张家口地区98例汉族人乙型肝炎病毒基因分型与耐药变异

目的:分析张家口地区汉族人乙型肝炎病毒基因分型与耐药变异。方法:分别采用巢式荧光实时定量PCR及荧光实时定量PCR检测张家口地区98例汉族乙肝病毒感染患者基因型及耐药变异,所有患者接受多拉米定抗病毒治疗。结果:张家口地区98例汉族人乙型肝炎病毒基因型主要以B型,C型,B+C混合型为主,其中B型29例(29.59%),C型30例(30.61%),B+C混合型39例(39.80%);发生YMDD变异总变异率为58.16%(57/98)。在发生YMDD变异者中,YVDD变异占61.40%(35/57),YIDD变异占38.60%(22/57)。基因型为B型者YMDD变异率为21.43%(21/98),C型者为33.67%(33/98),B+C混合型者为44.90%(44/98),三者之间差异有统计学意义(P<0.05)。结论:张家口地区汉族人乙型肝炎病毒基因型主要为B型,C型与B+C混合型;B+C混合型患者使用拉米夫定后发生YMDD变异率最高。     

拉米夫定治疗中乙型肝炎病毒YMDD野毒株和变异株的变化

目的观察慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者应用拉米夫定治疗前后,YMDD野毒株及变异株的动态变化,并分析其临床意义.方法取5例CHB患者治疗前与治疗48周的10份血清标本,先用PCR法扩增包括YMDD基序的乙型肝炎病毒(HBV)部分核苷酸序列,然后进行DNA序列测定,同时分别进行克隆,每份标本随机挑选20～24株单克隆,用实时荧光PCR法检测YMDD野毒株及其变异株.结果 5例CHB患者治疗前PCR产物直接测序结果未检出YMDD变异,治疗48周时有4例检出YMDD变异,但对每株克隆的分别检测显示:治疗前YMDD变异株(YIDD/YVDD)所占比率分别为0%、9.5%、0%、4.5%、5.6% ;治疗48周时所占比率分别为100%、100%、65%、100%、0%.其中1例患者治疗前检出YIDD变异株,而治疗48周时YVDD变异株则变成优势株.治疗52周时,4例YMDD变异患者中2例HBV DNA和血清丙氨酸转氨酶(ALT)突破,1例患者ALT突破,但HBV DNA为阴性.结论 YMDD变异株在拉米夫定治疗前的血清中已存在,在服用拉米夫定后,由于选择性抑制了野毒株,使YMDD变异株由弱势株变成优势株,部分患者可导致拉米夫定临床耐药.YVDD变异株可能比YIDD变异株的复制能力强.     

维吾尔族D型乙型肝炎病毒株全基因克隆研究

目的 进行新疆维吾尔族D型乙型肝炎病毒(HBV)全基因克隆.方法 提取慢性HBV患者血清中的病毒DNA,以聚合酶链反应(PCR)对HBV的全基因组进行扩增,克隆入pUCM-T载体,并对测序结果进行比对分析.结果 通过HBV全基因克隆化研究,获得我国首例维吾尔族慢性HBV感染者D型HBV病毒株的全基因序列.其基因组全长为3174 碱基对(bp),与目前D基因型参照序列比较同源性约为92%～98%,位于1760～1768位出现9个碱基的缺失,与一株来自中国的D/C重组基因型(GenBank登录号:AY862865)序列比较同源性约为91%.氨基酸序列分析其血清型为ayw 2型.结论 新疆维吾尔族D基因型HBV病毒株有其自身特点.     

乙型肝炎病毒基因分型与拉米夫定临床应用反应

目的了解常州地区乙型肝炎病毒(HBV)基因型分布特征,探讨基因型与肝功能损害、病毒复制水平及其与拉米夫定疗效关系.方法 76例慢性乙型病毒性肝炎患者每天口服拉米夫定100mg治疗,并于治疗4～6周时测定不同基因型患者的丙氨酸转氨酶(ALT)和HBV DNA,治疗48周后测定HBV DNA反跳和YMDD变异.采用巢式聚合酶链反应(nest PCR)法扩增HBV S基因区,以4色荧光标记PCR产物末端,在以毛细管高压电泳为核心技术的核酸序列分析仪上自动测序,将测序结果与基因库中登录的标准基因型序列相比较.结果 76例慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA基因分型示:B型株感染26例(34.2%),C型株感染50例(65.8%).B和C基因型患者ALT值分别为(246.3&#177;138.8)U和(283.7&#177;125.6)U,(t=0.335,P&gt;0.05),HBV DNA含量分别为107.124&#177;101.49和107.189&#177;101.56拷贝/ml(t=0.138, P&gt;0.05),HBeAg阳性数分别为20例和41例(χ2=0.159,P&gt;0.05).拉米夫定治疗4～6周后,B基因型和C基因型患者ALT、HBV-DNA(阴转)、HBV DNA(拷贝/ml)均呈良好恢复状态,两组间差异无显著性.治疗48周后,HBV DNA反跳者B基因型20例,C基因型16例(χ2=13.49,P&lt;0.001).结论常州地区HBV DNA基因型以单一B或C型为主;不同基因型患者ALT水平、病毒复制水平以及HBeAg表达水平差异均无显著性,拉米夫定对C基因型患者的疗效优于B基因型.     

