人血管生成素1和血管内皮生长因子165重组腺病毒载体构建及目的基因表达

目的:拟构建人血管生成素1和血管内皮生长因子165腺病毒载体,观察靶细胞转染后目的基因的表达水平。方法:通过RT-PCR方法克隆人Ang-1全长编码基因,PCR法以pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板扩增VEGF165基因,分别将目的基因酶切连接到带有GFP标记的pTrack-CMV质粒上,构建重组质粒pTrack-CMV-Ang-1和pTrack-CMV-VEGF165,经PCR、酶切和测序鉴定后将其PmeI线性化与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAdeasy-1-pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165,经PacI线性化后转染QBI-293A包装细胞,收获重组腺病毒Ad-Ang-1及Ad-VEGF165。结果:PCR﹑双酶切和测序鉴定结果证实成功构建pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165重组转移质粒,PmeI线性化后重组腺病毒载体获得成功包装。脂质体转染QBI-293A细胞后光镜下可见由腺病毒引起的细胞圆缩、聚集呈菌落状的典型细胞病理性改变;荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,且荧光强度随培养时间延长而逐渐增强;经多轮感染、扩增后,病毒效价可达(2.0～5.0)×1010pfu/mL。转染48h后,293A细胞中的血管生成素1与血管内皮生长因子含量均明显提高(F=427.93,17.93,P<0.05)。结论:成功构建并获得了Ad-Ang-1及Ad-VEGF165重组腺病毒,血管生成素1与血管内皮生长因子165均能在靶细胞中有效表达。     

重组人血管内皮生长因子165腺病毒载体的构建与鉴定

目的 探讨构建携带人血管内皮细胞生长因子(hVEGF)的重组腺病毒载体,为进一步的基因转染构建组织工程骨的血管化提供实验基础.方法 采用RT-PCR扩增的方法获得人源性的hVEGF165,并克隆入穿梭质粒pAdTraek CMV.构建的质粒pAdTrack CMV-VEGF165经酶切及测序鉴定正确后,通过pAdeasy 1质粒的介导与腺病毒包装质粒pAdTrack CMV.VEGF165共转染至人胚肾细胞HEK293,经同源重组后获得携带人VEGF的重组腺病毒pAdTrack CMV.VEGF165.应用PCR鉴定重组腺病毒,空斑传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒,测定病毒滴度.结果 PCR鉴定证实重组腺病毒含有人VEGF,病毒滴度为0.5×10"pfu/ml.结论 成功构建的携带人VEGF的重组腺病毒载体能在HEK293细胞内扩增获得足够高的病毒滴度,为基因治疗构建组织工程骨血管化的研究奠定基础.     

携带人血管内皮生长因子165基因的复制缺陷型腺病毒载体的构建和鉴定

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)165基因的重组腺病毒载体。方法:应用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切质粒PDC-VEGF和PDC315,连接DNA目的片段后转化大肠杆菌DH5α构建重组质粒PDC315-VEGF,对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体将质粒PDC315-VEGF与质粒pBHGE3共转染293细胞获取重组腺病毒,以重组腺病毒DNA为模板,PCR鉴定构建的重组腺病毒。扩增、浓缩纯化重组腺病毒,微量滴定法测定腺病毒滴度。结果:通过连接反应构建重组质粒PDC315-VEGF,酶切分析和测序证明构建正确。经细胞内同源重组构建携带人VEGF165基因的重组腺病毒,PCR扩增421bpVEGF165片段,证实VEGF165基因成功克隆到复制缺陷型腺病毒载体,腺病毒滴度为5.0×109pfu/mL。结论:通过双质粒细胞同源重组,生产携带人VEGF165基因的重组腺病毒,为动物试验奠定基础。     

