大鼠增龄及颈椎间盘退变过程中髓核形态转化的研究

随着年龄的增加，椎间盘的髓核组织由脊索性髓核逐渐转变为纤维软骨性髓核，但这种转化的规律及其与椎间盘退变的关系仍不清楚。本研究采用成组设计，通过破坏大鼠颈椎后方静力稳定结构制备颈椎间盘退变动物模型，动态观察髓核形态的变化规律及其与椎间盘退变的关系，旨在为制定防治椎间盘退变的策略提供依据。     

白藜芦醇对大鼠退变腰椎间盘髓核组织形态学的影响

目的观察白藜芦醇对大鼠退变腰椎间盘髓核组织影响的病理改变及超微结构变化。方法将大鼠36只随机分为正常对照组、椎间盘退变组和白藜芦醇药物干预组各12只,应用HE染色光镜观察各组腰椎间盘髓核组织的病理改变,在电镜下对其进行超微结构的观察。结果光镜下可见正常对照组较多的脊索细胞和类软骨细胞增殖活跃,椎间盘退变组髓核的细胞减少,白藜芦醇药物干预组髓核细胞减少较椎间盘退变组程度轻;电镜下正常对照组的椎间盘髓核组织超微结构的病理改变不显著,而椎间盘退变组表现为髓核细胞减少,出现不同程度的退变、坏死,白藜芦醇药物干预组中退变程度明显减轻。结论通过光镜、电镜下观察白藜芦醇对大鼠退变腰椎间盘髓核组织有延缓或抑制作用,可为白藜芦醇预防和治疗椎间盘退变提供相关的实验依据。     

转基因髓核细胞移植对兔腰椎间盘退变的影响

目的：椎间盘退变是引起腰背痛的主要原因。将腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）介导的结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）和基质金属蛋白酶组织抑制因子1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1,TIMP1) 双基因体外联合转染兔椎间盘髓核细胞后,再移植于退变椎间盘内,观察椎间高度、II型胶原和蛋白多糖合成的变化,以探讨体外延缓或逆转椎间盘细胞退变的方法。方法 20只新西兰大白兔应用CT引导下的微创穿刺法建立兔椎间盘退变模型。以rAAV2-CTGF-IRES-TIMP1体外转染培养的兔髓核细胞,再将其显微注射于退变椎间盘内作为细胞移植组;退变椎间盘内注入磷酸盐缓冲液（PBS）作为退变对照组;正常椎间盘作为空白对照组。分别于6、10、14周行X线和MRI检查观察椎间高度的变化及椎间盘信号的改变,Western-blot鉴定细胞因子CTGF和TIMP1在椎间盘内的表达,35S整合法测定兔髓核组织蛋白多糖合成率,RT-PCR检测II型胶原及蛋白多糖mRNA的表达。结果 MRI证实CT引导下经皮微创穿刺2周后椎间盘开始退变。与退变对照组相比,MRI显示细胞移植组椎间盘退变明显减轻,转基因兔髓核细胞移植可减缓椎间高度(DHI)下降的发生率,转基因细胞移植组较退变对照组相比,Ⅱ型胶原含量和蛋白多糖的生物合成明显增加,差别有统计学意义（P﹤0.05）。结论 经皮CT 引导下穿刺可成功建立兔椎间盘退变模型。转双基因CTGF和TIMP1 髓核细胞移植可有助于椎间高度的维持,促进椎间盘内蛋白多糖和II型胶原的生物合成,明显延缓椎间盘退变。     

大鼠腰椎间盘退变模型的建立及X线和病理学观察

目的设计一种新的用于腰椎间盘退变相关研究的动物模型.方法选取32只SD大鼠,随机分为实验组和对照组,每组16只;实验组采用以L3为中心切除L1～L6棘突、关节突、棘上、棘间韧带,切断双侧竖棘肌的手术方法;对照组仅切开皮肤后即缝合.术后分别于第1、2、3个月随机选取5只大鼠行X线检查并处死后进行病理学观察.结果对照组大鼠X线检查无特异性改变,而实验组显示椎间隙狭窄、椎体不稳、软骨终板钙化;对照组病理学检查无明显变化,实验组表现为髓核细胞减少,外周纤维环纤维化样变.结论本方法科学、经济、实用性强,是研究腰椎间盘退变的比较理想的动物模型.     

