兔角膜上皮细胞体外原代培养方法的研究

目的：建立体外原代培养兔角膜上皮细胞简单经济实用的方法，并观察其体外生长的生物学特性。方法：采用消化法、组织块培养法培养兔角膜上皮细胞并进行传代培养，分别测定细胞分裂指数及细胞贴壁率，MTT比色法测定细胞生长曲线。结果：两种方法培养的细胞在原代、第1代形态相似，消化法培养的细胞代数维持低于组织块法；对数生长期时，组织块培养法的细胞具有更好的活力且分裂旺盛（P〈0．05）；在16h后，消化法培养的细胞贴壁率低于组织块培养法（P〈0．05）。结论：选择组织块培养法培养兔角膜上皮细胞可获得状态良好的连续传代扩增的细胞，且具有经济实用性；角膜上皮细胞符合一般有限细胞系的生长规律。     

兔角膜缘上皮细胞体外培养及其生物学特性的初步研究

目的：建立体外培养兔角膜缘上皮细胞的方法,观察其体外生长的生物学特性。方法：应用组织培养的方法,对兔角膜缘上皮细胞进行体外原代和传代培养,用倒置显微镜观察培养的兔角膜缘上皮细胞体外生长的特征,用苏木精-伊红染色、糖原（PAS）染色,细胞角蛋白免疫组化染色和电镜检查的方法对培养细胞进行形态学检查和鉴定。结果：兔角膜缘上皮细胞可以在体外成功的培养传代,原代培养细胞大多48h贴壁,5天后旺盛生长,15天形成单层,传代培养细胞次日贴壁10天形成单层。细胞角蛋白AE1单克隆抗体染色阳性,PAS染色阴性,培养细胞呈多角形,细胞表面具有丰富的微绒毛,细胞之间有桥粒连接,结论：应用组织培养的方法可以成功获得原代和传代培养的兔角膜缘上皮细胞,培养的细胞具有与正常兔角膜上皮细胞相一致的生物学特性。     

人、兔结膜上皮细胞的原代培养

目的探索结膜上皮细胞体外培养的最佳方法,研究其生长特性,为毒理实验及体外结膜上皮移植提供基础。方法分别用3种培养方法：(1)组织块培养法;(2)混合肖化法;(3)组织块消化后贴壁法来培养人、兔的结膜上皮细胞,观察细胞状态、不同部位的长生特性等,并尝试在羊膜、饲细胞层上培养建系。结果3种培养方法中,组织块培养法能获得较纯的结膜上皮细胞但生长缓慢,消化法能获得大量细胞,生长较快,但常常混有其它杂细胞,组织块消化后贴壁法获得细胞量较少。观察到来自兔、睑结膜及穹隆部结膜上皮的细胞生长速度较快,细胞量多,来自球结膜的细胞生长较慢。应用间接免疫荧光染色,人结膜上皮细胞K13染色阳性。结论组织块培养法及混合消化法皆能培养结膜上皮细胞,各有利弊。     

两种人鼻咽癌活检组织上皮细胞原代培养方法比较

目的 比较两种人鼻咽癌活检组织上皮细胞原代培养方法,并初步探讨鼻咽癌原代培养细胞的生长特性.方法 收集未经放、化疗的鼻咽痛初诊病人鼻咽部肿瘤活检组织33例,其中17例采用组织块培养法.16例采用组织块预消化培养法,用含2%胎牛血清的Keratinocyte-SFM培养基培养.比较两种方法干贴壁时间、成功率及细胞长出所需平均天数,并通过倒置显微镜、抗人角蛋白单克隆抗体免疫细胞化学染色、生长曲线、生存分析来观察原代培养细胞的特性.结果 组织块培养法成功率为23.5%(4/17),干贴壁时间为4.47±0.48h,细胞长出所需时间为13.75±1.5d;组织块预消化培养法成功率为62.5%(10/16),干贴壁时间为7.88±1.01 h,细胞长出所需时间为8.3±4.55d,差异有统计学意义(P<0.05).组织块培养法,细胞多层重叠排列,结构不清,始终没有继续繁殖生长;组织块预消化培养法,细胞呈梭形,核大居中,多个核仁,抗人角蛋自单克隆抗体免疫细胞化学染色阳性,生存时间均数为62.72d.结论 组织块预消化培养法较组织块法成功率高,细胞长出所需平均天数短,干贴壁时间长;低浓度血清的Keratinocyte-SFM培养基适合鼻咽癌原代上皮细胞体外培养.     

