在大肠杆菌中高效表达人Ⅰ型免疫缺陷病毒p24蛋白

为深入研究人Ⅰ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ—１）衣壳蛋白ｐ２４的结构与功能,制备抗Ｐ２４单克隆抗体及其诊断抗原,将编码ＨＩＶ－１ｐ２４蛋白的ｐ２４ｇａｇ基因片段,克隆到原核表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的Ｔ７噬菌体启动子下游,构建成了重组表达质粒ｐＥＴ２４,并使ｐ２４ｇａｇ基因片段在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中高效表达,其产物为３０ｋＤａ的ｓ１０－ｐ２４融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的３８．４％。重组Ｐ２４蛋白均抗ｐ２４单克隆抗体及ＨＩＶ—１阳性血清发生特异性反应,具有较好的抗原性,对研究开发ＡＩＤＳ诊断试剂和基因工程疫苗具有重要意义。     

在大肠杆菌中高效表达人Ⅰ型免疫缺陷病毒p24蛋白

目的表达人Ⅰ型免疫缺陷病毒（HIV—1）衣壳蛋白p24,为制备抗p24单克隆抗体及其诊断杭原奠定基础。方法将编码HIV—1p24蛋白的P24(gag)基因片段,克隆到原核表达载体PET—17b的T7噬菌体启动子下游,构建重组表达质粒;转化大肠杆菌BL2（DE3）,IPTG诱导表达,表达产物以SDS-PAGE、Westernblotting及点免疫印迹分析。结果构建成功重组表达质粒pET24,经IPG诱导,p24(gag)基因片段在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达,产物为30kDa的810—p24融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的38.4％;重组p24蛋白均与抗p24单克隆抗体及HIV—1阳性血清发生特异性反应。结论重组P24蛋白具有较好的免疫活性,是制备抗P24单克隆抗体及诊断试剂的理想抗原。     

GST-hPlk2融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的 构建GST-hPlk2融合蛋白表达载体,并在原核细胞大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达.方法 从人HEK293细胞中提取mRNA,反转录为cDNA.用PCR方法扩增出hPlk2基因全长,通过BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点将其定向插入pGEX-4T-2载体中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-hPlk2,并转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,通过限制性内切酶酶切电泳鉴定和DNA序列测定正确后,转入Ecoli BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷大量诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定.结果 酶切电泳及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒GST-hPlk2,并用Western blot方法证实了GST-hPlk2融合蛋白的表达.结论 成功构建了GST-hPlk2原核表达载体,并证实了其在原核细胞E coli中的表达,为进一步纯化Plk2及研究其结构与功能提供了前提基础.     

pTAT-XIAP重组表达载体的构建与酶切鉴定

目的 探索pTAT-XIAP融合表达载体的构建方法.方法 在体外合成大鼠XIAP基因,将其插入pTAT-HA质粒,构建pTAT-HA/XIAP融合表达载体,将pTAT-HA/XIAP质粒转化至DH5α感受态细胞, 筛选培养转化成功的单克隆,NcoI/XhoI双酶切后琼脂糖电泳鉴定.结果 转化pTAT-HA/XIAP质粒的DH5α在含氨苄青霉素的LB固体培养基上呈分散菌落生长.电泳结果显示重组pTAT-HA/XIAP质粒约4 500 bp,酶切后可观察到PTAT-HA质粒约3 000 bp,XIAP目的 基因条带1 494 bp,pTAT空质粒约3 000 bp,条带大小与质粒图谱一致.结论 将大鼠XIAP基因成功插入pTAT-HA质粒,构建pTAT-XIAP融合蛋白表达载体,提取的质粒可用于下游分子生物学实验.     

HSP70-GST融合蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建小鼠热休克蛋白70(HSP70)重组原核表达质粒,获取小鼠HSP70-GST融合蛋白。方法先用RT-PCR方法从小鼠脑基因组中扩增出HSP70基因cDNA序列,应用T-A克隆技术,克隆到质粒pMD—Tvector,经DNA测序证实基因碱基无误后,亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1 中进行表达。结果表达产物经Western Blot分析,在109 KD处有一明显特异带,与预期结果相符。结论构建重组融合表达载体pGEX—HSP70,用基因工程的方法在原核细胞中成功表达出小鼠 HSP70-GST融合蛋白。     

β分泌酶原核表达载体的构建、表达及融合蛋白纯化

目的 构建小鼠β分泌酶原核表达载体并诱导其表达和纯化,为进一步研究β分泌酶的作用奠定基础.方法 根据基因文库中小鼠β分泌酶基因的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增到β分泌酶的cDNA片段,克隆进原核表达载体pET-28a中,并转化大肠杆菌BL21(DE3),测序鉴定后,通过IPTG诱导表达出目的 蛋白,经亲合层析纯化.结果 从小鼠的脑组织RNA中扩增出特异的β分泌酶基因片段长1 506 bp,经酶切鉴定及DNA序列测定,证实重组载体pET28a-BACE构建正确,表达融合蛋白分子量约为55 kD,经镍离子亲合柱层析纯化获得电泳级纯度的目的 蛋白.结论 在大肠杆菌中获得了小鼠β分泌酶的高效表达,为进一步研究其生物学功能和应用奠定了基础.     