大鼠尾椎间盘针刺退变模型的建立

目的 建立大鼠尾椎间盘针刺退变模型并进行X线和组织学观察.方法 Wistar 大鼠36只, 使用20G皮肤穿刺针对Co7,8 Co8,9椎间盘分别随机行腹背横贯或半横贯穿刺一针, Co9,10椎间盘不穿刺作为对照, 术前及术后1、2、4周时对造模后的椎间盘及对照的椎间盘(Co9,10)行X线检查及HE染色观察.结果 术后第1周到第4周,穿刺后的椎间盘高度指数呈现持续减小; 组织学检查发现横贯穿刺和半横贯穿刺椎间盘1周时都发生退变,而横贯穿刺退变较严重(P＜0.01).结论 横贯或半横贯针刺方法可以成功建立大鼠尾椎间盘退变模型,方法可靠、有效、重复性好.     

Hartley豚鼠增龄过程中腰椎间盘退变髓核组织形态变化及其生化研究

目的 研究Hartley豚鼠腰椎间盘自然老化及退变过程中脊索性髓核向纤维软骨髓核转化的规律及其血液生化指标与腰椎间盘退变的关系.方法 Hartley雌性豚鼠40只,分别为1、1、5、2、2、5、3月龄,每组各8只.通过HE观察豚鼠椎间盘髓核退变情况,测定其血清中蛋白多糖水平.结果 2月组椎问盘形态即有退变.血清蛋白多糖含最随年龄的增长而下降,各组间差异显著.结论 随着年龄的增长,椎间盘退变的同时,出现血清蛋白多糖含量的降低.随着椎间盘的不断老化,终板的软骨细胞向髓核迁移,脊索性髓核向心性皱缩并最终完全被纤维软骨性髓核取代.在Hartley雌性豚鼠椎间盘退变的过程中,这一转化完成得更快、更早.     

四环素对退变腰椎间盘影响的实验研究

目的观察四环素延缓和抑制大鼠腰椎间盘退变病理变化的作用及与基质金属蛋白酶（MMP）的关系。方法建立大鼠腰椎间盘退变模型。实验设正常组、模型组、四环素治疗组（造模后4周,每日皮下注射四环素25mg,持续2周）。大鼠在退变模型建立8周后处死,HE染色光镜观察各组腰椎间盘组织病理改变,免疫组织化学和蛋白印记实验检测腰椎间盘组织MMP-3的表达。结果动物模型建立8周后除正常组外,其它各组椎间盘组织均出现不同程度退行性病理改变,四环素治疗组病理改变较模型组减轻。四环素治疗组椎间盘组织中MMP-蛋白表达呈弱阳性,与模型组差异有统计学意义（P〈0.05）,与正常组无统计学意义。蛋白印记检测同免疫组化结果相同。结论MMP-3的增高可导致椎间盘细胞外基质降解,而四环素能降低MMP-3的表达,从而减轻椎间盘基质的降解,延缓和抑制实验性大鼠腰椎间盘退变的形成。     

髓核细胞表型对干细胞治疗椎间盘退变的意义

椎间盘退变导致的下腰痛是社会的主要负担之一,而卧床休息、理疗、抗炎药物治疗及手术治疗等传统治疗方法仅能在短期或一定程度上缓解椎间盘退变给患者带来的痛苦,并不能使患者的生活质量得到显著改善。目前,细胞移植对于椎间盘退行性疾病的治疗有较好的前景,且能更好地衡量功能恢复的效果。其中,了解移植细胞能否产生健康髓核组织至关重要。髓核细胞的表型是独特的,它由一组能反映其生理功能的特征性标志物的表达构成。未来,髓核细胞及其祖细胞的独特生理功能的表型标记将对干细胞治疗椎间盘退变具有重要意义。     

