猫胰岛细胞的分离纯化和培养

目的：建立猫胰岛细胞分离纯化和体外培养的方法。方法：在自制玻棒持续振荡下常规分离胰岛细胞,进行单层细胞培养和组织块培养。采用差速贴壁法、碘乙酸法、消化时间差法去除培养中的成纤维细胞。动态收集单层细胞培养液,分别用放射免疫法和比色法检测胰岛素和淀粉酶含量。光镜下观察5-30d细胞生长情况。分别对培养第5、15、21天的细胞进行葡萄糖负荷试验、组织块培养的细胞进行透射电镜检查。结果：猫胰岛细胞在体外培养可保持良好的生物学活性3周或3周以上（组织培养）。结论：在国内首次建立的猫体外胰岛细胞培养方法可行可靠,体外培养第7-25d的细胞形态和功能良好,是进行实验研究的极好材料。     

兔骨髓间质干细胞的体外分离,培养及活性鉴定

目的：建立一种体外分离培养自体兔骨髓间质干细胞（ＭａｒｒｏｗＳｔｒｏｍａｌＣｅｌｌｓ,ＭＳＣｓ）的方法。方法：抽取兔骨髓液３～５ｍｌ经密度梯度离心得骨髓单个核细胞,以１．６×１０＾４／ｃｍ＾２细胞浓度培养,１２～１４ｄ后得到贴壁生长的单层细胞,随后进入传代培养,每传一代约５～７ｄ。结果：原代培养的,以及传代后培养的细胞均为贴壁生长的,均匀一致的纺锤形细胞,两种细胞经体外特殊环境诱导后可转化为骨髓网     

兔骨髓间质干细胞的体外分离、培养及活性鉴定

目的：建立一种体外分离培养自体兔骨髓间质干细胞（ Ｍ ａｒｒｏｗ Ｓｔｒｏｍ ａｌ Ｃｅｌｌｓ， Ｍ Ｓ Ｃｓ）的方法。方法：抽取兔骨髓液３～５ ｍ ｌ，经密度梯度离心得骨髓单个核细胞，以１６×１０４／ｃｍ ２ 细胞浓度培养，１２～１４ ｄ 后得到贴壁生长的单层细胞，随后进入传代培养，每传一代约 ５～７ ｄ。结果：原代培养的、以及传代后培养的细胞均为贴壁生长的、均匀一致的纺锤形细胞。两种细胞经体外特殊环境诱导后均可转化为骨髓网状间质细胞和成骨细胞。结论：该细胞经体外长期培养后仍具有多潜能转化活性，确系骨髓间质干细胞。为该细胞的广泛应用奠定基础。     

人胎胰腺的胰岛分离与胰岛细胞培养质量的实验研究

取水囊引产的４例胎龄为１８～２８周的人胎胰腺，用胶原酶消化分离胰岛，分别对３，５，７，９，１１，１３ｄ培养的胰岛细胞进行形态学观察，并采用放射性核素１２５Ⅰ标记抗原作放射免疫测定（ＲＩＡ）其培养上清液中胰岛素及Ｃ－肽的含量．结果：经５～９ｄ培养的胰岛细胞，生长良好，细胞活率为９０％左右，其中大多数为β细胞．５，７，９ｄ培养液上清液中胰岛素的含量依次为６４７５，７２３及７２７０ＩＵ／Ｌ；Ｃ－肽的含量依次为６０５，６２及＞６ｍｇ／Ｌ．分别高于正常血清的两倍、一倍以上．经以同样方法培养的兔胰岛细胞用于四氧嘧啶实验性兔糖尿病模型治疗，兔糖尿病模型的血糖均值由（４７９７９±０９２３３）ｇ／Ｌ下降为（３３１９３±０４１１０）ｇ／Ｌ（Ｐ＜００１）；胰岛素由（２６５±１４）ＩＵ／Ｌ上升为（１３３８±１５）ＩＵ／Ｌ（Ｐ＜００５）．结果说明本法培养的胰岛细胞用于移植以５～９ｄ为宜     

