全反式维甲酸对高糖诱导HK-2细胞FN、LN表达的影响

目的观察全反式维甲酸（ATRA）对高糖诱导人肾小管上皮细胞（HK-2）纤维连接蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）表达的影响,探讨ATRA延缓糖尿病肾病肾间质纤维化的发生机制。方法体外培养的HK-2细胞随机分为正常对照组（NG组,含5.5mmol/LD-glucose）;高糖组（HG组,含30mmol/LD-glucose）;渗透压对照组（MG组,含5.5mmol/LD-glucose＋24.5mmol/Lmannitol）;全反式维甲酸低浓度组（ATRA1组,HG＋10^-7mol/LATRA）;全反式维甲酸中浓度组（ATRA2组,HG＋10^-6mol/LATRA）;全反式维甲酸高浓度组（ATRA3组,HG＋10^-5mol/LATRA）;药物溶剂无水乙醇组（HG＋10^-2mol/L无水乙醇）;卡托普利组（HG＋10^-5mol/Lcaptopril）。各组细胞分别培养24h、48h和72h后收集细胞上清液。采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测培养细胞上清液FN、LN的浓度。结果高糖可增加HK-2细胞培养上清的FN、LN的水平（P〈0.01）,ATRA可以部分抑制高糖的作用（P〈0.01）。结论高糖可以促进体外培养的HK-2细胞FN、LN的表达,ATRA可以抑制高糖的作用,这可能是ATRA延缓糖尿病肾病肾间质纤维化进展的机制之一。     

p115RhoGEF/RhoA信号通路在高糖致脑微血管内皮细胞通透性异常中的作用

目的探讨p115RhoGEF/RhoA信号通路在高浓度葡萄糖(Glucose)致小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3通透性异常中的作用。方法体外培养小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3),构建单层血脑屏障体外模型。通过ESR电阻仪测定跨内皮细胞间电阻(TEER),分光光度法检测碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷胺酞胺转移酶(γ-GT)活性以评估其屏障功能;对照组(5.6mmol/L葡萄糖)、高糖诱导组(15.6、25.6、35.6、45.6mmol/L葡萄糖)处理细胞48h,MTT检测细胞相对存活率,分光光度法检测培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)活性,免疫印迹法(Western blot)检测紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达水平,评估高糖对脑微血管内皮细胞通透性的影响;Western blot检测不同浓度葡萄糖处理细胞后p115RhoGEF蛋白表达水平,体外蛋白与蛋白结合试验(Pull-Down)检测RhoA活性。转染p115RhoGEF-siRNA建立p115RhoGEF基因沉默的bEnd.3细胞模型,检测不同处理组RhoA活性及p115RhoGEF、TJ蛋白表达水平。结果细胞TEER值随培养时间延长逐渐升高,ALP、γ-GT活力均随时间延长逐渐升高;与对照组比较,35.6、45.6mmo/L葡萄糖诱导组的细胞活力出现明显下降作用,且诱导时间越长,细胞存活率越低(P0.05);35.6mmol/L葡萄糖诱导组的LDH水平明显升高(P0.05);随着葡萄糖浓度升高,ZO-1、Occludin蛋白表达下降而p115RhoGEF蛋白表达升高,差异有统计学意义(P0.05);Pull-down结果显示,25.6、35.6mmol/L葡萄糖组的RhoA活性较对照组明显升高(P0.05)。细胞转染p115RhoGEF-siRNA后,p115RhoGEF蛋白表达较对照组明显下降;高糖诱导48h后,与NCsiRNA组比较,p115RhoGEF-siRNA组的GTP-RhoA活性下降、 ZO-1、 Occludin表达水平明显上调(P0.05)。结论高糖通过诱导p115RhoGEF/RhoA信号通路活化,下调紧密连接蛋白表达,引起脑微血管内皮细胞通透性增加。[营养学报,2019,41(2):154-162]     

高糖刺激对HK-2细胞脂联素受体基因及蛋白表达的影响

目的 了解体外高糖刺激对肾小管上皮细胞（HK-2）脂联素受体（adipoR）表达的影响.方法 将HK-2细胞在含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液中培养至贴壁且80%融合时,无血清培养24 h,改用含葡萄糖1、2,4、6、8 mg/ml的培养液继续培养48 h,RT-PCR及westernblot检测ad-ipoR的表达.将HK-2细胞分别在含10%胎牛血清的高糖（4 mg/ml）、低糖（1 ms/ml）DMEM培养液中培养0、12、24、48、72、96 h后提取总RNA,RT-PCR检测adipoR mRNA的表达.结果 adipoR1/R2基因在HK-2细胞上均有表达,且adipoR1（0.63±0.12）基因表达量是adipoR2（0.16±0.03）的3.9倍,差异有统计学意义（P〈0.01）.各不同浓度葡萄糖及作用时间对HK-2细胞adipoR的基因表达无明显影响（P〉0.05）.westernblot检测到HK-2细胞上adipoR1的蛋白表达,其表达量不受葡萄糖浓度的影响（P〉0.05）.结论 adipoR1/R2基因在HK-2细胞上均有表达,且以adipoR1为主,提示adipoR1在肾脏疾病中具有更重要的意义.HK-2细胞adipoR的表达不受高糖的影响.     

