恶性疟原虫AMA—1（Ⅲ）毕氏酵母真核表达克隆的构建

①目的 构建恶性疟原虫AMA-1（Ⅲ）毕氏酵母真核表达克隆。②方法 利用PCR技术扩增出AMA-1（Ⅲ）,插入pPF4载体中,鉴定正确的AMA-1（Ⅲ）基因,插入毕氏酵母分泌型表达载体pPIC9中,DNA测序仪鉴定序列的正确性,转化酵母细胞。③结果 筛选出的阳性克隆为AMA-1(Ⅲ)表达克隆。④结论 用分子生物学方法重组构建的AMA-1（Ⅲ）毕氏酵母真核表达克隆,为高效表达AMA-1（Ⅲ）及其活性鉴定奠定了基础。     

人血管内皮抑素毕赤酵母真核表达载体的构建

目的构建人血管内皮抑素（ES）毕赤酵母真核表达载体。方法利用RT—PCR技术从人体肝脏组织扩增出ES基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC9中,酶切鉴定并进行DNA测序鉴定。结果成功克隆ES基因并筛选出pPIC9载体中的ES阳性克隆,测序证实其序列与已报道的ES基因序列一致。结论用分子生物学方法构建ES毕赤酵母真核表达载体的成功,使高效表达ES蛋白成为可能。     

一种β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母中的克隆与鉴定

目的：克隆扣囊复膜孢酵母的β-葡萄糖苷酶基因(BGL1)，为β-葡萄糖苷酶基因的表达作准备。方法：用PCR方法从扣囊复膜孢酵母的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶基因连接到pGEM--T载体上，用限制性内切酶切下目的基因，插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中，使之位于α-因子信号肽下游，且与之同框，构建成重组质粒pSHL9K。再将β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母中进行克隆，并进行鉴定。结果：重组pPIC9K转化大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母后，进行酶切和PCR鉴定，证明形成了目的基因的克隆。结论：应用大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母作为受体菌，pPIC9K为载体，成功克隆了β-葡萄糖苷酶基因。     

大鼠DAF蛋白真核表达载体的构建及生物活性鉴定

目的 构建大鼠促衰变因子(DAF)的酵母真核表达载体,诱导其表达并对生物学特性进行鉴定.方法 采用RT-PCR技术从大鼠肝脏组织中扩增出DAF基因并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K质粒中.经酶切鉴定后,将pPIC9K-DAF转化至毕赤酵母菌GS115,通过G418-YPD平板筛选高拷贝转化子.转化子经甲醇诱导表达后,对表达的DAF蛋白进行SDS-PAGE及Western blot鉴定并检测重组蛋白的生物活性.结果 成功克隆大鼠DAF基因,并筛选出pPIC9K载体中的DAF阳性克隆,证实所获得相对分子质量约为70×103大小的重组蛋白具有大鼠DAF蛋白的抗原性和生物学活性.结论 采用分子克隆的方法成功构建大鼠DAF蛋白的毕赤酵母真核表达载体,能为补体及免疫研究提供高效的大鼠DAF蛋白来源.     

小鼠睾丸体外培养模型研究邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯对睾酮合成及机制的影响

【摘要】 目的构建大鼠促衰变因子(DAF)的酵母真核表达载体,诱导其表达并对生物学特性进行鉴定。方法采用RT-PCR技术从大鼠肝脏组织中扩增出DAF基因并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K质粒中。经酶切鉴定后,将pPIC9K-DAF转化至毕赤酵母菌GS115,通过G418-YPD平板筛选高拷贝转化子。转化子经甲醇诱导表达后,对表达的DAF蛋白进行SDS-PAGE及Western blot鉴定并检测重组蛋白的生物活性。结果成功克隆大鼠DAF基因,并筛选出pPIC9K载体中的DAF阳性克隆,证实所获得相对分子质量约为70×103大小的重组蛋白具有大鼠DAF蛋白的抗原性和生物学活性。结论采用分子克隆的方法成功构建大鼠DAF蛋白的毕赤酵母真核表达载体,能为补体及免疫研究提供高效的大鼠DAF蛋白来源。     

含EB病毒LMP2A毕氏酵母表达载体的构建与表达LMP2A蛋白的检测

目的：构建EB病毒潜伏膜蛋白2A的表达载体，并在真核生物毕氏酵母细胞中表达。方法：用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ将含LMP2A全长编码基因的质粒PCIcc双酶切后，克隆到毕氏酵母载体PICZαA中，构建重组表达质粒pPICαA—LMP2A。pICZαA—LMP2A经SAC Ⅰ酶切线性化，采用氯化锂的方法转化毕氏酵母GS115，经YPD平板Zeocine抗性筛选获得LMP2A阳性克隆的菌株，用PCR鉴定阳性酵母转化子，并分别将阳性的酵母转化子在BMGY和BMMY培养基中进行诱导表达，表达产物进行SDS—PAGE电泳和westem—b10tting分析。结果：重组质粒pPICZαA—LMP2A经PCR和酶切鉴定为阳性。SDS—PAGE电泳和west-em-blotting结果显示表达蛋白的相对分子量为54Kda，与预计值相同。结论：构建了LMP2A毕氏酵母表达载体，并在酵母细胞中成功表达。     

