感染者HAART治疗系列中CD4+T细胞及CD8+T细胞成功扩出目的片段,CD8+T细胞所扩条带亮度均低于CD4+T细胞,HAART治疗系列0、4、12周标本所扩条带亮度没有明显差异。B细胞及10例健康者均为阴性。结论 CD4+T及CD8+T细胞存在整合型HIV-1 DNA,HIV储藏库主要存在于CD4+T细胞内。B细胞内不存在整合型HIV-1 DNA。随着HAART治疗的进程,整合型HIV-1 DNA仍然存在,进一步证明HAART不能根除HIV储藏库。     

扩增潜伏HIV-1 DNA序列实验方法的优化

目的对PCR扩增潜伏HIV-1DNA序列的实验方法进行优化。方法收集30例经高效抗逆转录病毒治疗（HAART）6~12个月的HIV-1感染者抗凝血标本,分别从外周血单个核细胞（PBMC）和高度纯化的CD4＋T细胞提取基因组DNA,巢式PCR扩增HIV-1env的C2-V5区,电泳检测扩增产物并进行DNA序列测定。结果同一患者PBMC纯化CD4＋T细胞标本扩增HIV-1env基因C2-V5区的效率（93.3%）明显高于直接从PBMC标本扩增该目的片段的效率（10.0%）。结论 PBMC纯化CD4＋T细胞后,再提取基因组DNA进行巢式PCR扩增,可提高扩增潜伏HIV-1DNA序列的效率。     

建立反向PCR检测HIV-1整合位点的方法

高效抗反转录病毒治疗（highly active antiretroviral therapy,HAART）可降低艾滋病的发病率和死亡率,使感染者血浆中HIV-1RNA降至常规方法检测不到的水平,但用敏感度高的方法仍可检测到病毒基因和低水平的病毒复制,这是因为存在HIV-1潜伏库,含有整合HIV DNA的静止性CD4^＋T细胞是最主要的HIV-1潜伏库。     

Alu-反向PCR检测HIV-1整合位点方法的建立

目的建立Alu-反向PCR检测整合型HIV-1DNA的实验方法。方法收集18例HIV-1感染者及12例健康者的抗凝血标本,根据整合型HIV-1DNA的特点设计引物,第一轮PCR5’端引物来自于人类保守的Alu序列,3’端引物来自于HIV-1gag序列,扩增片段包含了整合位点上游的人类基因组DNA序列和整合的HIV-1DNA序列。经PstⅠ酶切后进行自身片段环化,以此为模板设计针对HIV-1LTR和gag保守区域引物,进行巢式PCR。结果 16例HIV-1感染者成功扩增出目的片段,12例健康者均为阴性。结论本实验建立的检测整合型HIV-1的方法为进一步研究HIV病毒储藏库机制提供了参考。     

新诊断HIV-1抗体阳性者的WB带型及首次CD4+T细胞检测分析

目的 分析2016—2018年台山市HIV-1抗体阳性者WB带型及首次CD4⁺T细胞检测结果,探讨新诊断HIV-1抗体阳性者的WB带型分布变化规律。方法 采用WB蛋白印迹法检测HIV-1抗体带型,流式细胞仪检测CD4⁺T细胞,对新诊断患者的WB带型特征及首次CD4⁺T细胞检测结果分析。结果 311例HIV-1抗体阳性者中,不同性别比较WB带型出现率差异无统计学意义, ≥60岁年龄组gag基因编码条带p17的出现率低于其它两个年龄组（P<0.05）,性行为感染者gag基因编码条带p55的出现率低于静脉吸毒感染者(P<0.05), WB条带gp160、gp120、gp41、p66、p51、p31、p24维持较高出现率,全带型、缺失p55、缺失p55+p17的带型是3个不同免疫状况主要带型,在艾滋病期全带型出现率（15.5%）明显降低,缺失p55+p17组在艾滋病期缺失率（31.0%）明显高于其它两组(P<0.05)。结论 HIV-1抗体阳性者WB带型分布在不同年龄、不同传播途径和不同免疫状况的人群间差异有统计学意义,gag带型p55和p17同时转阴与艾滋病发病有关,有助于了解患者的疾病进展。     