1,25（OH）2D3对4种细胞碱性磷酸酶活性的影响

观察１，２５（ＯＨ）２Ｄ３对体外培养的人牙乳头细胞，牙髓细胞，牙龈细胞，成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响。方法；用组织块培养法和ＡＬＰ测定法。结果：在１，２５（ＯＨ）２Ｄ３ｄ和５ｄ下人牙乳头细胞，人牙髓细胞及人成骨细胞ＡＬＰ活性增加，第７日变化不明显，而人牙龈细胞未见明显变化。     

胎儿动脉平滑肌细胞培养方法的研究

目的：对胎儿动脉平滑肌细胞（ｈＡＳＭＣ） 培养方法进行研究。方法：贴块法、酶解法、贴块＋ 酶解法。结果：３ 种方法成功培养了胎儿动脉平滑肌细胞，培养的细胞呈典型“峰 谷”样生长，透射电镜下可见胞浆内含有肌丝束及其相联的致密体。结论：贴块法培养ｈＡＳＭＣ生长周期较长，但成功率较高；酶解法的消化程度不易掌握，但其生长周期较前者短４～５ ｄ；二者相结合法的贴块培养细胞从组织块中迁移萌出时间比常规贴块法短１ ～２ ｄ。     

人胎胰岛细胞的分离培养及其意义

目的 初步探索人胎胰岛细胞的分离培养方法,以期深入研究胰岛细胞的凋亡机制及开展人胰岛细胞移植。方法 采用机械分离、体外胶原酶消化,并通过组织块联合培养、转皿、时间消化差法获取人胎胰岛细胞,观察胰岛细胞生长及开展人胰岛素释放情况。结果 双硫腙（Dithizone）染色显示胰岛纯度约80％～90％,细胞培养至7～9d为其对数生长期,培养至11d可测到胰岛素释放高峰,培养至15d仍具有一定的生物活性。结论 机械分离消化、转皿、时间消化差法可获得生物活性较好的胰岛细胞,为深入探讨胰岛细胞凋亡、胰岛细胞移植提供细胞基础。     

组织工程皮肤种子细胞生物学特性的研究

目的建立一种分离培齐组织工程皮肤种子细胞的方法,并对细胞的生物学特性进行研究。方法分别通过Dispase-胰蛋白酶消化法和组织块法对表皮干细胞和成纤维细胞进行分离培养,利用倒置相差显微镜和扫描电镜等对其进行形态学观察,MTT比色法对细胞的增殖动态进行测定,免疫组化法对两种细胞进行鉴定。结果分离的表皮细胞和成纤维细胞可在体外快速贴壁生长、增殖,活力较好,免疫组织化学染色为阳性。结论通过Dispase-胰蛋白酶消化法和组织块法分别获得的表皮干细胞和成纤维细胞在体外能够快速扩增、培养,可为下一步组织工程皮肤的构建提供充足、可靠的细胞源。     

SD大鼠乳鼠胰岛细胞体外培养方法探讨

目的 探讨一种获得足量、纯度高和功能良好的大鼠胰岛细胞的体外培养方法。方法采用胶原酶对胰腺组织进行分次短时间消化；细胞接种18h时，倒置显微镜下观察细胞生长情况；将细胞转入新的培养板培养，定期收集培养液上清。分别检测胰岛素、淀粉酶含量及葡萄糖刺激下的胰岛素分泌水平。结果 SD大鼠乳鼠原代培养的胰岛细胞中成纤维细胞明显减少，双硫腙可染率85％-90％，锥虫兰染色细胞活力90％以上，培养7～11d的细胞分泌功能正常。结论 用胶原酶反复短时间消化胰腺组织，细胞接种后及时转板的方法可获得纯度较高、生长良好、适合实验研究的胰岛单层细胞。     

早孕期人绒毛组织的体外培养及绒毛膜促性腺激素分泌的动态观察

建立人孕６～８周绒毛组织块直接体外贴壁静止培养方法，对培养的绒毛滋养层细胞进行形态观察，并对绒毛膜促性腺激素（ＨＣＧ）分泌的动态进行观察。结果表明：培养第２天滋养层细胞开始向外生长，第５天最旺盛，细胞生长可维持１０天左右。ＨＣＧ于培养第５天达高峰，第７天开始下降，第１３天降至可测水平以下。这种培养方法的建立不仅为抗早孕药物筛选提供一个离体模型，而且有助于滋养层细胞功能的研究。     