改良的兔晶体上皮细胞体外培养

目的:建立一种改良的兔晶状体上皮细胞体外培养的方法,提高晶体上皮细胞原代培养的成功率。方法:利用改良消化法对兔晶体上皮细胞进原代培养,对培养的细胞进行形态学观察。结果:接种48小时~72小时后即可见上皮细胞贴壁生长,具备上皮细胞的形态特点;约7天后融合。传至5代后,细胞明显成纤维细胞化。结论:此种方法经济简便,可为各种实验提供兔晶体上皮细胞。     

兔角膜缘干细胞的体外培养和生物学特性观察

目的 探讨兔角膜缘干细胞的体外培养方法并观察其生物学特性。方法 采用消化培养法，分2组培养，1组为消化并过滤后的角膜缘干细胞培养组，另1组为消化后未过滤的带组织块培养组，均用含20％胎牛血清的培养液培养，待细胞长成良好单层后消化传代，分别观察记录细胞在原代和传代培养时的生长特性并行HE染色观察。结果 过滤组角膜缘干细胞在培养24h后开始贴壁生长，7～10d形成良好单层，细胞以圆形或椭圆形为主，核较大，呈原始细胞特征，传代培养时见细胞体积逐渐增大，核变小，成纤维细胞少见；带组织块培养组原代培养时与过滤组无明显差异，传代时则见成纤维细胞渐增多，至第3代时占主导并抑制了角膜缘干细胞的生长。结论 采用消化培养法可成功培养出兔角膜缘干细胞，培养时应滤除组织块以减少成纤维细胞的影响。     

以兔去上皮浅层角膜为载体体外培养角膜缘上皮细胞的实验研究

目的 建立以兔去上皮浅层角膜为载体体外培养兔角膜缘上皮细胞的培养方法 ,观察细胞生物学特性。方法 用含5%胎牛血清的DMEM/F12（1∶1）培养液对兔角膜缘上皮细胞进行体外组织块法原代培养,待细胞形成单层后,传代种植于去上皮浅层角膜载体上。每天用倒置显微镜观察培养细胞的形态及生长情况,电镜观察培育细胞的超微结构并采用HE染色和抗增殖细胞核抗原（anti-proliferating cell nuclear antigen,PCNA）单克隆抗体免疫细胞化学染色对生长于去上皮浅层角膜载体上的细胞进行检测。结果 原代培养时,48小时后可见组织块边缘有细胞生长游出,10天左右,细胞汇合成单层。传代种植于载体上,细胞24小时贴壁伸展,第5天可见部分区域细胞逐渐融合成片,11天左右细胞形成良好单层。细胞呈卵圆形或多边形,类似角膜上皮细胞;电镜下,可见细胞表面有许多微绒毛,细胞间有桥粒连接;免疫细胞化学染色显示部分细胞PCNA单克隆抗体呈阳性反应。结论 含5%胎牛血清的DMEM/F12培养液适合角膜缘干细胞的体外培养,并能成功地在去上皮角膜浅层载体上培养出类似生理状态下的角膜上皮细胞。     

兔眼晶体上皮细胞的体外培养

目的 :探索体外培养兔眼晶体上皮细胞的方法 ,为进一步研究晶体后囊混浊的发病机理及预防提供实验依据。方法 :取新西兰白色家兔晶体上皮细胞进行原代培养 ,细胞融合后用胰蛋白酶进行消化传代。结果 :原代培养48～ 72h后 ,可见晶体上皮细胞长出 ,以后细胞呈贴壁单层 ,铺砌型向外生长。传代后 6～ 8h细胞贴壁生长。结论 :体外培养可获得生长形态及特征稳定的晶体上皮细胞。     