髓核研究的现状难以诠释椎间盘退变之道

最近,《关节炎和风湿病》（Anhrilis Rheum）杂志上刊载的1篇题为“人退变椎间盘髓核细胞中,整合素传导通路的变化”的研究文章引起了我们的关注。我们对该文进行仔细研读后,结合我们在人髓核细胞和椎间盘退变领域的研究,就人髓核细胞的培养,椎间盘退变的分级以及正常椎间盘的界定等方面提出了我们的见解,并就相关问题进行了对比和总结。我们撰写的Letter发表在《Anhrilis Rheum》杂志上。     

白血病抑制因子对退变髓核细胞胞外基质的影响

目的：探讨退变椎间盘髓核组织白血病抑制因子（leukemia inhibit factor,LIF）表达及其对胞外基质表达的影响。方法：40只新西兰兔随机分5组（1组为对照组,4组为实验组）,每组8只。针刺法建立L4/5、L5/6椎间盘退变模型,术后0、2、4、8周对椎间盘进行MRI扫描及HE染色评价退变程度,免疫组化检测髓核组织LIF的表达。体外原代培养兔髓核细胞,不同浓度重组LIF蛋白刺激髓核细胞24、48、72 h,Western blot检测聚蛋白多糖（Aggrecan）、Ⅱ型胶原（COLLA2α1）的表达,免疫荧光检测最大浓度组和对照组Aggrecan的表达并行Western blot检测金属蛋白酶组织抑制物-1（tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMP-1）和基质金属蛋白酶-3（matrixmetalloproteinase-3,MMP-3）的表达。结果：影像学和组织学评分显示椎间盘退变随造模时间延长而加重,各组间差异有统计学意义（1.000±0.000,2.000±0.535,2.750±0.463,3.875±0.354,P=0.000;4.000±0.000,7.375±0.518,9.375±1.302,11.750±0.463,P=0.000）。免疫组化显示2周组LIF表达最高,随着椎间盘退变加重,其表达降低,但各组均高于0周组,差异有统计学意义（559.608±68.689,16 135.613±577.329,8 149.739±457.189,2 018.254±211.870,P=0.000）。细胞学实验显示,加入不同浓度LIF刺激后,Aggrecan、COLLA2α1的蛋白表达与LIF刺激浓度呈正相关,各处理组与对照组差异有统计学意义（0.191±0.020,0.212±0.020,0.321±0.041,0.511±0.032,0.561±0.042,P=0.000）,Aggrecan免疫荧光结果与之相符。处理组TIMP-1表达明显高于对照组（0.454±0.022,0.211±0.012,P=0.000）,MMP-3明显低于对照组（0.243±0.013,0.362±0.021,P=0.000）。结论：LIF在退变髓核组织中表达上升,且具有促进胞外基质合成作用,其潜在机制与LIF能够上调TIMP-1并下调MMP-3作用相关。分为A组（AMD3100+NS动员组）,B组（AMD3100+G-CSF动员组）,C组（G-CSF+AMD3100动员组）和D组（NS空白对照组）;80只db/+小鼠为相应对照组,分组对应为A’组,B’组,C’组和D’组。每组在动员后第3 、7、10、14 天4个时间点于心脏部位取外周血,流式细胞仪检测CD34+/CD133+/Flk-1+细胞的比例。结果取平均值用均值±标准差（单位%）表示,统计学方法处理后进行比较和分析。结果：①D组和D’组在动员后第3、7、10、14 天4个时间点,CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例无差异（P >0.05）,但D’组中CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例高于D组（P=0.003）。②A组、B组和C组db/db小鼠在动员后第3、7、10、14 天4个时间点,CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例逐渐上升,A组至第7 天达到峰值,随后逐渐下降;B组和C组至第10 天达到峰值,随后逐渐下降,且在达到峰值时CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例与其余3个时间点相比差异有意义（P=0.000）。在第10 天,B组和C组db/db小鼠外周血中CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例较A组和D组高（P=0.000）,但B组和C组db/db小鼠外周血中CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例之间的差异无统计学意义（P >0.05）。③A’组、B’组和C’组db/+小鼠在动员后第3、7、10、14天4个时间点,CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例逐渐上升,至第7 天达到高峰,随后逐渐下降,且在第7天CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例与其余3个时间点相比差异有意义（P=0.000）。在达到峰值的第7天,C’组CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例较A’组、B’组和D’组高（P=0.000）。结论：AMD3100联合G-CSF动员骨髓EPCs的效果优于单一使用AMD3100的动员效果,在非糖尿病状态下,先使用G-CSF再联合AMD3100的动员作用更优,但在糖尿病状态下先使用AMD3100再联合G-CSF的动员作用更优。     