体外培养大鼠胰岛细胞的观察

目的：对大鼠胰岛细胞培养方法进行改进并对胰岛细胞进行体外观察。方法：选用 ３～４ 周龄 Ｗ ｉｓｔａｒ 大鼠胰腺,用 ２００ Ｕ／ｍ ｌ的 Ｖ 型胶原酶消化,１０８ μｍ 孔径尼龙筛网滤过消化产物后,得到大小较一致的细胞团,加入含有１１１ ｍ ｍ ｏｌ／ Ｌ 葡萄糖的 Ｒ Ｐ Ｍ Ｉ１６４０ 培养液内,进行体外培养。利用倒置相差显微镜、透射电镜、免疫组织化学技术对胰岛 β细胞形态和结构进行观察;应用放射免疫技术对胰岛素进行检测和分析。结果：胰岛细胞可以在体外培养 １７ ｄ。培养初期,细胞形态及分泌功能较稳定;随培养时间延长,细胞逐渐破碎死亡,上清液内胰岛素水平也持续下降。结论：改进后的胰岛细胞培养方法简单可靠,细胞培养至 ４８～７２ ｈ 时,可用于实验研究。     

SD大鼠乳鼠胰岛细胞体外培养方法探讨

目的探讨一种获得足量、纯度高和功能良好的大鼠胰岛细胞的体外培养方法。方法采用胶原酶对胰腺组织进行分次短时间消化;细胞接种18 h时,倒置显微镜下观察细胞生长情况;将细胞转入新的培养板培养,定期收集培养液上清。分别检测胰岛素、淀粉酶含量及葡萄糖刺激下的胰岛素分泌水平。结果SD大鼠乳鼠原代培养的胰岛细胞中成纤维细胞明显减少,双硫腙可染率85%~90%,锥虫兰染色细胞活力90%以上,培养7~11 d的细胞分泌功能正常。结论用胶原酶反复短时间消化胰腺组织,细胞接种后及时转板的方法可获得纯度较高、生长良好、适合实验研究的胰岛单层细胞。     

Isolation and culture of adult Sertoli cells and their effects on the function of co-cultured allogeneic islets in vitro

Background Globally, 180 million people suffer from diabetes mellitus. Islet transplantation is believed to be an almost ideal therapy for insulin-dependent patients. How to maintain the viability and the function of isolated human islets is a challenge in clinical practice. Sertoli cells are considered ‘nurse cells’in the seminiferous tubules and have been used in cell graft protocols for neurodegenerative diseases and diabetes in many studies. Many researchers have used immature murine testes as the primarily source of Sertoli cells in islet transplantation because they are easily purified. Mature human Sertoli cells have been seldom investigated. In the present study, we developed a method for the isolation and culture of Sertoli cells derived from adult human testes, and investigated their effects on the function of allogeneic islets when they were cultured together in vitro.Methods Adult Sertoli cells were prepared successfully by two-step enzyme digestion with trypsin, collagenase and hyaluronidase. They were identified by morphological characteristics and their activity was determined by MTT colorimetry over a 28-day culture time in vitro. A glucose-stimulated insulin secretion test was performed to detect the effects of Sertoli cells on allogeneic islets’ function when they were co-cultured for 21 days in vitro.Results In cultured cells, mature human Sertoli cells accounted for more than 90% of total cells. The activity of Sertoli cells reached 95% and they remained highly cytoactive for a long time in vitro (P>0.05). Compared with the islets cultured alone, the co-cultured islets with allogeneic Sertoli cells maintained higher sensitivity to glucose stimulation for the duration of the experiment (P<0.01).Conclusions A method of isolation and culture of Sertoli cells from adult testes has been established. Sertoli cells could enhance allogeneic islets’ function when they were co-cultured in vitro. They could be a helper cell in islet transplantation. Chin Med J 2005; 118(22):1857-1862     

软脂酸对体外原代培养大鼠胰岛细胞凋亡作用的实验研究

目的 观察软脂酸诱导体外原代培养胰岛细胞的凋亡，初步探讨软脂酸在2型糖尿病发病中的机制。方法 应用分离的体外单层培养SD大鼠胰岛细胞，与不同浓度软脂酸(分别为0、0．125、0．250、0．500mmol／L)共同孵育48h，用放免法测定培养液中胰岛素含量，PI／Hoechst33342双染法荧光显微镜观察胰岛细胞凋亡的形态变化。结果 0．250、0．5mmol／L软脂酸可抑制高糖刺激下的胰岛素分泌，促进胰岛细胞的凋亡。结论 软脂酸可诱导胰岛细胞凋亡，凋亡程度与游离软脂酸浓度有关。     