外周血HIV-1DNA在艾滋病疗效评估中的应用

目的 通过研究HIV感染者HIV-1 DNA与HIV-1 RNA及CD4+T淋巴细胞间的关系,探讨外周血HIV-1DNA在艾滋病疗效评估中的应用。方法 筛选2018年6—9月贵州省贵阳市公共卫生救治中心的HIV感染者80例,采用面对面问卷调查收集患者资料,并采集患者K2EDTA抗凝血,完成CD4+T淋巴细胞、HIV-1 RNA及HIV-1 DNA的检测并得出结果。通过SPSS等软件分析HIV感染者的病毒库水平,以及HIV-1 DNA与HIV临床分期、CD4+T淋巴细计数及HIV-1 RNA的相关性。结果 HIV感染者CD4+T淋巴细胞数量越多,HIV-1 RNA含量越低,其全血中HIV-1 DNA的水平越低,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 HIV-1 DNA可反映抗逆转录病毒治疗(HAART)期间病毒库水平,提示疾病进展情况,评价治疗效果,可为贵州省艾滋病的治疗提供更精准的监测手段。     

慢性HIV-1感染者CD8+T细胞活化和耗竭水平与病程的相关性研究

目的:探讨HIV-1感染过程中CD8+T细胞CD38、HLA-DR和T细胞上共抑制受体程序性死亡受体1(PD-1)表达水平与免疫活化和耗竭的相关性.方法:收集HIV-1感染者123例,其中未接受抗病毒治疗者96例,根据CD4+T细胞计数分为低CD4+T细胞计数组(<350个/μL,53例)、中CD4+T细胞计数组(>3...     

HIV-1抗体阳性者WB带型及其在不同临床分期中的特征分析

 目的   分析HIV-1抗体阳性者血清中病毒蛋白的变化,探讨不同临床分期HIV-1抗体阳性者Western blot(WB)带型特点。方法   应用WB检测HIV 1感染者体内特异性抗体,流式细胞仪检测CD4+T淋巴细胞计数。结果   208例HIV-1抗体阳性者中,男性193例(92.79%),同性性接触感染163例(78.37%)。WB特异性条带gp160、gp120、gp41、p66、p51、p31、p24维持较高的抗体阳性率,在不同临床分期间差异无统计学意义;异性性行为感染者gag基因编码蛋白的抗体p55条带的出现率高于同性性行为感染者(P<0.05);全带型①、次全带型②(缺失p55)、次全带型③(缺失p39)、次全带型④(缺失p55和p39)、次全带型⑤(缺失p55、p39和p17)5种带型为常见带型,全带型出现率最高(44.2%)。结论   HIV-1抗体阳性者的CD4+ T淋巴细胞计数有助于判断机体免疫状态、确定疾病分期及监测疾病进展。闵行区艾滋病的防治重点为外来流动人员及男男性行为人群。     

RNA干扰作用于HIV-1vpr基因的筛选实验研究

目的 筛选鉴定针对HlV-1vpr基因的小干扰RNA（siRNA）片段。方法 根据siRNA设计要求合成siRNA56、siRNA160和siRNA185寡核苷酸片段,分别转染至含HIV-1vpr质粒的HEK293T细胞,并进行总RNA提取,采用Real-timePCR和Westernblotting分别从核酸和蛋白水平对HIV-1vpr基因表达水平进行验证。结果 siRNAs成功转染含HIV-1vpr质粒的HEK293T细胞,降低了HIV-1vpr基因的表达水平,其中在RNA水平siRNA160组干扰抑制作用最强,抑制率为89%;在蛋白水平siRNA56组干扰抑制作用最强,抑制率为96%。结论 3个基因片段的siRNA均可以下调HIV-1vpr的表达水平,但存在差异性,为探索HIV/AIDS基因治疗的可行性和高效性提供了可靠的实验依据。     

HIV-1新发感染者的带型特征及免疫状况的相关性

目的 对新发HIV-1感染者血清S/CO值、WB条带及CD4⁺T淋巴细胞计数进行分析,探讨HIV-1新发感染者的带型特征及免疫状况的相关性。方法 纳入2010年1月—2018年1月检测的新发HIV-1感染者108例,ELISA检测HIV-1抗体S/CO值,WB蛋白印迹实验检测HIV-1抗体带型,流式细胞仪计数CD4⁺T淋巴细胞,对所得结果进行统计学分析。结果 同免疫状态组感染者的WB条带中,膜蛋白（ENV）及酶蛋白（POL）的出现率较高,而核心蛋白（GAG）的p55、p39、p17出现率较低。其中,p24、p39、p17出现率在不同免疫状态组中差异有统计学意义（P<0.05）。新发感染者WB条带的单因素和多因素Logistic回归分析表明p17、p51和gp41条带缺失与HIV-1新发感染者相关(P<0.05)。结论 HIV-1感染者血清S/CO值与机体免疫状态无明显相关性,而WB带型与机体免疫状态存在相关性。WB检测结果缺失p17、p51和gp41时应高度怀疑其为HIV-1新发感染。     