杆状病毒介导的GFP转染与退变的兔椎间盘髓核细胞

目的:检测杆状病毒转染正常与退变的椎间盘髓核细胞的效率以及杆状病毒介导的GFP基因(Ac/CMV/GFP)在正常与退变细胞中的表达水平。方法:取新西兰大白兔的髓核细胞进行离体培养,第1组:健康幼兔;第2组:椎间盘退变模型兔;第3组:椎间盘发生自然退变的成年兔。以200MOI杆状病毒介导的绿色荧光蛋白(GFP)转染离体培养的细胞,于第48h采用流式细胞仪检测转染效率,同时采用HPIAS2000图像分析软件半定量分析外源性GFP基因的表达水平。结果:3组细胞被转染的百分率分别为84.4±3.4,82.9±5.7,81.8±5.5(P>0.05)。外源性基因表达荧光蛋白的光密度值分别为0.0054±0.0029,0.0052±0.0032,0.0056±0.0031(P>0.05)。结论:杆状病毒转染椎间盘髓核细胞的效率与椎间盘退变程度无关,杆状病毒介导的外源性基因能在正常与退变的髓核细胞中高水平的表达。     

Thymosin Beta-4 Recombinant Adeno-associated Virus Enhances Human Nucleus Pulposus Cell Proliferation and Reduces Cell Apoptosis and Senescence

Background:

Thymosin beta-4 (TB-4) is considered key roles in tissue development, maintenance and pathological processes. The study aimed to prove TB-4 positive biological function on nucleus pulposus (NP) cell apoptosis and slowing the process of cell aging while increasing the cell proliferation.

Methods:

TB-4 recombinant adeno-associated virus (AAV) was constructed and induced to human NP cells. Cell of same group were cultured without gene modification as controlled group. Proliferation capacity and cell apoptosis were observed during 6 passages of the cells. Morphology and expression of the TB-4 gene were documented as parameter of cell activity during cell passage.

Results:

NP cells with TB-4 transfection has normal TB-4 expression and exocytosis. NP cells with TB-4 transfection performed significantly higher cell activity than that at the control group in each generation. TB-4 recombinant AAV-transfected human NP cells also show slower cell aging, lower cell apoptosis and higher cell proliferation than control group.

Conclusions:

TB-4 can prevent NP cell apoptosis, slow NP cell aging and promote NP cell proliferation. AAV transfection technique was able to highly and stably express TB-4 in human NP cells, which may provide a new pathway for innovation in the treatment of intervertebral disc degenerative diseases.     

