VEGF受体KDR克隆及其对内皮细胞增殖和血管新生的影响

目的：克隆VEGF受体KDR基因膜外5-7区,探讨其生物学活性。方法：提取脐静脉血管内皮细胞总RNA,克隆KDR基因膜外部分5-7区,并使之在QIA表达系统进行表达;镍柱亲和层析纯化、复性、生物学活性鉴定。结果：该系统能表达KDR基因片段,表达量约占菌体蛋白总量的5%左右。经复性,可溶性蛋白具有与VEGF特异结合功能,并能抑制VEGF促使脐静脉内皮细胞增殖和鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的作用。结论：KDR基因片段能在QIA表达系统中得到表达,复性后表达蛋白具有与VEGF结合的生物学功能。     

KDR mRNA在子宫内膜癌组织中的表达及临床意义

目的研究KDRmRNA的表达与子宫内膜癌发生、发展及生物学行为的关系。方法应用逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)技术检测子宫内膜癌45例、子宫内膜不典型增生15例和正常子宫内膜15例组织中的KDRmRNA表达情况。结果KDRmRNA在子宫内膜癌、子宫内膜不典型增生和正常子宫内膜组织中的表达率分别为73.34%(33/45)、26.67%(4/15)和20.00%(3/15),相对含量分别为118.08±15.68、97.59±10.08和80.25±21.38。子宫内膜癌组的KDRmRNA相对含量高于其他两组,P值分别为0.009和0.007;不典型增生组高于正常内膜组,但经比较差异无统计学意义,P=0.431。手术病理分期Ⅲ、Ⅳ期及有淋巴结转移、低分化组的子宫内膜癌KDRmRNA相对含量高于手术病理分期Ⅰ期、无淋巴结转移和高分化组,P值分别为0.012、0.039和0.912;而与肌层浸润深度及病理类型无关,P值分别为0.889和0.912。结论KDRmRNA的过表达在子宫内膜癌的发生、发展中起重要作用,并与子宫内膜癌的生物学行为密切相关,可作为对子宫内膜癌进行治疗的靶位点。     

胃腺癌的血管内皮细胞生长因子和KDR受体的表达及其临床意义

目的：研究胃腺癌的血管内皮细胞生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ, ＶＥＧＦ）及其受体 ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ）的表达,并探讨其临床意义。方法：应用免疫组织化学染色法检测ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ的表达,并分析其与６１例胃腺癌临床病理特征之间的关系。结果：胃腺癌组织ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ的阳性表达率分别为５５．９％和３９．３％;其中粘液腺癌和管状腺癌表达率较高（Ｐ＜０．０５,Ｐ＜０．０１）,ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ表达率分别为７１．４Ｔ／４２．８％和６１．９％／５２．４％;ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ的阳性表达与ＴＮＭ分期有显著差异（Ｐ＜０．０５,Ｐ＜０．０１）,阳性率为Ⅵ＞Ⅲ＞Ⅱ＞Ⅰ期,Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ期的表达率分别为 ８０．０％／５０．０％,６８．２％／４５．５％,４０．０％／３０．０％和３６．８％／３１． ６％;胃腺癌并转移患者,ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ的阳性表达分别为７６．２％和４７．６％,远高于无转移的４５．０％和３５．０％（Ｐ＜０．０５,Ｐ＜０．０１）;术后生存期小于１年的ＶＥＧＦ的表达率为６６．７％,明显高于术后生存期１年以上的５２．２％。结论：ＶＥＧＦ是胃腺癌血管生成的正向调     

表达KDR的T7噬菌体疫苗对小鼠异位移植肿瘤的免疫治疗

目的 构建KDR基因重组的T7噬菌体疫苗以及研究其对小鼠异位移植肿瘤（Lewis肺癌）的免疫治疗。方法 克隆KDR的膜外Ⅱ区基因,构建KDR基因重组T7噬菌体疫苗,免疫小鼠,免疫4次后接种Lewis肺癌,观察肿瘤的生长情况,14d后眼球取血,脱颈椎杀死小鼠,取出瘤体称重,计算抑瘤率,观察免疫治疗效果。结果 实验组抑制程度明显,肿瘤生长速度最慢,肿瘤重量与生理盐水组和空白噬菌体组相比有统计学差异（P〈0.05）,抑瘤率可达57．0％,远大于空白噬菌体组（16．0％）：结论 KDR基因重组的T7噬菌体疫苗对小鼠Lewis肺癌具有明显的抗肿瘤作用,用人源KDR作为免疫原免疫小鼠通过免疫交叉反应可以打破对自身抗原的免疫耐受,产生特异性的免疫反应。     