甘油三酯对体外培养大鼠胰岛细胞功能的影响

OBJECTIVE: To study the effect of triglycerides (TGs) on the function of in vitro cultured rat islet cells. METHODS: SD rat islet cells were isolated for monolayer cell culture and treated with TGs at different concentrations (0, 0.5, 2.5, 5.0, 10.0 mmol/L) for 72 h. Insulin level in the cell culture media was measured after glucose loading test, and the deposition of fat droplets in the islet cells observed by oil red O-staining. RESULTS: No obvious effect was observed after a 72-h incubation of the islet cells with TGs at low glucose level (2.8 mmol/L), while with the stimulation of high-level glucose (27.8 mmol/L), the insulin secretion was significantly inhibited by TGs of higher concentrations (5.0, 10.0 mmol/L). The deposition of fat droplets was found in the islet cells after incubation with TGs, with TGs of higher concentrations. CONCLUSION: TGs induces deposition of fat droplets in islet cells in vitro, and may inhibit the insulin-secreting function of the cells.     

人晶状体上皮细胞体外培养方法的改良

目的改良现有人晶体上皮细胞的培养方法,建立稳定的体外培养模型。方法用改良培养法对人胚胎眼晶体前囊膜进行培养,并利用形态学检查方法进行检测和鉴定。结果组织块法在加入培养基24 h内即可见细胞生长,且保持上皮细胞形态,1wk左右细胞融合。在体外可传5代以后细胞衰老,存活者呈成纤维细胞状。消化法中2 d后见细胞壁生长,1周左右细胞融合。结论成功地改进了建立晶状体上皮细胞体外培养模型的方法,为研究后囊膜混浊发病机制提供了方法学基础。     

甘油三酯对体外培养大鼠胰岛细胞功能的影响

目的研究甘油三酯对胰岛细胞分泌功能的影响。方法体外分离SD大鼠胰岛细胞并进行单层细胞培养,以不同浓度(0、0.5、2.5、5.0 10.0 mmol/L)甘油三酯与胰岛细胞共同孵育72 h后,进行葡萄糖负荷试验,放射免疫法检测培养液中胰岛素水平,以评价胰岛细胞功能变化;同时采用油红染色方法,光镜下观察细胞内脂肪堆积情况。结果低糖(2.8 mmol/L)刺激下,甘油三酯对胰岛细胞的胰岛素分泌无明显影响,高糖(27.8 mmol/L)负荷下,高浓度甘油三酯(5.0、10.0 mmol/L)可抑制胰岛细胞的胰岛素分泌(P<0.05);油红染色见甘油三酯处理组胰岛细胞内均有脂肪堆积,尤以高浓度组明显。结论甘油三酯可导致体外培养胰岛细胞内脂肪堆积,抑制细胞的分泌功能。     

人胚胎生殖系细胞分离与体外培养的初步研究

目的:初步探讨人胚胎生殖系细胞的分离与体外培养.方法:体外分离人胚胎生殖嵴和肠系膜组织,按单纯机械分离、酶消化分离、二者结合法及是否有饲养层将组织分为5种不同的方式培养后,用碱性磷酸酶标记,计数阳性克隆并进行比较.结果:酶消化法培养所获得的克隆较单纯机械分离方法多,原代培养时种植到饲养层上效果较好.将分离到的组织用0.25％胰酶消化3 min,种植到丝裂霉素C处理过的小鼠胚胎成纤维细胞上培养3 d,挑取克隆传代,在第10天形成30.7 个阳性克隆,显著高于其他方法获得的阳性克隆数.用碱性磷酸酶标记的细胞(克隆)具有多样性,细胞胞体为圆形,分为有突起和无突起两种;阳性细胞克隆呈圆球形、条带形和块形,与周围细胞分界清楚.结论:人胚胎体内的微环境限制生殖系细胞的体外扩增培养,原代培养需要在饲养层上进行且宜用酶消化法尽早传代.