人扁桃体隐窝上皮细胞的分离、原代培养与鉴定

目的：建立高效、稳定的人扁桃体隐窝上皮细胞原代培养方法。方法：收集80例3~5岁儿童手术切除的扁桃体组织,分别采用组织块贴壁法和Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25%胰蛋白酶?EDTA消化法提取扁桃体隐窝上皮细胞并比较两种方法的提取效果;应用无血清角化细胞培养基进行细胞纯化及原代培养;用相差显微镜观察细胞形态和生长特点、免疫细胞化学染色及免疫荧光技术鉴定细胞来源。结果：Ⅱ型中性蛋白酶联合消化法在分离扁桃体隐窝上皮细胞成功率、细胞密度以及细胞融合时间方面均高于组织块贴壁法（P < 0.05）,细胞接种后第2天开始贴壁,外观呈现多边形,岛状生长,培养12 d左右,细胞连成单层,呈现铺路石样生长。免疫细胞化学染色显示广谱角蛋白表达阳性,波形蛋白阴性;免疫荧光鉴定角蛋白8/18染色阳性。结论：应用Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25%胰蛋白酶?EDTA消化法以及无血清角化细胞培养基可建立高效稳定的人扁桃体隐窝上皮细胞原代分离方法和体外培养体系。     

前列腺原代基质细胞培养方法的研究

目的 建立前列腺原代基质细胞(PS)培养的方法,并研究年龄与胶原打底对于PS的影响.方法 对老年男性前列腺组织分别进行酶消化法、组织块法、酶消化法+组织块法PS培养.通过免疫细胞化学染色对PS进行鉴定.结果 组织块法成功培养PS.酶消化法中PS细胞接种后3 d贴壁率仅6.4%,细胞2周已经老化.酶消化法+组织块法培养细胞无法贴壁.胶原打底组细胞贴壁率与生长状态优于普通瓶底组,供者年龄<60岁的PS贴壁率与生长状态优于供者年龄≥60岁的PS.结论 组织块法简单易行,适于行前列腺PS培养.胶原打底与供者年龄<60岁的原代细胞培养更适合行PS培养.     

造血干细胞移植后免疫重建及其意义的研究进展

本文对造血干细胞移植后的免疫重建及其意义的研究进展作一综述,着重介绍移植后宿主体内T细胞、自然杀伤(NK)细胞及树突细胞(DC)数量和功能的变化。     

细胞培养技术的研究进展

随着现代科学的发展,体外细胞培养技术已成为多个领域必不可少的研究工具,并且其新技术和方法也在不断涌现。本文就细胞培养技术的发展、支架材料以及细胞培养的影响因素作一综述。     

EPCs在MSCs向肝样细胞转化中作用的初步探讨

目的：探讨内皮前体细胞(endothelial precursor cells, EPCs)在间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向肝样细胞转化中的作用。方法：分离培养SD大鼠MSCs和EPCs,取第3代MSCs向肝样细胞转化培养,培养过EPCs的无血清及因子的培养基(endothelial progenitor cell-conditioned medium, EPCs-CM)、无血清的α-最低必需培养基(alpha minimal essential medium, α-MEM)分别与肝细胞转化培养基按1∶1比例配置,作为实验组和模型对照组,正常α-MEM培养基为空白对照组,分别观察细胞形态及数量变化;在培养3、5、7、9 d时应用免疫荧光检测甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)、清蛋白(albumin, ALB)的表达。结果：空白对照组MSCs形态无明显变化;实验组与模型对照组细胞均出现肝样细胞形态。空白对照组未见AFP、ALB表达,模型对照组和实验组在3、5、7、9 d AFP、ALB表达水平均增高,其中实验组比模型对照组AFP、ALB水平增高明显。结论：EPCs在MSCs向肝样细胞转化中可能起一定的促进作用。     

Culture and Identification of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells

Objective To establish the method of isolation, purification, and identification of human amniotic mesenchymal stem cells （hAMSCs）. Methods hAMSCs were isolated from human amniotic membrane by trypsin-collagenase digestion, and cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medinm/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Phenotypic characteristics of these cells were analyzed by means of immunocytochemistry and flow cytometry. Results The cells successfully isolated from human amniotic membrane expressed representative mesenchymal cell surface markers CD44, CD90, and vimentin, but not CD45. Conclusions This study establishes a potential method for isolation of hAMSCs from human amnion, in vitro culture, and identification. The isolated cells show phenotypic characteristics of mesenchymal stem cells.     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。     