葡萄糖对内皮细胞醛糖还原酶基因表达及活性的影响

目的研究葡萄糖对人血管内皮细胞醛糖还原酶基因表达及活性的影响,为糖尿病血管并发症提供理论依据。方法体外培养的人脐静脉内皮细胞,采用RT-PCR、生化测定等方法检测醛糖还原酶(AR)活性及mRNA表达。结果经5·5、11、22mmol/L葡萄糖处理后内皮细胞AR的mRNA及其活性均高于对照组(5.5mmol/L葡萄糖)(P<0.05或P<0.01),呈浓度依赖性,但44mmol/L葡萄糖组较22mmol/L葡萄糖组低(P<0.05)。在22mmol/L葡萄糖作用下,随着作用时间的延长(0、12、24h),AR的mRNA及活性增高呈时间依赖性(P<0.05或P<0.01),但48h较24h低(P<0.05)。结论葡萄糖能诱导内皮细胞AR基因表达,增强AR活性,且在一定范围内呈时间及浓度依赖性。     

波动性高糖对内皮细胞自噬基因表达的影响

【目的】探讨波动性高糖对内皮细胞自噬的影响及其可能的机制。【方法】体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)用于实验。实验分正常对照组(5.5 mmol/L葡萄糖)和葡萄糖交替处理组(5.5/28 mmol/L葡萄糖)。其中葡萄糖交替处理模拟人血糖波动状态,方案是前12 h内每隔4 h交替培养,后12 h内葡萄糖维持5.5 mmol/L水平,按此循环,共培养48 h。用CCK-8检测细胞活性,酶标仪检测氧化应激相关指标,实时荧光定量PCR检测自噬相关基因的表达情况。【结果】与正常对照组相比,葡萄糖交替处理组降低HUVEC细胞活性(P<0.01);降低细胞内抗氧化酶活性,增加丙二醛和8-羟基脱氧鸟苷的含量(P<0.01);增加自噬相关基因Atg4和Atg5的表达(P<0.001)。【结论】波动性高糖可能是先通过诱导HUVEC产生氧化应激,进而使HUVEC产生自噬,最终降低细胞活性。     

替米沙坦对高糖状态下血管内皮细胞胰岛素敏感性的影响

目的 探讨替米沙坦对高糖状态下血管内皮细胞胰岛素敏感性的影响。方法 在细胞培养皿上均匀接种人脐静脉内皮细胞(HUVECs),随机分为高糖组(HG)与替米沙坦处理组(HG+TM)共2组。HG组在含葡萄糖(Glucose)33mmol/L的DMEM完全培养液培养48h。HG+TM组先在含33mmol/LGlucose的DMEM完全培养液培养24h,然后在含替米沙坦500μg/L+Glucose33mmol/L完全培养液培养24h。按照上条件处理结束后,两组细胞在含5.5mmol/L Glucose的DMEM (无血清)继续培养4h,加入终浓度为5mIU/L胰岛素继续培养10 min,最后将两组细胞上清液进行收集,检测细胞上清液中TNF-α、IL-6、NO及ET-1水平进行比较。结果 与HG组相比,HG+TM组NO水平升高,TNF-α、IL-6、ET-1水平下降,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。结论 替米沙坦可增加高糖状态下血管内皮细胞胰岛素敏感性,其机制可能降低TNF-α、IL-6炎症因子水平有关。     

α-硫辛酸对高糖和H_2O_2致ECV304细胞线粒体氧化损伤的保护作用

目的探讨α-硫辛酸(LA)对高糖和H2O2引起的ECV304细胞氧化损伤的保护作用。方法用不同剂量的α-硫辛酸0.25,0.5,1mmol/L预处理ECV30424h,再用30mmo/l葡萄糖作用24h,流式细胞术检测细胞线粒体ROS含量和线粒体膜电位。用上述三组剂量的LA预处理ECV304 24h,再用100μmol/LH2O2作用2h,单细胞凝胶电泳检测细胞DNA氧化损伤情况。结果经不同浓度LA预处理后,ECV304的ROS含量与对照组比显著下降(P0.01),且随剂量增加有下降趋势;线粒体膜电位值显著地升高(P0.05或者P0.01),且随剂量增加有升高趋势。对于H2O2造成的细胞DNA断裂损伤,在加入不同浓度LA后,细胞拖尾率、尾长和Olive尾矩等指标均有显著性下降(P0.05或者P0.01)。结论一定浓度范围内的α-硫辛酸对高糖和H2O2引起的ECV304细胞的氧化损伤具有保护作用。     