SARS病毒S蛋白N端片段真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

目的：构建SARS冠状病毒S蛋白N端1～501bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况.方法： 用PCR方法从质粒pGEX-6P-1＋SARS-S上扩增出S编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9＋SARS-S.重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组S蛋白片段表达.结果： 酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组真核表达质粒的构建完全正确.对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为41 000处有重组蛋白的表达.结论： SARS冠状病毒S蛋白N端1～167aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达.     

水蛭素基因毕赤酵母表达载体的构建及高拷贝稳定整合菌株的筛选

目的:构建水蛭素变异体HV1毕赤酵母分泌型表达载体,获得高拷贝稳定整合菌株,为大量获得重组水蛭素蛋白,进行功能研究及其临床应用奠定基础. 方法:根据水蛭素HV1的氨基酸序列及毕赤酵母偏爱的密码子,设计HV1编码基因,分为8条寡核苷酸片段进行DNA合成,经磷酸化、退火、连接和PCR扩增得到优化的HV1全长基因,测序结果正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K,得到pPIC9K-HV1,SalI线性化后转化毕赤酵母GSM1168,G418梯度筛选转化菌,PCR鉴定目的基因的整合. 结果:获得了水蛭素毕赤酵母表达载体pPIC9K-HV1,G418抗性筛选得到高拷贝菌株,PCR证实目的基因已整合到毕赤酵母染色体中. 结论:成功构建了水蛭素HV1毕赤酵母表达载体,获得了高拷贝稳定整合菌株,为大规模表达纯化HV1蛋白及其临床应用奠定了基础.     

辣根过氧化物酶同功酶C3基因在毕赤酵母中的克隆与分析

目的克隆辣根过氧化物酶同功酶C3(HRPC3)基因,为此基因的表达做准备。方法用PCR方法从辣根的基因组DNA中扩增得到一种辣根过氧化物酶同功酶C3基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体上。测序证明正确后,再以带有EcoRI和NotI酶切位点的引物进行PCR,然后将目的基因切下,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成重组pPIC9K质粒,用电转化转入毕赤酵母。提取转化子的基因组DNA,用PCR进行鉴定是否含有HRPC3基因。结果重组pPIC9K质粒转化毕赤酵母后,经PCR鉴定,证明形成了目的基因的克隆。结论应用毕赤酵母作为受体菌,pPIC9K为载体,成功克隆了HRPC3。     

重组小鼠凝血因子Ⅶ毕赤酵母表达载体的构建及整合体的筛选

目的构建无凝血活性的重组小鼠凝血因子Ⅶ(rmFⅦ)毕赤酵母分泌型表达载体,获得高拷贝稳定整合菌株,为大量获得rmFⅦ蛋白,进行功能研究及其临床应用奠定基础。方法PCR扩增得到mFⅦ基因片段,插入酵母表达载体pPIC9K的α分泌信号开放阅读框的下游,再经定点突变(K341A)得到pPIC9KrmFⅦ,测序正确的质粒用SacⅠ线性化后电穿孔转化毕赤酵母GS115,G418梯度筛选转化菌,PCR鉴定目的基因的整合。结果获得了rmFⅦ毕赤酵母表达载体pPIC9KrmFⅦ,G418抗性筛选得到高拷贝菌株,PCR证实目的基因已整合到毕赤酵母染色体中。结论成功构建了rmFⅦ毕赤酵母表达载体,获得了高拷贝稳定整合菌株,为大规模表达纯化rmFⅦ蛋白及后续研究奠定了基础。     

IL-18在毕赤酵母中表达载体的构建及高拷贝子筛选

目的 探索人白介素18(IL-18)成熟蛋白(mhIL-18)在毕赤酵母中高效表达载体的构建,以及多拷贝阳性转化子的筛选.方法 采用SOEing及不对称PCR方法扩增出mhIL-18基因并构建融合型表达载体pPIC9IL-18-Intein,再运用大片段套接的方法避开酶切位点,构建pPIC9KIL-18-Intein.利用G418的加压筛选寻找重组克隆高拷贝菌株.结果 成功构建pPIC9KIL-18-Intein载体,并通过双抗筛选、PCR、酶切以及DNA 测序证明.寻找到重组克隆高拷贝菌株.结论 成功构建mhIL-18在毕赤酵母中的表达载体pPIC9KIL-18-Intein,并筛选到重组克隆高拷贝菌株,为IL-18融合蛋白的高表达及纯化奠定了基础.     