恩替卡韦治疗后出现病毒学突破的慢性乙型肝炎患者的耐药分析

目的 研究恩替卡韦(ETV)治疗后出现病毒学突破的慢性乙型肝炎(CHB)患者的ETV耐药情况.方法 收集10例ETV治疗后出现病毒学突破患者的血清,PCR产物直接测序结合克隆测序法用于ETV耐药检测,NCBI HBV基因型分析软件用于HBV基因型确定.结果 10例病毒学突破患者中B基因型者3例,C基因型者7例,其中检出8例ETV基因型耐药.结论 PCR产物直接测序结合克隆测序法可以作为目前国内检测ETV耐药的主要手段;rtT184L变异在B或C基因型的ETV耐药患者中较为常见.     

FEN1基因突变在狼疮性肾炎发病机制中的作用

目的 探讨FEN1基因突变在狼疮性肾炎(Lupus nephritis,LN)患者发病机制中的作用.方法 收集43例LN患者和26例健康者的外周血标本,采用全血基因组DNA柱式试剂盒提取DNA,直接PCR方法扩增FEN1基因片段,扩增后PCR产物应用基因测序方法检测FEN1基因序列,并对测序结果与基因数据库中FEN1基因进行比较,搜索可能的突变位点.chi-square检验比较LN患者及健康者FEN1基因突变情况.结果 LN患者正向测序中存在946位碱基C缺失突变(p=0.046).结论 LN患者FEN1基因存在946位碱基C缺失突变.     

IgA肾病患者C1GALT1C1基因的体细胞突变筛查

目的 探讨IgA肾病（IgAN）患者β1,3半乳糖转移酶的分子伴侣Cosme编码基因C1GALT1C1基因体细胞突变情况。方法 27例IgA肾病患者及19例正常健康对照作为研究对象。提取研究对象外周血基因组DNA,扩增C1GALT1C1基因的编码区,采用PCR产物直接测序的方法进行突变筛查。然后,分离其中15例IgA肾病患者及7例健康男性对照的外周血B淋巴细胞,提取DNA。对C1GALT1C1基因编码区进行扩增,PCR产物进行克隆,各挑选平均8～10个克隆进行体细胞突变筛查。结果 46例个体全血基因组DNA的PCR扩增产物测序发现,2例患者及1例健康对照存在外显子T393A变异,次等位基因频率（MAF）为6．9%[SNP数据库（dbSNP）报告为9．5%]。B淋巴细胞DNA序列分析显示,在22例个体（15例IgA肾病患者,7例健康对照）送检的总共202个克隆中,未发现新的突变和多态性位点。结论 C1GALT1C1基因编码区T393A多态位点在本研究人群中为唯一发现的多态性位点,其次等位基因频率（MAF）较既往报道略低。本研究尚未发现IgA肾病患者B淋巴细胞存在体细胞突变。     

乙型肝炎患者HBV基因型与核苷(酸)类似物耐药变异的关系

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因型与核苷(酸)类似物抗病毒治疗过程中耐药变异发生的关系.方法 采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)DNA测序方法,进行HBV基因分型,同时检测拉米夫定、阿德福韦酯和恩替卡韦特异耐药变异位点.结果 在湖南128例拉米夫定治疗患者中,HBV基因型B为107例,占83.6%;基因型C为21例,占16.4%,未发现基因型A、D、E、F、G、H型.总的耐药变异发生率48.4%(62/128),发生在12、24和36个月者分别为4.7%(6/128)、16.4%(21/128)、42.9%(55/128),随治疗时间延长,变异发生率增加(P＜0.01).基因型B、C感染发生YMDD突变率分别为49.5%和42.9%,无显著差异(P＞0.05),但YMDD变异类型在两基因型中不同,基因型B、C发生YVDD变异分别为64.2%(34/53)和0.0%(P＜0.01),YIDD变异分别为22.6%(12/53)和88.9%(8/9),P＜0.01.阿德福韦酯和恩替卡韦治疗一年尚未检测到耐药变异,45例经阿德福韦酯治疗24月时变异发生率为4.4%(2/45),变异率在B、C基因型患者中分别为0% (0/38)和28.6% (2/7),变异型均为N236T.结论 基因型B为湖南省的优势基因型,HBV基因型对核苷(酸)类似物抗病毒治疗反应有一定的影响.     