胶原酶对腰椎间盘髓核组织中蛋白多糖的影响

【目的】探讨胶原酶在作用时间内是否会引起腰椎间盘髓核组织中蛋白多糖的水解。【方法】经皮腰椎间盘切除术中获得髓核组织标本,-70℃保存。胶原酶15u作用于1mL（0.1g/mL）髓核组织匀浆,测定不同时间段的溶解效应。在胶原酶对髓核组织饱和溶解时间条件下,选择不同剂量的胶原酶作用于1mL（0.1g/mL）髓核组织匀浆,通过测定糖胺多糖的含量变化,推测蛋白多糖的含量变化情况。【结果】本实验的胶原酶对髓核组织饱和溶解时间为12h。胶原酶作用后髓核组织中糖胺多糖在9u胶原酶以内的各组呈独立散在分布,组间差异有统计学意义（P〈0.05）。9u胶原酶以后组间差异没有统计学意义（P〉0.05）。9u胶原酶时吸光度达到最大值,经与总量对照组比较,糖胺多糖最大水解程度为57.14%～64.76%。【结论】本实验初步证实胶原酶可以在短期内引起腰椎间盘髓核组织中蛋白多糖含量的降低,这可能与胶原酶溶解术后椎间盘退变的加重有关。     

胶原酶对腰椎间盘髓核组织中蛋白多糖的影响

 【目的】探讨胶原酶在作用时间内是否会引起腰椎间盘髓核组织中蛋白多糖的水解。【方法】经皮腰椎间盘切除术中获得髓核组织标本,-70℃保存。胶原酶15u作用于1mL(0.1g/mL)髓核组织匀浆,测定不同时间段的溶解效应。在胶原酶对髓核组织饱和溶解时间条件下,选择不同剂量的胶原酶作用于1mL(0.1g/mL)髓核组织匀浆,通过测定糖胺多糖的含量变化,推测蛋白多糖的含量变化情况。【结果】本实验的胶原酶对髓核组织饱和溶解时间为12h。胶原酶作用后髓核组织中糖胺多糖在9u胶原酶以内的各组呈独立散在分布,组间差异有统计学意义(P<0.05)。9u胶原酶以后组间差异没有统计学意义(P>0.05)。9u胶原酶时吸光度达到最大值,经与总量对照组比较,糖胺多糖最大水解程度为57.14%～64.76%。【结论】本实验初步证实胶原酶可以在短期内引起腰椎间盘髓核组织中蛋白多糖含量的降低,这可能与胶原酶溶解术后椎间盘退变的加重有关。     

髓核细胞与骨髓基质细胞移植对受损椎间盘退变的影响

目的 探讨移植兔骨髓基质细胞(MSC)和髓核细胞(NPC)对受损椎间盘退变的影响及影像学特点.方法 采用原代细胞培养法获取并扩增NPC及MSC.2岁龄新西兰白兔随机分为3组:盐水注射组3只,MSC移植组6只,NPC移植组6只,L3/4、L4/5、L5/6椎间盘进行髓核穿刺抽吸后,分组注入盐水、MSC和NPC.未处理的L2/3、L6/7、 L7/S1椎间盘作为对照组采集数据. 术前及术后4、6、8周,相同条件下摄取腰椎侧位X光片,运用Image-pro plus6.0测量椎间盘高度指数(DHI)计算%DHI;Merge eFilm Workstation测量MRI T2像椎间盘信号强度并进行标准化(ST2WI),计算%ST2WI.结果 两细胞移植组较之盐水组均能够有效的抑制损伤椎间盘进行性的高度丢失、骨性终板破坏、骨赘形成、细胞外基质丧失等.NPC组第6周%DHI为(74.31±2.59)%,第8周为(79.29±2.53)%,两者间差异有统计学意义(P<0.05),提示8周时NPC组椎间盘高度恢复;且第8周时NPC组与MSC组的%DHI之差异无统计学意义.%ST2WI数据显示第8周时NPC组T2信号强度高于MSC组[(70.63±7.60)% vs (54.32±7.92)%,P<0.05],提示NPC组细胞外基质的合成可能超过MSC组.结论 NP及MSC两种细胞移植能够有效避免椎间盘损伤后发生的进行性的退变过程.8周后NPC组较MSC组显示出更强的基质合成能力,椎间盘高度及含水量出现恢复的迹象.提示外源性NPC能够良好的适应受体椎间盘环境,并发挥相应的细胞外基质分泌功能.     