HIV多抗原位点同源序列合成基因的表达及活性鉴定

目的：在原核表达载体系统中对HIV-1gp41/gp120和HIV-2gp125/gp36外膜蛋白多个抗原位点同源序列合成基因进行表达、纯化并鉴定其活性。方法：人工合成含HIV-1gp41的3个抗原位点、HIV-1gp120的2个抗原位点、HIV-2gp125的3个抗原位点和HIV-2gp36的1个抗原位点的串联基因，克隆到原核表达载体pRSETB中，构建重组表达质粒pRSETB-env，用异丙-β-Ｄ-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达，采用金属离子亲和层析技术纯化表达蛋白，逐渐降低尿素浓度使目的蛋白复性，免疫印迹和ELISA法分别对表达产物进行鉴定。结果：目的基因在BL21中有较高表达率，纯化后表达蛋白经十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可见相对分子质量约44 000的蛋白带，与设计相对分子质量相符。免疫印迹、ELISA试验显示pRSETB-env质粒的HIV-1/2表达蛋白与HIV-1及HIV-2患者血清都能较好地结合，与其他患者血清无交叉反应。结论：成功构建了由HIV-1/2外膜蛋白多个抗原位点串联基因片段的表达载体pRSETB-env，并在原核细胞中高效表达，表达蛋白经纯化后纯度较高,并具有良好特异性和活性。     

间日疟原虫MSP1-19基因的克隆与表达

目的:构建间日疟原虫MSP1-19(Plasmodium vivax merozoite surface protein-1-19,Pv MSP1-19)基因克隆及表达的载体.方法:将MSP1-19基因克隆入原核表达载体pET28a中,构建重组表达载体.以重组载体转化大肠埃希菌BL21,在IPTG诱导下表达重组Pv M...     

IL-18在毕赤酵母中的表达和纯化

目的:探索人IL-18成熟蛋白(mhIL-18)在毕赤酵母中的高效表达. 方法:采用SOEing及不对称PCR方法扩增出mhIL-18基因并构建融合型表达载体pPIC9-IL-18-Intein,转化入毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达,运用SDS-PAGE和Western Blot分析重组蛋白的表达,并经亲和层析后用MTT法检测表达的mhIL-18生物活性. 结果:成功构建载体并转化入毕赤酵母,经甲醇诱导,重组的GS115可分泌mhIL-18,其表达在96 h时达高峰,分泌量可达100 mg/L. 亲和层析后的mhIL-18纯度可达95%,并具有显著的IL-18的生物学活性. 结论:在毕赤酵母中成功表达具有显著生物学活性的mhIL-18.     

人血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及鉴定

目的在毕赤酵母中高效分泌表达人血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白.方法利用PCR技术获得HSA和PTH(1-34)基因,以柔性连接肽相连插入到表达载体pPIC9,重组质粒线性化后,用化学法转化毕赤酵母GS115,经组氨酸缺陷型培养板和PCR鉴定筛选得到转化子.在启动子AOX1和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白HSA-PTH(1-34).PCR法和电泳鉴定表达验证阳性转化子,并观测不同时间点的表达量.Western blot验证其免疫活性,在兔肾皮质细胞膜中测定腺苷酸环化酶的激活产生cAMP的量来检测融合蛋白的生物学活性.结果PCR鉴定重组转化子验证了融合基因的成功整合,用甲醇诱导表达,蛋白电泳分析表明融合基因得到高效表达,HSA-PTH(1-34)同时具有HSA和PTH(1-34)的抗原性,且能激活兔肾皮质细胞中的腺苷酸环化酶产生cAMP,但活性低于PTH(1-34).结论在毕赤酵母中成功表达了具有生物学活性的人血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白.     

人羧肽酶A1活性中心的毕赤酵母可溶表达

目的:应用毕赤酵母表达系统表达人羧肽酶A1(carboxypeptidase A1,CPA1)活性中心蛋白.方法:从pGEX-CPA1重组质粒中扩增出CPA1活性中心基因,亚克隆入酵母表达载体pPIC9K,酵母重组表达载体pPIC9K-CPA1active center电转化入毕赤酵母SMD1168,并进行营养缺陷筛选和G418抗性筛选,对高拷贝整合的重组酵母表达菌株诱导表达.结果:构建得到酵母融合重组表达载体pPIC9K-CPA1active center,经G418浓度梯度筛选得到串联整合16个重组表达载体的重组酵母表达菌株,诱导表达后得到CPA1活性中心蛋白.结论:在毕赤酵母中成功表达了CPA1活性中心,为进一步研究CPA1活性中心在抗体导向酶-前体药物疗法中的应用打下了基础.     