VEGF165基因重组腺病毒载体的构建及其促血管形成作用

目的构建携带人血管内皮细胞生长因子165（VEGF165）基因的腺病毒表达载体（Ad—VEGF165）,并观察其感染QBI．293A靶细胞后目的基因的表达及促进血管形成的作用。方法以含有VEGF165基因片段的pSV-K3-VEGF165质粒为模板,PCR扩增获得的VEGF165目的片段（XhoI、EcoRV）亚克隆至GFP标记的pAdTrack—CMV载体中构建重组转移质粒pAdTrack．CMV．VEGF165,行PCR、双酶切和DNA测序鉴定。将测序正确的pAdTrack—CMV．VEGFl65质粒经PmeI线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy．1共转化BJ5183细菌,获得同源重组腺病毒质粒pAdEasy-1．pAdTrack-CMV．VEGF165（pAd．VEGF165）,再经PacI线性化后用脂质体转染QBI．293A包装细胞,通过多轮扩增和氯化铯密度梯度离心纯化获得Ad．VEGFl65重组腺病毒。RT．PCR和ELISA检测腺病毒介导的外源性VEGFl65基因在QB｜．293A细胞中的转录和表达。将孵育8d的生长状态良好的鸡胚随机分成Ad空载体腺病毒组、Ad—VEGFI65重组腺病毒组、NS组。采用鸡胚尿囊膜（CAM）法检测VEGF165重组腺病毒促进尿囊膜血管形成活性。结果PCR、双酶切和测序鉴定结果证实成功构建了pAdTrack．CMV—VEGF165重组转移质粒,并获得了高滴度的Ad．VEGF165重组腺病毒,其病毒效价可达2×10^10pfu／mL。Ad-VEGFl65感染后,QBI．293A细胞中的VEGF165含量较QBI．293A细胞对照组和Ad空病毒感染组均明显升高（P〈0．05）。Ad-VEGF165组与Ad．空载体组和NS组比较,CAM三级分支血管生长更旺盛,毛细血管更丰富（P〈0．05）。结论成功获得了携带人VEGF165基因的腺病毒表达载体,具有明显的促CAM血管形成活性,为进一步开展VEGF165基因修饰干细胞的应用研究奠定了实验基础。     

人血管生成素—1和血管内皮生长因子VEGF165腺病毒载体构建

目的：克隆人血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)和血管生成素－1（angiopoietin-1)的全长编码基因，构建表达该基因的复制缺陷型腺病毒载体Ad-Ang1和Ad-VEGF165。方法：通过RT－PCR方法克隆人VEGF165和Ang1全长编码基因。Ad-VEGF165和Ad-Ang1通过同源重组方法构建。将Ad-VEGF165和／或Ad-Ang1转染大鼠胚胎心脏成肌细胞（H9C2）24h后，Western blot/方法分析VEGF165和Ang1蛋白表达量；核酸电泳分析细胞基因组降解检测凋亡水平。结果：测序显示VEGF165序列与基因库序列相同；Ang1序列与基因库序列存在一个碱基的差异，但编码氨基酸无改变。VEGF165和Ang1蛋白表达分别为对照组的11.65倍和3．53倍。Ad-VEGF165和／或Ad-Ang1转染后的H9C2细胞对过氧化氢诱导的细胞凋亡具有明显的抵抗能力。结论：所构建的Ad-Ang1和Ad-VEGF165能有效转染心脏成肌细胞，表达出功能性目的蛋白，具有抗细胞凋亡作用。     