HBV X 蛋白真核表达质粒的构建及其对反式转录激活作用的影响

目的　构建HBVX蛋白真核表达质粒并了解其对反式转录激活作用的影响。方法　用亚克隆方法构建HBVX蛋白真核表达质粒 ,以氯霉素乙酰转移酶转化率分析 (CAT试验 )揭示HBX蛋白的反式转录激活作用。结果　HBVX蛋白真核表达质粒转染HepaG2细胞后 ,以WesternBlot检测发现 2 μg、5 μg和 10 μg的 p5SGUTPLHBXDNA均能有效表达 ;CAT试验揭示 2 μg、5 μg、10μg的 p5SGUTPLHBXDNA对报道基因 pHE2×CAT的14 C -标记乙酰化氯霉素转化率分别为 (4 5 .5± 2 5 .9) %、(6 5 .6± 14.4) %和 (6 8.8± 19.7) %。结论　本结果为进一步研究HBVX蛋白的反式转录激活作用打下了基础     

融合蛋白pTAT-XIAP的原核表达及穿透血脑屏障功能的鉴定

目的 构建pTAT-XIAP原核表达载体,以获得pTAT-XIAP融合蛋白,并研究该融合蛋白穿透血脑屏障的功能.方法 在体外合成大鼠XIAP基因,将其插入pTAT-HA质粒,构建pTAT-XIAP融合蛋白表达载体,转入大肠杆菌表达菌株BL21plysS进行诱导表达.pTAT-XIAP融合蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化,SDS-PAGE及Western印迹鉴定融合蛋白.pTAT-XIAP融合蛋白腹腔注射SD大鼠体内,免疫荧光法检测在脑组织的分布.结果 表达产物经SDS-PAGE及Western印迹分析后,在64kD处有一明显表达条带,与理论结果相符.免疫荧光法检测,pTAT-XIAP融合蛋白在大脑皮质、基底节等广泛分布.结论 重组融合蛋白pTAT-XIAP成功表达并可穿透血脑屏障,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

Sart3基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

采用RT-PcR技术从人胎盘组织中扩增出T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(san3)基因片段,定向克隆人质粒pEGFP-N1,进行酶切、PCR和测序鉴定;构建重组原核表达载体San3/pTYB1,并转化大肠杆菌进行表达.结果目的基因经酶切、PCR鉴定与预期相符,测序结果显示目的基因与GeneBank登陆的序列完全一致;工程化大肠杆菌经IPTG诱导表达约100 kD的目的蛋白.为蛋白纯化和进一步研究其功能、寻找肿瘤抗原肽及制备肿瘤疫苗奠定了实验基础.     

人TAT-PDX-1融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

目的构建人TAT-PDX-1表达载体,并对其融合蛋白进行纯化。方法采用RT-PCR技术从人胰腺组织中获得目的基因hPDX-1,将TAT序列与PDX-1克隆到原核表达载体pET-28a;用IPTG诱导、表达融合蛋白;NiNTAagaros纯化融合蛋白,Western blot鉴定。结果目的片段PDX-1被有效扩增,DNA序列测定表明所构建重组质粒pET28a-TAT-h PDX-1与设计相同;TAT-PDX-1融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达并成功纯化。结论成功地获得了TAT-hPDX-1融合基因的表达产物,为进一步研究及临床应用奠定了基础。     

GST-NP1融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

通过选用大肠杆菌偏好密码子对兔抗御素基因进行改造 ,人工合成兔防御素基因构建大肠杆菌GST -NP1融合基因在大肠杆菌中表达。研究表明 :蛋白质经过亲和层析洗脱纯化 ,SDS -PAGE电泳分析 ,只在目的分子量处出现单一条带。灰度扫描分析表明 ,表达量最高可达总蛋白的 2 7 7%。     

Receptor-binding domain of SARS-Cov spike protein： Soluble expression in E.coli,purification and functional characterization