裸鼹鼠心脏显微结构与超微结构观察

目的 观察和分析裸鼹鼠心脏的形态结构与组成,以了解裸鼹鼠心脏是否在耐受低氧、长寿以及对抗心血管类疾病等方面有独特功能.方法 采集裸鼹鼠心脏经石蜡切片后进行苏木精-伊红染色,然后光学显微镜下观察裸鼹鼠心脏的显微结构,以及经冰冻超薄切片和染色后,通过透射电镜观察和分析裸鼹鼠心脏的超微结构.结果 光学显微镜观察发现,裸鼹鼠心脏体积较小鼠大,心壁也明显较厚,心肌细胞体积也略大,血管分布更为丰富广泛;透射电镜观察显示,裸鼹鼠心肌中线粒体较小鼠丰富,而体积较小,线粒体结构正常,但肌小节略有类似缺血的病变.结论 裸鼹鼠长期低氧的洞道生活史使其心脏形态结构发生了许多适应性变化,从而使其在对抗衰老和肿瘤方面有着独特的积极影响.     

雌激素在大鼠颈椎间盘退变中的作用

目的:研究雌激素在SD大鼠颈椎间盘退变过程中的作用。方法:30只8月龄雌性SD大鼠随机平分为对照组、模型组、实验组,通过切除双侧卵巢和颈后肌肉创建雌激素缺乏大鼠颈椎动静失衡模型,实验组补充外源性雌激素。造模后3月通过观察颈椎间盘形态、细胞凋亡率及测量蛋白多糖含量来比较3组之间颈椎间盘退变程度。结果:形态学观察比较实验组椎间盘退变程度重于对照组而轻于模型组;椎间盘细胞凋亡率模型组>实验组>对照组,3组之间具有显著差异(P<0.01);蛋白多糖含量模型组<实验组<对照组,3组之间具有显著差异(P<0.01)。结论:雌激素对大鼠颈椎间盘退变具有抑制作用,能够延缓椎间盘的退变进程。     

椎间盘退变修复研究进展

椎间盘退变是导致腰腿痛的最主要原因之一.椎间盘退变在细胞水平的主要表现包括髓核细胞退变、髓核细胞外基质退变、软骨终板和纤维环退变.目前临床治疗的主要方法是保守治疗、传统手术治疗、微创治疗,目的是缓解症状,其治疗效果不能令人十分满意.而致力于生物学功能恢复的方法逐渐引起人们的重视.     

实验性非压迫腰椎间盘髓核突出大鼠模型的建立

目的：设计一种新的非压迫性腰椎间盘髓核突出动物模型。方法：选择7只Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，将自身尾椎髓核混悬液注射到腰椎硬膜外腔建立动物模型。测量术前、术后3、5、7、9d大鼠后肢机械刺激缩爪阈值。结果：在没有明显机械压迫下，造模后大鼠出现明显的痛觉过敏反应。结论：本模型简单、可靠、费用低廉，为进一步研究腰椎间盘突出症和根性神经痛提供了理想的动物模型。     

大白鼠脑垂体神经叶的超微结构研究

本文用醛-锇酸固定法对大白鼠脑垂体神经叶的超微结构进行了研究。结果表明,垂体神经叶由神经纤维、神经胶质细胞、血管、结缔组织所构成。组成神经叶的神经纤维是许多充满嗜锇性神经囊泡的轴突。该处的毛细血管结构特点与神经激素的转运关系密切。神经叶的垂体细胞可能是具有一定分泌和吞噬功能的特化的神经胶质细胞。