NDRG2蛋白的毕赤酵母可溶表达与纯化

目的：酵母表达并纯化可溶性NDRG2蛋白。方法：从pRSET-A-ndrg2重组质粒中扩增出6his-ndrg2融合基因，克隆入酵母表达载体pPIC3.5K；酵母重组表达载体pPIC3.5K-6his-ndrg2电转化入毕赤酵母GS115，并进行营养缺陷筛选和G418抗性筛选；对高拷贝整合的重组酵母表达菌株诱导表达，可溶性表达产物经Ni-NTA亲合层析纯化。结果：构建得到酵母融合重组表达载体pPIC3.5K-6his-ndrg2；经G418浓度梯度筛选得到串联整合16个重组表达载体以上的重组酵母表达菌株；诱导后表达得到6his-NDRG2融合蛋白，并成功纯化得到可溶性表达产物。结论：表达并纯化得到可溶性NDRG2蛋白，为进一步研究NDRG2的结构与功能打下了必要的基础。     

毕赤酵母表达杀菌/渗透性增强蛋白N端片段

目的 探讨在毕赤酵母中进行杀菌／渗透性增强蛋白N端片段的分泌表达。方法从质粒pUCm-BPI上PCR扩增得到编码BPI氨基端196个氨基酸的基因片段(BPl588)。将该基因克隆到酵母表达载体Ppic9K上，使其准确融合于α交配因子分泌信号之后，电击转化毕赤酵母宿主菌GS115／His-。对酵母重组子的基因组DNA作PCR和总RNA作RT-PCR．分析。筛选出的转化子用甲醇作诱导物在29℃进行诱导后，分泌到培养基中的表达产物用于革兰氏阴性细菌E.coli JM109的抑菌实验。结果BP1588基因已整合到毕赤酵母染色体基因组中，并有转录产物mRNA的存在，表达产物能够抑制革兰氏阴性细菌的生长。结论利用毕赤酵母进行杀菌／渗透性增强蛋白N端片段的分泌表达是可行的。     

低表达Cbfa1基因的人牙周膜细胞模型的建立及鉴定

目的:构建针对核心结合因子a1(Cbfa1)的mU6小干扰RNA载体,并将其转染到人牙周膜细胞hPDLCs,观察其干扰效果,以期建立稳定的低表达Cbfa1基因的hPDLCs模型. 方法:设计针对Cbfa1基因编码区的寡核苷酸链,体外退火后克隆入经双酶切线性化的小干扰载体mU6中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定. 以脂质体法将mU6空载体和重组质粒分别导人hPDLCs细胞系. 用含G418的培养液筛选,挑取阳性克隆后用RT-PCR技术检测各hPDLCs克隆内Cbfa1 mRNA水平的表达情况. 结果:经酶切鉴定及DNA测序,重组质粒Cbfa1-siRNA中插入的目的基因片段与预计片段完全一致. G418筛选转染细胞4wk后获得稳定转染mU6空载体的细胞克隆株hPDLCs-mU6和稳定转染重组质粒的细胞克隆株hPDLCs-siRNA. 经RT-PCR鉴定,Cbfa1在hPDLCs-siRNA细胞中的表达比对照细胞明显降低. 结论:成功构建了针对Cbfa1的小干扰RNA载体,成功建立了稳定的低表达Cbfa1的hPDLCs模型,为进一步研究Cbfa1的功能奠定了实验基础.     

人Endostatin在毕赤酵母菌中的表达及其抑癌活性研究

目的在毕赤酵母中获得有活性的分泌型重组Endostatin.方法一步法抽提胎肝总RNA,RT-PCR扩增endostatin全基因.用T-A克隆技术构建克隆载体;双酶切回收550bp的endostatin基因,亚克隆入酵母表达载体.重组质粒分别以PCR、酶切及测序鉴定.电转化法将线形化的重组表达DNA转导入GS¨5感受态细胞,SDS-PAGE电泳筛选阳性重组子,G25及Heprin亲和层析柱初步纯化重组蛋白.MTT法测定重组endosatatin对血管内皮细胞增殖的抑制作用.结果RT-PCR获得550bp的特异扩增条带,T-A克隆后,PCR挑选阳性重组子,测序证实序列正确;亚克隆后的表达载体,PCR可得550bp的特异条带,EcoRI、Not I双酶切获得550bp和3kb的条带,与预期一致,DNA测序证明核苷酸序列100%正确.SDSPAGE证实重组菌较空白有一明显条带,Heparin亲和层析后,1mol/INaCl洗脱的蛋白峰在体外可特异性抑制血管内皮细胞的增殖.结论在毕赤酵母菌中成功地获得了分泌表达的活性endostatin蛋白.