AIM: To find a soluble and functional recombinant receptor-binding domain of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus (SARS-Cov), and to analyze its receptor binding ability. METHODS: Three fusion tags (glutathione S-transferase, GST; thioredoxin, Trx; maltose-binding protein, MBP), which preferably contributes to increasing solubility and to facilitating the proper folding of heteroprotein, were used to acquire the soluble and functional expression of RBD protein in Escherichia coli(BL21(DE3) and Rosetta-gamiB (DE3) strains). The receptor binding ability of the purified soluble RBD protein was then detected by ELISA and flow cytometry assay. RESULTS: RBD of SARS-Cov spike protein was expressed as inclusion body when fused as TrxA tag form in both BL21 (DE3) and Rosetta-gamiB (DE3) under many different cultures and induction conditions. And there was no visible expression band on SDS-PAGE when RBD was expressed as MBP tagged form. Only GST tagged RBD was soluble expressed in BL21(DE3), and the protein was purified by AKTA Prime Chromatography system. The ELISA data showed that GST·RBD antigen had positive reaction with anti-RBD mouse monoclonal antibody 1A5. Further flow cytometry assay demonstrated the high efficiency of RBD's binding ability to ACE2 (angiotensin-converting enzyme 2) positive Vero E6 cell. And ACE2 was proved as a cellular receptor that meditated an initial-affinity interaction with SARS-Cov spike protein. The geometrical mean of GST and GST·RBD binding to Vero E6 cells were 77.08 and 352.73 respectively. CONCLUSION: In this paper, we get sufficient soluble N terminal GST tagged RBD protein expressed in E.coli BL21 (DE3); data from ELISA and flow cytometry assay demonstrate that the recombinant protein is functional and binding to ACE2 positive Vero E6 cell efficiently. And the recombinant RBD derived from E.coli can be used to developing subunit vaccine to block S protein binding with receptor and to neutralizing SARS-Cov infection.     

Fusion expression of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein in E.coli

AIM: To produce a recombinant protein rMBP-NAP, which was fusionally expressed by Helicobacter pylori (H pylori) neutrophil-activating protein (NAP) and E. coli maltose binding protein (MBP) and to evaluate its immunoreactivity and immunogenicity. METHODS: Neutrophil-activating protein gene of H pylori (HP-napA) was subcloned from the recombinant plasmid pNEB-napA, and fused to MalE gene of expressing vector pMAL-c2x. The recombinant plasmid pMAL-c2x-napA was confirmed by restriction enzyme digestion, and then transformed into E. coli TB1. Fusion protein rMBP-NAP was induced by IPTG and identified by SDS-PAGE analysis. Soluble rMBP-NAP was purified by amylose affinity chromatography. Immunoreactivity and immunogenicity of the fusion protein were evaluated by animal experiment, Western blotting with human H pylori anti-sera. RESULTS: E.coli TB1 carrying recombinant plasmid pMAL-c2x-napA was constructed and led to a high efficiency cytosol expression of fusion protein rBMP -NAP when induced by IPTG. The molecular weight of rBMP-NAP was about 57 kD, accounting for 37.55% of the total protein in the sonicated supematant of E. coli TB1 (pMAL-c2x-napA). The purity of the fusion protein after one-step affinity chromatography was 94% and the yield was 100 mg per liter of bacterial culture. The purified fusion protein could be specifically recognized by both human anti-sera from clinical patients with H pylori infection and rabbit sera immunized by rMBP-NAP itself. CONCLUSION: Recombinant protein rMBP-NAP might be a novel antigen for vaccine development against H pylori.     

乙型脑炎病毒E蛋白基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达

目的　在大肠埃希菌中表达乙型脑炎病毒E蛋白。方法　反转录聚合酶链反应 (PCR)扩增乙型脑炎病毒 (JEV)E蛋白基因 ,克隆入原核表达载体pET 2 8a,转化大肠埃希菌BL2 1(ED3)。经异丙基巯基半乳糖 (IPTG)诱导表达后 ,十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和蛋白免疫印迹分析表达产物。结果　本室所保存毒株的E蛋白与已发表的序列比较 ,有 5个核苷酸改变 ,可分别导致氨基酸替代。所表达的E蛋白的相对分子质量约为 5 0 0 0 0 ,表达量约占菌体总蛋白的 35 %。结论　在大肠埃希菌中成功地表达了JEVE蛋白 ,为制备JE实验室诊断抗原和分析E蛋白基因结构与功能的关系打下了基础     