聚合酶链反应条件控制与优化

聚合酶链反应作为一种强有效的DNA 体外扩增技术,已被广泛地应用于一些遗传性疾病的临床基因诊断。然而,它对反应条件的变化颇为敏感.本文观察了不同反应物成分及时间/温度参量对聚合酶链反应产量和特异性的影响.通过探讨这些因素如何影响扩增结果,以及它们之间在扩增过程中如何相互作用等问题,加深了对影响条件优化的相互关联的各生物化学及生物物理参量的理解,为优化扩增条件提供依据。     

1型HIV感染多重PCR检测方法的建立及临床应用

目的建立检测人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的多重巢式PCR(nPCR)和多重反转录PCR(RT-PCR)方法。将其与已经上市的NASBA法试剂盒进行检测敏感性比较;探讨血浆RNA水平对PCR检测敏感性的影响;评价该方法用于我国HIV-1感染者诊断的价值。方法针对HIV-1的gag、pol和gp41区设计3套引物,建立检测HIV DNA的多重nPCR和检测HIVRNA的多重RT-PCR方法;分别以建立的PCR方法和NASBA法对119例HIV阳性患者进行检测,比较2者的检测敏感性;将患者分为不同的病毒载量组,比较PCR方法在各组患者中的检测敏感性差异;使用建立的PCR方法对10例可疑急性感染者进行检测;扩增HIV-1膜区C2-C3段,对nPCR检测阳性的43例DNA样本进行亚型鉴定。结果多重nPCR的检测敏感度为97.5%(116/119),多重RT-PCR的敏感度为78.2%(93/119),2者的特异度均为100%(50/50),多重nPCR和多重RT-PCR的阳性预测值分别为97.5%(116/119)和78.2%(93/119),阴性预测值均为100%(50/50),准确性分别为98.2%和84.6%。经比较,多重nPCR和多重RT-PCR的检测敏感度都高于NASBA法。在病毒载量<103copy/mL的患者,nPCR的检测敏感性高于RT-PCR,在病毒载量在(103～104)copy/mL的患者及病毒载量≥104copy/mL的患者,2者的敏感性比较相近,均接近100%;检测的10例可疑急性感染者中,有5例患者的nPCR和RT-PCR检测结果阳性,抗体在随访过程中阳转,证实为HIV急性感染者;检测的43例DNA样本分属于B’亚型(37例),AE亚型(5例)和BC亚型(1例)。结论本课题组建立的PCR检测方法可以对我国主要流行的B’、AE和BC亚型病毒株得到很好的扩增效果;nPCR的检测敏感性受血浆RNA水平的影响相对较小,RT-PCR的检测敏感性受血浆RNA水平的影响相对较大;PCR方法可以用于HIV急性感染者的早期诊断。     

聚合酶链反应凝胶电泳的摄影

为提高聚合酶链反应凝胶电泳的图像质量,用不同的胶卷,设定不同的曝光和冲洗条件,对凝胶电泳进行摄影条件摸索.结果(1)对弱荧光带拍摄,ISO100/21°黑白胶卷曝光条件为f/2,时间30～60秒;ISO400/27°黑白胶卷曝光条件为f/2.8,时间5秒左右.(2)对强荧光带拍摄,ISO100/21°黑白胶卷曝光条件为f/2或f/2.8,时间10～30秒;ISO)400/27°黑白胶卷曝光条件为f/4,时间1～4秒.冲洗可用原液浓度D-72显影液.照片图像效果满意.提示电泳荧光亮度和正确曝光是图像质量的关键.     