重组可溶性KDR及其抗体对内皮细胞的增殖抑制作用

目的：分析可溶性KDR（sKDR)及其抗体对内皮细胞增殖的抑制作用。方法：通过ELISA分析大肠杆菌表达的sKDR纯化产物与VEGF165结合的能力；sKDR免疫家兔制备KDR262抗血清，Wenstern blot分析该抗血清与KDR262蛋白结合的特异性；用^3H-TdR掺入法，MTT法和细胞计数3种方法分析重组sKDR及其抗体对内皮细胞的增殖抑制作用。结果：sK-DR蛋白可与VEGF165特异性结合，肝素可增强其结合能力。KDR262抗血清具有特异性识别KDR蛋白的能力，其滴度为1：2000，用^3H-TdR掺入法和MTT2种方法分析sKDR蛋白及其抗体对内皮细胞的增殖抑制作用结果一致，sKDR蛋白浓度在10μg/ml,2μg/ml,0.4μg/ml时对内皮细胞增殖抑制率平均为56%，44%和32%；抗KDR262抗体在稀释度为50，200和800倍时对内皮细胞增殖的抑制率平均为70%，56%和43%，细胞计数法测定结果，sKDR及抗KDR262抗体组与VEGF165单独刺激组，GST和PBS对照组相比，内皮细胞增殖被明显抑制，随浓度增加抑制活性明显增强，但抗体的抑制活性比sKDR蛋白高。结论：大肠杆菌表达的sKDR及其抗体对内皮细胞均具有明显的增殖抑制作用。     

从随机肽库中筛选血管内皮生长因子的抑制剂

目的：从随机噬菌体肽库中筛选血管内皮生长因子（VEGF165）的抑制剂,研究治疗实体瘤生长的小分子药物。方法：以VEGF165分子的受体KDR为靶分子,筛选随机噬菌体环7肽库,通过竞争性洗脱得到能特异结合KDR的阳性噬菌体,以ELISA、细胞免疫组化、细胞ELISA、鸡胚绒毛膜尿囊膜实验和MTT法,鉴定其结合活性和抑制活性。结果：得到5个能特异结合靶分子的阳性噬菌体克隆,它们均可以与表面有KDR表达的细胞结合,其中噬菌体克隆3和13还能抑制VEGF165诱导鸡胚绒毛尿囊膜新生血管形成的活性。但MTT法结果显示,这两种噬菌体小肽对高表达KDR的阳性细胞生长没有明显的抑制活性。结论：从随机噬菌体肽库筛选到了能抑制VEGF165生物活性的克隆,为进一步研究小分子抑瘤药物提供了一定基础。     

血管内皮生长因子受体KDR的靶向制剂的制备

目的：研究从噬菌体肽库中筛选到的与血管内皮生长因子受体Ⅱ(KDR)有特异结合活性的小肽，做为KDR靶向药物的先导物质的应用。方法：从噬菌体肽库中筛选能特异结合KDR的噬菌体克隆，挑选结合力最强的克隆测序并化学合成小肽P5，梯度ELISA、阻断实验和竞争结合实验测定小肽在体外与KDR的结合活性。将P5与生物素(NHS-d-Biotin)、BSA化学偶联，ELISA法和细胞免疫组化实验检测偶联物与KDR的结合活性。结果：化学合成的小肽P5在体外能特异结合KDR，Kd=168．6nmol／L，约是KDR与配体血管内皮生长因子(VEGF165)亲和力的1／30，P5能阻断VEGF165与KDR的结合活性，但不能竞争VEGF165与KDR的结合活性。将P5作为导向物质化学合成的P5-BSA-Biotin，在体外同样具有与KDR和细胞表面KDR分子结合的特性。结论：化学合成的小肽P5有望作为先导分子，在以KDR为靶点的肿瘤靶向治疗中得到应用。     