漳州地区乙型肝炎病毒基因型分布及其临床意义

目的了解漳州地区乙型肝炎病毒（HBV）基因型分布情况并探讨其临床意义。方法采用特异性引物以巢式多重聚合酶链反应对271例乙型肝炎患者的血清标本进行基因型检测,同时对部分PCR产物进行测序并确定其基因型。结果 271例慢性乙型肝炎患者中,HBV基因B型228例,占84.1%;C型38例,占14.0%;D型4例,占1.5%;B、C混合型1例,占0.4%。入选患者中未检出A、E、F基因型。B、C基因型在不同程度乙型肝炎患者中的分布无显著差异,与肝炎程度无显著相关性。B、C型肝炎患者的年龄,性别,ALT、AST、TBil、DBil、TP、ALB水平,HBVDNA载量及HBeAg阳性率均无显著性差异。结论漳州地区HBV基因型以B型为主,C型次之,有少量的D型及B、C混合型。B、C基因型与乙型肝炎患者ALT水平、HBVDNA载量、HBeAg阳性率等临床指标无显著相关性。     

肝细胞肝癌中乙肝病毒基因整合位点及临床病理分析

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)在肝细胞肝癌(HCC)染色体上的整合规律及其与临床病理的关系.方法 收集40例HBsAg阳性HCC患者围手术期的一般临床资料和病理学资料,并进行随访.以40例HCC组织的DNA为模板,HBVX基因上游序列和人类基因组Alu重复序列为引物,应用巢式PCR原理,扩增出HBV X基因及其侧翼的人基因组DNA片段.PCR产物割胶回收后以ABI公司3700XL测序仪进行全自动测序.所获结果经美国国家生物技术信息中心(NCBI) BLAST及Mapviwer检索确认HBV整合在染色体上的精确位置.结合临床病理及随访资料分析HBV DNA整合对HCC患者的影响.结果 40份HCC组织中,18例存在HBV整合现象,整合的标本中15例正向插入宿主基因,7例反向插入宿主基因,其中4例既有正向插入,又有反向插入,有2例标本有两个HBV整合位点.从病毒基因分析,整合可发生于X基因的任意长度,且均以截短方式插入宿主细胞DNA.另有22份标本未检测到有整合.HBV整合与HCC患者在性别、年龄、AFP、癌栓及复发等方面无关(P＞0.05);而与HBV DNA、肿瘤大小、分化程度呈正相关(P＜0.05).结论 HBV在HCC细胞染色体上的整合呈不均衡分布.HBV整合与HCC患者HBV DNA、肿瘤大小、分化程度呈正相关.     

拉米夫定耐药慢性乙型肝炎患者的HBV逆转酶区突变模式

目的研究慢性乙型肝炎患者在拉米夫定（LAM）治疗过程中出现耐药后,HBV逆转录酶区基因的突变模式及临床特征。方法采用巢式PCR方法对2007年4月至2010年12月于沈阳市第六人民医院肝病门诊或住院诊治的共260例慢性乙型肝炎LAM耐药患者的HBV聚合酶基因逆转录酶区进行扩增,对PCR产物进行直接测序,回顾性分析LAM耐药时HBV聚合酶基因的不同突变模式及患者的临床特征。结果260例患者诊断为LAM耐药,215例患者检测到LAM相关的HBV聚合酶基因突变。患者血清HBVDNA为（5．41±1．29）log10拷贝／ml。98．1％（211／215）患者存在YMDD基序突变。其中3种主要突变类型分别为：单位点rtM204I突变占40．0％（86／215）;rtL180M＋rtM204V占37．2％（80／215）;rtL180M＋rtM204I占13．0％（28／215）。与rtM2041相比,rtM204V多以联合rtL180M突变的形式存在（P〈0．05）。LAM耐药时,单位点突变与联合突变类型患者的血清HBVDNA、ALT、年龄、HBeAgFH性与阴性,肝硬化与慢性乙型肝炎差异均无统计学意义（P〉0．05）。测出基因突变患者与伴生化学突破患者HBVDNA载量较高（P〈0．05）。结论YMDD基序突变是LAM耐药后HBV聚合酶基因突变的主要模式,LAM耐药后患者临床病情轻重可能与HBV聚合酶基因突变类型无关。     