人成纤维细胞产生的抑制因子对肿瘤和转化细胞增殖与分化的影响

对人成纤维细胞产生的抑制因子(HFDI)的细胞生长抑制效应进行研究,发现HFDI对肿瘤细胞~3H—TdR掺入抑制是由于使细胞变性坏死或促使细胞有限分化所致;并证明HFDI对PHA刺激的淋巴细胞转化的抑制,也是由于使转化细胞变性坏死或促使细胞向成熟方向发展所致。     

新生豚鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及标记

目的 从新生豚鼠海马中分离培养神经干细胞，为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋的实验研究创造条件。方法 分离新生豚鼠海马组织，用含碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）无血清培养技术培养神经干细胞，免疫组化技术检测其巢蛋白（Nestin）的表达。采用荧光染料DAPI标记神经干细胞。结果 从新生豚鼠海马组织分离出的细胞中可获得呈集落样生长的神经干细胞团，并能表达Nestin；荧光染料的标记效率可达93．4％，细胞传代8次后荧光亮度仍无明显衰减。结论 从新生豚鼠海马分离的细胞具有明显的增殖能力，荧光染料的标记可获得较高的标记效率，可作为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋实验研究的供体细胞。     

大鼠胃壁细胞的分离及培养

目的　完成胃壁细胞分离及纯化 ,建立原代培养胃壁细胞的方法 .方法　制备大鼠翻转的胃囊用含链霉蛋白酶E的消化液注入胃囊内孵育 ,并用磁力搅拌器轻轻搅拌而制备单个的胃底腺细胞 ,Percoll梯度离心富集胃壁细胞 ,用含10 0 m L· L- 1 血清的 PBS或培养液 ,时差贴壁去除成纤维细胞 ,然后 ,将壁细胞接种于培养板中 ,培养液用无血清的 1∶ 1Harm's F- 12 / DMEM培养 ,内含胰岛素 5 mg· L- 1 ,氢化可地松 4μg· L- 1 ,转铁蛋白 5 mg· L- 1 ,硒酸钠 5μg· L- 1 ,牛血清白蛋白 2 g· L- 1 ,表皮生长因子 2 5 μg· L- 1 ,葡萄糖 1.98g· L- 1持续培养可达 1wk以上 .结果　获得的壁细胞经吖啶橙 (acridine orange,AO)鉴定纯度达 80 %以上 ,原代培养经HE染色可见壁细胞呈分散小组式生长 ,且生长状态良好 .结论　此方法适宜于大鼠胃壁细胞的分离及体外培养 ,为体外进一步研究壁细胞的功能打下基础 .     

成人血源性间充质干细胞的分离和鉴定

目的建立一种分离、培养扩增成人血源性间充质干细胞(MSCs)的方法进行鉴定,并与骨髓源性MSCs比较生物学特性。方法30名成年志愿者随机平分为二组,一组直接抽静脉血,并细分为全血细胞法组和外周血密度梯度离心法组,同时抽骨髓为骨髓密度梯度离心法组;另一组为血细胞分离机法组。各组进行细胞存活率、集落形成率、形态学、流式表型分析、胶原染色等研究。结果外周血密度梯度离心法分离成人静脉血后培养,贴壁细胞呈梭形,集落形成率为(0.12±0.08)/106单个核细胞,传代扩增到第5代时每份平均细胞数达51.4674×106,表达CD44、CD54、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45和CD31,细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。全血细胞法和血细胞分离机法获得的细胞不能连续多次传代。结论外周血密度梯度离心法比全血细胞法和血细胞分离机法简单,贴壁细胞培养扩增容易,获得的血源性MSCs与骨髓源性MSCs的生物学特性相似。     

睾丸支持细胞与骨髓间充质干细胞共培养的初步研究

目的 观察睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)与骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)共培养时SCs对MSCs扩增的影响. 方法 取雄性SD大鼠睾丸,分离出SCs,取SD大鼠,分离出骨髓MSCs,将两种细胞用"三明治"式的方法共培养7 d. 结果 共培养组的MSCs前四天生长较对照组快,第5天无明显差异,第6和第7天细胞数量迅速减少. 结论 在体外共培养的早期,SCs可以显著促进MSCs的生长,但在后期则反而抑制MSCs的生长,具体原因有待进一步研究.