心肌内注射载体腺病毒血管内皮生长因子165治疗心肌缺血的安全性

目的:血管内皮生长因子在动脉粥样硬化斑块中的高表达可能会促进斑块的发生与发展。因此,就产生了在动脉粥样硬化进程中局部应用血管内皮生长因子基因治疗心肌缺血是否会产生促进动脉粥样硬化斑块发展的安全性问题。方法:实验于2006-05/2007-03在长海医院胸心外科实验室完成。①实验材料:SPF级雄性新西兰大白兔28只,体质量2.0～2.5kg;表达hVEGF165的腺病毒及表达LacZ的腺病毒AdLacZ由解放军第二军医大学长海医院胸心外科自行构建。②实验分组:将动物随机分为实验组和对照组,每组14只。③实验过程:将28只雄性新西兰大白兔应用球囊损伤 高脂饮食喂养建立动脉粥样硬化模型后平均分成两组:Ad-hVEGF165治疗组和AdLacZ对照组;结扎兔左冠状动脉前降支建立急性心肌缺血模型,载体腺病毒直接心肌内注射治疗。④实验评估:4周、8周后进行兔斑块形态学、病理及心功能检测。结果:①治疗组和对照组兔均形成明显的动脉粥样硬化斑块,苏丹Ⅳ染色为猩红色,两组在斑块面积、斑块周径及斑块最大厚度相比差异无明显统计学意义。②治疗组与对照组心功能在术后4周时相比较术前都有下降,对照组较治疗组下降更明显(P<0.05)。③治疗组心肌毛细血管密度比对照组增加,缺血心肌及动脉粥样斑块中均发现人血管内皮生长因子表达。结论:在应用治疗剂量Ad-hVEGF165治疗心肌缺血时不会促进动脉粥样硬化的发展。     

构建含人血管内皮细胞生长因子121腺病毒表达载体的体外表达实验

目的：构建携带人血管内皮细胞生长因子121cDNA的腺病毒表达载体，探讨应用血管内皮细胞生长因子基因治疗缺血性疾患的可行性。方法：实验于2003—05／2004—02于解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所第6研究室（创伤烧伤复合伤国家重点实验室）完成。穿梭质粒pDC315和Ad5腺病毒基因组质粒pBHGloxdeltaE1，3Cre由解放军第三军医大学免疫学教研室邹强博士惠赠。pUC18-血管内皮细胞生长因子由第三军医大学高原医学教研室惠赠。BamH I，Xba I，NcoI DNA限制性内切酶均购自Takara公司；鼠抗人血管内皮细胞生长因子121单克隆抗体购自ROCHE公司；用双酶切法将pUC18-人血管内皮细胞生长因子121质粒中的人血管内皮细胞生长因子121cDNA克隆到穿梭质粒pDC315中，与腺病毒质粒pBHGloxdehaE1，3Cre共同转染293细胞并反复扩增，构建携带目的基因的重组腺病毒，并进行滴度测定。用重组腺病毒感染NTH3T3细胞，用免疫组化方法检测人血管内皮细胞生长因子121在NTH3T3细胞中的表达。结果：（1）重组质粒pDC315-人血管内皮细胞生长因子121的鉴定：重组质粒经XbaI和NcoI酶切后，得到酶切片段长度为651bp的正向连接重组质粒。测序结果也证实作者重组质粒pDC315-人血管内皮细胞生长因子121序列正确。（2）Ad-血管内皮细胞生长因子重组腺病毒构建及滴度测定：pDC315-人血管内皮细胞生长因子121重组质粒和pBHGloxdehaE1，3Cre质粒共转染293细胞后7d，部分293细胞出现CPE，10d后出现CPE的细胞明显增多，约2周时绝大多数细胞出现CPE，而对照组未转染质粒的细胞未见CPE现象。最终重组腺病毒Ad-人血管内皮细胞生长因子121滴度为1．0&;#215;10^10-4．3&;#215;10^11PFU／mL。（3）血管内皮细胞生长因子基因在NIH3T3细胞中的表达：重组腺病毒转染NIH3T3细胞48h后行细胞免疫组织化学染色，结果显示细胞人血管内皮细胞生长因子121染色阳性，阳性染色主要位于细胞浆中，而未转染病毒的细胞染色极弱。结论：构建的携带人血管内皮细胞生长因子121基因的腺病毒表达载体可在真核细胞表达，有可能用于缺血性疾息的基因治疗。     