微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP23融合蛋白在大肠杆菌的表达

目的　构建微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP2 3的原核表达载体 ,并且在大肠杆菌中表达。方法　用HindⅢ和EcoRⅠ酶分别从 pET - 2 8a(+)和 pMD18-T - 2 3质粒中酶切得到线性片段和CP2 3基因片段 ,然后用T4酶连接 ,构建重组的CP2 3的原核表达载体 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达 ,并用SDS -PAGE、ELISA和Westernblotting进行鉴定。结果　构建了CP2 3的原核表达载体 ,得到了一分子量约为 14kDa的融合蛋白 ,占大肠杆菌总蛋白的 36 %。结论　CP2 3融合蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达     

结核杆菌Mtb8.4抗原在大肠杆菌中表达的初步研究

目的构建结核杆菌低分子质量抗原Mtb8.4的原核表达质粒,并检测其在大肠杆菌中的表达。方法PCR扩增目的基因,克隆到质粒pETHisT7启动子的下游;酶切和PCR法鉴定重组子;阳性重组子转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导后,SDSPAGE电泳分析。结果重组质粒pETHisMtb8.4成功构建,含阳性重组子的菌体蛋白经SDSPAGE电泳出现一新的蛋白带,与预计相符。结论初步证明构建的大肠杆菌重组体能够表达目的蛋白,为进一步对其免疫效应的研究奠定了基础。     

钩端螺旋体鞭毛蛋白B(FlaB)基因flaB在大肠杆菌内的表达

目的　在大肠杆菌中高效表达钩端螺旋体内鞭毛蛋白 (FlaB)用于钩体病的诊断和预防。方法　将目的基因flaB定向克隆至原核表达载体 pGEX - 5T ,构建重组融合表达质粒 pGF ;Western -blot鉴定其特异性 ,ELISA法判定其用于钩体病诊断的可行性。结果　GST -FlaB主要以包涵体形式表达 ,表达量约占菌体总蛋白的 4 0 % ;Western -blot结果显示该蛋白与FlaB抗血清能呈现明显的单一条带 ;包涵体经TritonX - 10 0及尿素纯化后 ,纯度可达 90 % ,并且能溶于包被缓冲液中 ;ELISA检测显示纯化后的GST -FlaB具有较好的特异性。结论　钩端螺旋体FlaB可以高效表达并可能用于ELISA检测及钩体病的预防。     

大肠杆菌感染诱导THP-1细胞凋亡的研究

目的观察大肠杆菌对THP-1细胞是否具有凋亡诱导作用。方法当细胞与细菌浓度比为1∶10时,分别于诱导后10min2、0min3、0min6、0min及90min时用Giemsa染色观察细胞形态学改变,并用AnnexinVFITC/PI流式细胞仪进行凋亡定量分析。结果大肠杆菌感染后10min及20min时偶见细胞凋亡,感染30min、60min及90min时可见许多细胞出现核固缩、核断裂及凋亡小体形成等形态学变化,流式细胞仪测定表明细胞凋亡率增高,且显示一定的时间效应。且二种方法所得结果一致。结论大肠杆菌以时间依赖方式诱导THP-1细胞发生凋亡。     

HIV-1 p24和gp41融合基因表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化

目的用基因重组技术将HIV-1p24基因以及gp41基因具有抗原线性中和表位的部分重组连接，构建重组质粒，并在大肠埃希菌中高效表达融合蛋白。方法设计带有酶切位点的引物，分别PCR扩增p24和gp41两个基因，将它们分别连接到pMD18-T载体中，测序验证后，挑选出含有目的基因的正确克隆。将p24片段酶切后连接到gp41基因所在的pMD18T载体中，再将连接后的两个基因酶切，重新连接到pET21a表达载体中。将表达载体转染大肠埃希菌诱导表达，经Western-blot验证表达正确。结果融合蛋白p24-gp41在大肠埃希菌中高效表达。结论融合蛋白p24-gp41可以在pET21a表达载体中高效表达。     

创伤弧菌溶细胞素基因在大肠杆菌中的表达及溶血活性鉴定

目的用大肠杆菌表达系统表达创伤弧菌溶细胞素,并对其溶血活性进行评价。为今后的免疫学活性研究和单克隆检测试剂盒的研发奠定基础。方法构建pET28a( )-vvhA表达载体,对包涵体进行三步洗涤后,用金属亲合层析(HisTag)纯化重组蛋白,并用溶血试验验证重组蛋白活性。结果用基因工程的方法成功获得高表达、高纯度(纯度≥96%)重组蛋白VVC。利用兔红细胞溶血试验检测表明,重组蛋白具有溶血活性,其活性为0.2μg/HU。结论成功用大肠杆菌表达系统表达创伤弧菌溶细胞素并对其纯化、复性条件进行优化。