高浓度葡萄糖对小鼠囊胚细胞线粒体和细胞色素氧化酶的影响

目的:探讨高浓度葡萄糖对小鼠囊胚细胞线粒体和细胞色素氧化酶的影响,探讨高浓度葡萄糖对小鼠囊胚有氧代谢的影响,为糖尿病妊娠导致胎儿畸形的机制和预防提供理论依据。方法:通过促超排卵,获取妊娠3.5天小鼠囊胚,随机分成三组,即对照组(空白)、低糖组(葡萄糖浓度为7.5 mmol/L)和高糖组(葡萄糖浓度为28.0 mmol/L),分别培养在含0、7.5 mmol/L和28.0 mmol/L葡萄糖的M199培养基中,培养24 h后,然后再吸山囊胚。每组随机吸取30个囊胚用罗丹明123荧光染料标记线粒体和组织化学方法显示细胞色素C氧化酶,观察囊胚细胞线粒体和细胞色素C氧化酶(Cytochrome C Oxidase)的变化。结果:①高糖组小鼠囊胚线粒体功能活性明显降低,荧光密度值较低,且线粒体的位置分布发生了明显变化,空白组和低糖组囊胚胞浆中线粒体分布均匀,荧光密度值较高,线粒体仍具有一定的活性。空白组与低糖组囊胚荧光密度值无显著性差异(P>0.05),高糖组与空白组和低糖组相比均存在显著性差异(P<0.05);②细胞色素氧化酶(COX)活性的变化:高糖组小鼠囊胚胞浆淡染,反应产物呈浅黄色,COX活性明显降低;空白组和低糖组囊胚胞浆可见明显的棕褐色物质,COX活性较高,统计学分析,空白组与低糖组囊胚灰度值无显著性差异(P>0.05),高糖组与空白组和低糖组相比均存在显著性差异(P<0.05)。结论:高浓度葡萄糖对小鼠囊胚线粒体的分布、功能以及COX活性均有影响。     

高糖培养对大鼠肾小球系膜细胞内胆固醇含量的影响

目的观察高糖培养对大鼠肾小球系膜细胞内胆固醇含量的影响并探讨其可能机制。方法体外培养大鼠肾小球系膜细胞, 分为高糖培养组(高糖组, 培养基糖浓度为30 mmol/L)及正常糖培养组(正常组, 培养基糖浓度为5.5 mmol/L)。分别于培养24、36、48 h时, 用油红O染色及分光光度计比色法测定细胞内脂质含量, 采用细胞内蛋白印记法检测细胞低密度脂蛋白胆固醇受体(LDLR)和三磷酸腺苷结合盒A1(ABCA1)的表达。结果油红O染色提示培养36 h时高糖组细胞内脂滴少于正常组, 培养24 h及48 h时两组无明显差别。高糖组大鼠肾小球系膜细胞在培养36 h时细胞内总胆固醇(TC)及胆固醇酯(CE)显著低于正常组(P=0.028、0.029), 而游离胆固醇(FC)差异无统计学意义(P=0.306)。培养24、48 h时, 两组间细胞内TC、CE及FC差异均无统计学意义(均P>0.05)。高糖组大鼠肾小球系膜细胞LDLR表达量在培养24、36、48 h时均显著低于正常组(P=0.043、0.004、0.028), ABCA1表达量在培养24、36、48 h时均显著高于正常组(P=...     

二甲基甲酰胺对心肌细胞的毒性作用

目的探讨二甲基甲酰胺（dimethylformamide,DMF）对正常心肌细胞（H9C2）的细胞毒性作用。方法采用CCK-8法检测不同浓度梯度（0 mmol/L,50 mmol/L,100 mmol/L,150 mmol/L,200 mmol/L,250 mmol/L,300 mmol/L）DMF作用心肌细胞24 h、48 h、72 h后的细胞毒性,并用Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测不同时间（24 h、48 h、72 h）和浓度（24 h的染毒剂量为0 mmol/L,100 mmol/L,140 mmol/L,180 mmol/L,220 mmol/L,250 mmol/L;48 h的染毒剂量为0 mmol/L,100 mmol/L,140 mmol/L,180 mmol/L,200 mmol/L,220 mmol/L;72 h的染毒剂量为0 mmol/L,100 mmol/L,125 mmol/L,140 mmol/L,180 mmol/L,200 mmol/L）的细胞凋亡率。结果不同浓度DMF作用于心肌细胞24 h,48 h和72 h后产生了明显的细胞毒性。同一...