聚合酶链式反应实验教学的组织与效果分析

聚合酶链式反应是常规分子生物学实验的重要内容之一。作者在多年从事分子生物学实验教学的基础上,根据聚合酶链式反应实验特点,在实验操作的间隔时段引入相关问题的探讨。整个教学过程由学生查阅资料进行问题和实验准备、教师对实验原理与操作注意事项的简单介绍、实验操作、问题讨论、实验结果观察与分析等组成。实施效果表明,作者采用的教学组织方案能够更加有效地利用实验过程中的间歇时间,通过对预先设定的问题和学生自主提问进行探讨,实现良好的师生互动,加深了学生对聚合酶链式反应实验原理及相关理论的理解与掌握,增强学生利用所学理论知识分析实际问题的能力。对于激发学生的学习积极性具有较好的促进作用。     

应用PCR法检测小鼠沙门氏菌

本文根据沙门氏菌保守基因序列合成一对寡桩苷酸引物,建立一种聚合酶链反应检测小鼠沙门氏菌的方法。通过对14株沙门氏苗和8株非沙门氏菌的检测,发现只有沙门氏菌才能扩增出495bp的特异性条带,检测灵敏度可达50条沙门氏菌水平。该法检测小鼠粪便中沙门氏菌的阳性率高于培养法,且整个实验过程仅需6～8h。可见,该法是一种特异、敏感、简便、快速的沙门氏菌检测方法,对实验动物质量控制将发挥积极的作用。     

PCR检测降钙素基因高甲基化在监测慢性髓细胞白血病恶化中的价值

目的观察慢性髓细胞白血病（ＣＭＬ）病情恶化与降钙素（ＣＴ）基因高甲基化程度之间的关系。方法用内切酶酶切和ＰＣＲ技术研究４５例ＣＭＬ患者（其中慢性期３３例，加速期２例，急变期１０例）的ＣＴ基因高甲基化程度。ＣＴ基因未高甲基化，则能被相应内切酶切断，无法扩增出特异ＤＮＡ片断，否则，能扩增出特异ＤＮＡ片断，据此推断ＤＮＡ的甲基化程度。结果３例慢性期，２例加速期及８例急变期患者呈现降钙素基因高甲基化；急变期组（包括加速期）甲基化率明显高于慢性期组，两组有显著性差别（Ｐ＜０．０１）；１例在慢性期呈现ＣＴ基因高甲基化者于１０个月后发生急粒变。结论该方法有助于监测ＣＭＬ的恶化     

DNA探针的PCR标记法

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）对幽门螺杆菌染色体ＤＮＡ片段进行地高辛配基标记制备探针，与经典的随机引物标记法相比较，ＰＣＲ标记法能使探针产量明显提高，而且快速、经济，值得进一步应用和探讨。     

应用多聚酶链反应检测肺炎支原体

参考Ｂｅｒｎｅｔ法合成引物一对，建立肺炎支原体ＤＮＡ的多聚酶链反应检测法，靶ＤＮＡ为１４４ｂｐ。特异性试验显示仅肺炎支原体呈阳性。敏感性试验显示≥１１３ｃｆｕ肺炎支原体呈阳性。检测３０例临床疑似肺炎支原体肺炎患儿的咽拭子，肺炎支原体ＤＮＡ阳性率８０％，１０例健康小儿咽拭子均呈阴性，全部操作可在２４ｈ内完成。     

一种简便快速制备多聚酶链反应模板的方法

在多聚酶链反应时采用一种快速简便的模板ＤＮＡ制备方法。组织块在冰浴中剪碎和匀浆，再用蛋白酶Ｋ降解；细胞则直接用蛋白酶Ｋ处理。离心后，取上清则可直接作为ＰＣＲ的模板。采用此方法制备的模板，经ＰＣＲ扩增，检测宫颈细胞、细胞培养物、口腔肿瘤活检组织中ＨＰＶ６、１１和ＨＳＶ的感染，取得了满意的结果。揭示该方法能从各种细胞和组织中制备ＰＣＲ的模板，而无需用ＳＤＳ－苯酚－氯仿抽提ＤＮＡ。     

人乳头瘤病毒DNA的PCR检测

本文应用聚合酶链反应检测了70例尖锐湿疣，乳头瘤石蜡包理组织中的人乳头瘤病毒DNA，结果表明：HPV-DNA的检出率为70.0%(49/70)，多重感染占阳性例数的53.1%。HPV6和（或）HPV11为本地区尖锐湿疣、乳头瘤组织中HPV感染的主要型别。