人血管生成素-1和血管内皮生长因子VEGF_(165)腺病毒载体构建

目的:克隆人血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor165,VEGF165)和血管生成素-1(angiopoietin-1)的全长编码基因,构建表达该基因的复制缺陷型腺病毒载体Ad-Ang1和Ad-VEGF165。方法:通过RT-PCR方法克隆人VEGF165和Ang1全长编码基因。Ad-VEGF165和Ad-Ang1通过同源重组方法构建。将Ad-VEGF165和/或Ad-Ang1转染大鼠胚胎心脏成肌细胞(H9C2)24h后,Westernblot方法分析VEGF165和Ang1蛋白表达量;核酸电泳分析细胞基因组降解检测凋亡水平。结果:测序显示VEGF165序列与基因库序列相同;Ang1序列与基因库序列存在一个碱基的差异,但编码氨基酸无改变。VEGF165和Ang1蛋白表达分别为对照组的11.65倍和3.53倍。Ad-VEGF165和/或Ad-Ang1转染后的H9C2细胞对过氧化氢诱导的细胞凋亡具有明显的抵抗能力。结论:所构建的Ad-Ang1和Ad-VEGF165能有效转染心脏成肌细胞,表达出功能性目的蛋白,具有抗细胞凋亡作用。     

携带人血管内皮生长因子165慢病毒表达载体的构建与表达

背景:已有研究证实血管内皮生长因子在正常肝脏肝部分切除后余肝的再生过程中发挥着重要的作用,但关于其对肝硬化肝脏是否也有相同作用国内外鲜有报道。目的:构建携带人血管内皮生长因子165基因的慢病毒载体,体外转染BLR3A大鼠肝细胞并观察该细胞中人血管内皮生长因子165基因的表达。方法:采用DNA重组技术将人血管内皮生长因子165基因克隆入pLenti6/V5-D-TOPO慢病毒表达载体中,筛选出阳性克隆与慢病毒包装系统ViraPowerTM Packaging Mix共转染293T细胞产生病毒颗粒,通过实时定量-聚合酶链反应法测定病毒滴度;携带人血管内皮生长因子165基因的慢病毒载体体外转染BLR3A大鼠肝细胞72h后,利用反转录-聚合酶链反应及Western blot法检测细胞中人VEGF165mRNA及蛋白的表达。结果与结论:成功构建了表达人VEGF165基因的慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO-VEGF165,测得病毒滴度为1.18×107VP/mL。重组慢病毒载体转染BLR3A大鼠肝细胞72h后,荧光蛋白表达率超过80%,反转录-聚合酶链反应及Western blot法测得转染组人血管内皮生长因子165mRNA及血管内皮生长因子165蛋白表达阳性。提示构建的携带人血管内皮生长因子165的慢病毒载体可有效转染BLR3A大鼠肝细胞,并促使该细胞表达人血管内皮生长因子165mRNA及蛋白。     

腺病毒介导的血管内皮生长因子联合干细胞生长因子治疗严重肢体缺血的实验研究

目的 探究血管内皮生长因子（VEGF）和干细胞生长因子（HGF）双基因腺病毒载体在缺血组织中促血管生成的作用及疗效。方法 将84只昆明小鼠随机分为假手术组、空白对照组、VEGF组、HGF组、VEGF+HGF组,构建左侧下肢缺血模型,血流仪观察缺血组织血运情况,Western blot及ELISA检测各组小鼠不同时间点VEGF、HGF表达,免疫组织化学染色检测缺血组织的血管生成情况（CD31、SMA）,以小鼠治疗期间副作用评估安全性。结果 建模成功后,各组小鼠左侧下肢血流流速均显著下降;术后第7天,各组小鼠左侧下肢血流流量均明显优于术后即刻（P <0.05）,且Ad-VEGF-HGF组小鼠左下肢血流量明显优于其他各组（P <0.05）;术后28 d Ad-VEGF-HGF组小鼠左下肢血流量逐步稳定,且术后Ad-VEGF-HGF组小鼠血流明显优于其余各组,且VEGF组、HGF组均显著优于对照组（P <0.05）;Western Blot及ELISA检测发现术后7、14、28 d时Ad-HGF组、Ad-VEGF组、Ad-VEGF-HGF组HGF蛋白、VEGF蛋白均明显高于对...