VEGF及其受体KDR在宫颈癌的联合表达与局部肿瘤血管生成的关系

目的:探讨血管内皮生长因子及其受体KDR在早期宫颈癌的表达及其对宫颈癌肿瘤血管生成的作用。方法:采用免疫组织化学SP法检测18例宫颈上皮内瘤样病变(cervicalintraepithelialneoplasm,CIN)、75例早期宫颈癌(invasivecarcinomaofcervix,ICC)和15例正常宫颈上皮(normalcervicalepithelium,NCE)中VEGF和KDR的表达情况,并检测其中微血管密度(CD34标记)。结果:在ICC中,VEGF和KDR主要表达于癌细胞膜和(或)细胞浆;而CD34主要表达于癌巢间质血管内皮细胞。从NCE到CIN再到ICC,VEGF与KDR的阳性表达率以及MVD均显著升高(P<0.01)。在ICC中,VEGF、KDR阳性表达者其MVD分别显著高于VEGF、KDR阴性表达者(P<0.05)。VEGF在ICC的表达与KDR显著正相关(r=0.56,P<0.01),并且两者均与MVD显著正相关(前者r=0.60,P<0.01;后者r=0.33,P<0.01)。VEGF与KDR均阳性表达者,其微血管密度显著高于两者均阴性表达者(P<0.01)。结论:VEGF及其受体KDR表达在宫颈癌肿瘤血管生成中起上调作用,两者均过度表达,肿瘤血管生成显著增加。检测VEGF及其受体KDR的联合表达对进一步了解宫颈癌血管生成情况以及寻找抗肿瘤血管生成治疗新靶点有一定价值。     

肿瘤血管活性肠肽受体显像剂的研究

目的 研究肿瘤血管活性肠肽受体（VPAC受体）显像剂的生物活性和药物动力学特性。方法 在血管活性肠肽（VIP）C-末端加上His-tag,作为水合羰基钽螯合位点和金属离子螯合层析纯化标签,进行[^99mTc(H2O)3(CO)3]^ 标记,利用家兔肛门内括约肌舒张实验,免疫细胞化学染色及竞争性受体结合实验鉴定VIP类似物MY34的生理活性,标记产物注入C57小鼠体内,行药物动力学特性分析。结果 MY34可舒张家兔肛门内括约肌,且能与肿瘤细胞膜上VPAC受体结合。标记化合物[^99mTc(H2O)3(CO)3]-MY34极其稳定,产率约为90%,MY34或VIP28均能竞争性抑制钽标小肽与肿瘤细胞膜上VPAC受体结合,钽标小肽在小鼠体内代谢符合两室开放模型（Wi=1/C2),T1/2α为16.35min,T1/2β为1013.56min。结论 MY34具有与天然VIP28相似的生理活性及特异的受体结合特性。     

噬菌体随机肽库中与神经胶质瘤细胞系SWO-38特异性靶向结合短肽的筛选

背景与目的：神经胶质瘤的常规治疗尚难取得令人满意的效果，寻找高效和高特异性杀伤肿瘤细胞的药物已成为提高其治愈率的研究热点。本研究旨在利用噬菌体随机肽库找到与神经胶质瘤细胞系SWO-38特异性结合并内化人细胞的短肽序列。方法：利用噬菌体随机12肽库对肿瘤细胞进行5轮全细胞筛选，分析筛选后单克隆对神经胶质瘤细胞的特异性结合能力并进行免疫荧光分析。提取单克隆DNA，测序，得出短肽序列进行比对分析。结果：通过5轮筛选后的噬菌体库及所挑选的表面及内化部分各13个单克隆均显示对胶质瘤细胞有较高的特异性结合，并测序得到三条重复性高的多肽序列。免疫荧光分析显示噬菌体大量聚集在细胞表面并能够内化进入到细胞内。结论：通过噬菌体随机肽库对肿瘤细胞进行全细胞筛选得到的噬菌体多肽能高特异性与胶质瘤瘤细胞SWO-38结合，可作为肿瘤导向药物研究的载体。     

胃癌细胞特异性结合肽的筛选及鉴定

目的 筛选与胃癌细胞特异性结合的多肽。方法 以正常细胞为吸附细胞,胃癌细胞为筛选靶细胞对噬菌体随机12肽库进行消减筛,用细胞酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫细胞和组织化学法及裸鼠正常组织结合实验鉴定阳性克隆并进行DNA测序。结果 经三轮筛选,利用ELISA从随机挑选的24个噬菌体克隆中得到8个与胃癌细胞具有高结合力的噬菌体阳性克隆,经免疫细胞化学及裸鼠正常组织结合试验鉴定,发现第20、24两个克隆能与胃癌细胞特异性结合,而不与正常细胞和裸鼠组织结合,噬菌体阳性克隆氨基酸序列无同源性。结论 得到两个序列不同的特异性结合胃癌细胞的噬菌体克隆,这可为进一步的研究提供实验依据。     

Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library

Background: Gastric cancer is the second most common cancer among the malign cancer types. Inefficiency oftraditional techniques both in diagnosis and therapy of the disease makes the development of alternative and noveltechniques indispensable. As an alternative to traditional methods, tumor specific targeting small peptides can be usedto increase the efficiency of the treatment and reduce the side effects related to traditional techniques. The aim of thisstudy is screening and identification of individual peptides specifically targeted to human gastric cancer cells usinga phage-displayed peptide library and designing specific peptide sequences by using experimentally-eluted peptidesequences. Methods: Here, MKN-45 human gastric cancer cells and HFE-145 human normal gastric epithelial cellswere used as the target and control cells, respectively. 5 rounds of biopannning with a phage display 12-peptide librarywere applied following subtraction biopanning with HFE-145 control cells. The selected phage clones were establishedby enzyme-linked immunosorbent assay and immunofluorescence detection. We first obtain random phage clonesafter five biopanning rounds, determine the binding levels of each individual clone. Then, we analyze the frequenciesof each amino acid in best binding clones to determine positively overexpressed amino acids for designing novelpeptide sequences. Results: DE532 (VETSQYFRGTLS) phage clone was screened positive, showing specific bindingon MKN-45 gastric cancer cells. DE-Obs (HNDLFPSWYHNY) peptide, which was designed by using amino acidfrequencies of experimentally selected peptides in the 5th round of biopanning, showed specific binding in MKN-45cells. Conclusion: Selection and characterization of individual clones may give us specifically binding peptides, butmore importantly, data extracted from eluted phage clones may be used to design theoretical peptides with betterbinding properties than even experimentally selected ones. Both peptides, experimental and designed, may be potentialcandidates to be developed as useful diagnostic or therapeutic ligand molecules in gastric cancer research.     

应用噬菌体随机肽库筛选肿瘤MUC1/Y黏蛋白结合肽

目的：探索用噬菌体随机肽库筛选可用于肿瘤导向治疗的新型小分子载体。方法：以MUC1/Y黏蛋白的胞外段蛋白（MUC1/Yex）为靶分子,用凝胶亲和法和酶联板法分别筛选十二肽噬菌体随机肽库,ELISA鉴定阳性克隆,DNA序列测定后确定MUC1/Yex结合肽的氢基酸序列;免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆及正常及肿瘤细胞的结合能力及特异 性。结果：通过4轮筛选,共获得3种MUC1/Yex的结合肽,分别为HHWHSRSQLSWF,HLKHKNYLPPTP和GNWYRHPHYLQP,其中HXXHS表位可能在与MU1/Yex的结合中起重要作用。阳性噬菌体克隆可与肿瘤细胞系MCF7,OVCA3,而不与正常外周血淋巴细胞结合。结论：筛选获得的MUC1/Yex结合肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性,可进一步用于肿瘤导向治疗的研究。     

Caveolin-1对KDR信号通路的作用

目的：研究Caveolin-1对血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）受体KDR、p42／44MAPK的作用。方法：以腺病毒为载体介导在内皮细胞中表达外源Caveolin-1，应用Western-blotting检测KDR、p42／44MAPK的磷酸化水平。结果：与对照组相比，感染腺病毒表达外源Caveolin-1蛋白的内皮细胞中KDR1054酪氨酸残基和p42／44MAPK磷酸化水平分别降低了42．3％和43．5％。结论：Caveolin-1蛋白抑制KDR信号通路，对内皮细胞增殖可能具有抑制作用。     

鼻咽癌ＫＤＲ受体信号传导相关蛋白的表达及意义*

目的　分析鼻咽癌组织中ＫＤＲ及其下游信号分子ＰＫＣ-β和ｐ-ＥＲＫ的表达,并探讨上述蛋白表达与鼻咽癌患者临床特征和生存期的关系。方法　免疫组织化学法检测１１０例鼻咽癌和３０例鼻咽良性病变石蜡切片中ＫＤＲ、ＰＫＣ-β和ｐ-ＥＲＫ的表达情况,用Ｓｐｅａｒｍａｎ法分析它们之间的相关性,Ｋａｐｌａｎ-Ｍｅｉｅｒ法计算生存情况,行Ｌｏｇ-ｒａｎｋ检验和Ｃｏｘ比例风险模型分析。结果　鼻咽癌组织中ＫＤＲ、ＰＫＣ-β和ｐ-ＥＲＫ阳性表达率分别为８８.２％（９７／１１０）、６３.６％（７０／１１０）和５１.８％（５７／１１０）,而在鼻咽良性病变阳性表达率低。鼻咽癌组织中ＫＤＲ表达与ＰＫＣ-β及ｐ-ＥＲＫ表达呈正相关（ｒ＝０.２９７,Ｐ＝０.００２;ｒ＝０.３３６,Ｐ＜０.００１）,ＰＫＣ β表达与ｐ ＥＲＫ表达呈正相关（ｒ＝０.３０１,Ｐ＝０.００１）。ＫＤＲ和ｐ-ＥＲＫ表达与原发肿瘤的侵犯范围相关（Ｐ＜００５）;ＰＫＣ β和ｐ ＥＲＫ表达与临床分期相关（Ｐ＜０.０５）;ＫＤＲ和ＰＫＣ-β表达与肿瘤局部复发或远处转移相关（Ｐ＜０.０５）。３种蛋白表达均与总生存不佳相关（Ｐ＜０.０５）。Ｃｏｘ多因素相关分析显示年龄＞５０岁为不良预后因素（Ｐ＜０.０５）。结论　ＫＤＲ及其下游信号分子ＰＫＣ-β和ｐ-ＥＲＫ在鼻咽癌中表达,与鼻咽癌患者的临床特征和预后关系密切。     

胃癌细胞AGS中KDR的表达对人脐静脉内皮细胞生物学行为的影响

目的观察胃癌细胞AGS中血管内皮生长因子受体KDR表达水平发生变化时，其培养上清对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)生物学行为的影响。方法采用Western blot及免疫细胞化学的方法检测AGS细胞中KDR的表达；利用重组腺病毒介导的KDR siRNA转染AGS细胞，通过细胞增殖试验、迁移试验及管状结构形成试验，观察不同条件培养基作用下内皮细胞生物学特性的变化。结果胃癌细胞AGS表达KDR，转染siRNA后表达水平降低；条件培养基影响了HUVECs增殖、迁移、形成管状结构的能力，转染siRNA的AGS细胞或亲本细胞组较RPM11640组均增强，前者更强。结论胃癌细胞AGS来源的条件培养基对内皮细胞的增殖、迁移、管状结构的形成具有促进作用，抑制AGS细胞中KDR的表达，这种作用被增强。     

抗前列腺癌细胞特异抗体库的构建及特异结合抗体的筛选

目的: 获得前列腺癌的噬菌体呈现型单链抗体库,筛选与前列腺癌特异结合的抗体,为前列腺癌的诊断和治疗奠定基础. 方法: 用两种恶性程度较高的前列腺癌细胞PC3,DU145膜蛋白混合物免疫Balb/c小鼠.取脾脏提取总RNA,用RT-PCR分别扩增抗体重、轻链可变区基因(VH和VL), 经Linker连接形成ScFv基因片段,将ScFv基因片段与噬菌粒载体pCANTAB 5E的连接产物转化大肠杆菌TG1.用辅助噬菌体M13KO7进行超感染,获得重组噬菌体抗体.以恶性程度低的前列腺癌细胞LNCap为对照,用PC3细胞对重组噬菌体抗体库进行五轮筛选后,随机挑取克隆,经phage-ELISA筛选特异性结合PC3细胞的ScFv.结果: 用所构建的库容量为3.5×106的单链抗体库筛选特异结合抗体,得到一个与PC3细胞特异结合的噬菌体-单链抗体.结论: 本研究所构建的抗体库中可筛选到与前列腺癌细胞结合特异性较好的抗体,可用于前列腺癌的诊断和治疗中.     

EXPRESSION OF VEGF RECEPTOR KDR IN DIFFERENT ORIGINATED CARCINOMAS

Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｉｓｔｈｅｐｒｅｒｅｑｕｉｓｉｔｅｏｆｓｏｌｉｄｔｕｍｏｒｇｒｏｗｔｈ．１Ｄｕｒｉｎｇｔｈｅｐｒｏｃｅｓｏｆｔｕｍｏｒｐｒｏｇｒｅｓｉｏｎ，ｔｕｍｏｒｃｅｌｓｃａｎｓｅｃｒｅｔｅｖａｒｉｏｕｓａｎｇｉｏｇｅｎｉｃｆａｃｔｏｒｓ...