耐阿德福韦酯乙型肝炎病毒多聚酶区基因突变模式与病毒B、C基因型相关性分析

目的分析耐阿德福韦酯（ADV）慢性乙型肝炎（CHB）患者中HBV多聚酶区基因突变模式及基因型的关系。方法选取2010年2月-2012年5月宁波市第二医院住院及门诊114例ADV耐药的CHB患者,采用实时荧光定量PCR方法对患者血清HBV多聚酶区进行扩增,对PCR产物进行直接测序比对。正态分布的计量资料以x±s表示,非正态分布数据用M（P25-P25）表示,经过数据转换方差齐的采用方差分析和LSD-t检验。结果114例CHB患者的基因突变模式为8种,以rtA181V／T／S（57．89％）、rtN236T（14．91％）和rtA181V／T／s＋N236T（9．65％）突变为主,其中单独突变102例（89．47％）,联合突变12例（10．53％）。114例患者B基因和C基因分别为21例（18．42％）和93例（81．58％）,B基因以rtN236T突变模式为主,占47．62％（10／21）;C基因以rtA181V／T／s突变模式为主,占65．59％（61／93）;HBVB基因和C基因rtA181V／T／S和rtN236T突变模式比较差异均有统计学意义（χ2=12．269和18．658,P〈0．01）。结论耐ADV的CHB患者血清HBV多聚酶区基因突变以rtA181V／T／S、rtN236T和rtA181V／T／S＋N236T为主,且不同基因突变模式与基因型有关。     

HBV感染者HBsAg和HBsAb同时阳性的血清学异常模式的研究

目的：分析HBsAg和HBsAb同时阳性的慢性HBV感染者的血清学模式,分析病毒Pre-S/S区基因序列变异或缺失情况对其进行基因分型,并探讨其临床意义。方法采用酶联免疫分析法筛选出HBsAg和HBsAb同时阳性的慢性HBV感染者共100例,采用化学发光微粒子免疫分析确认,用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测其HBV DNA含量,其中HBV DNA阳性者60例, HBV DNA阴性者40例。将60例HBsAg和HBsAb同时阳性的慢性HBV感染者作为实验组,并选取60例HBsAg（＋）HBsAb（-）的慢性乙型肝炎患者作为对照组。采用PCR法体外扩增两组患者HBV Pre-S/S基因序列并测序分析,根据测序结果对患者的基因型进行分型,比较两组Pre-S/S基因变异情况,结合临床资料探讨其临床意义。结果实验组患者中B基因型19例、C基因型41例,对照组患者中B基因型18例、C基因型42例。实验组B基因型患者的年龄[（50.0＆#177;16.3）岁]大于C基因型[（34.0＆#177;13.4）岁],差异具有统计学意义（F=31.6,P=0.0432）。实验组B基因型和C基因型的S区氨基酸突变率分别为10.8%和21.6%,差异具有统计学意义（F=24.31,P=0.046）。同样为C基因型的两组患者,实验组S区氨基酸突变为41.6%,显著大于对照组的氨基酸突变率（3.2%）,差异具有统计学意义（F=85.68,P=0.006）。结论 HBsAg（＋）且HBsAb（＋）并伴有HBeAg（＋）的患者血清中HBV DNA的阳性率显著增高。HBsAg和HBsAb同时阳性的现象与pre-S/S区基因突变具有显著关性,且C基因型的突变率高于B基因型患者的突变率。     

不同基因型HBV对药物反应性和S基因突变位点研究

目的分析HBV不同基因型对药物反应性及S基因变异情况。 方法收集遵义医学院附属医院于2016年3月至2017年7月就诊的186例HBV DNA阳性乙型肝炎患者的血清样本,根据是否用药分为治疗组130例和对照组56例,治疗组根据用药不同分为干扰素组、核苷（酸）类似物组、保肝药组和中成药组,分别提取HBV DNA后扩增S基因并测序,结合临床资料分析疗效与基因型相关性。 结果对照组共51例患者扩增出S基因[91.1%（51/56）,其中B基因型30例,C基因型21例],治疗组共有104例患者样本扩增出S基因[80.0%（104/130）,其中B基因型62例,C基因型42例],均以B、C基因型为主。两种基因型对核苷（酸）类似物的反应性（肝功能改变、HBVDNA拷贝数）与未治疗组差异有统计学意义（P < 0.01）。B基因型HBV S基因经核苷（酸）类似物作用后,第597位碱基鸟嘌呤G变为腺嘌呤A即183位苯丙氨酸（Phe/F）突变为缬氨酸（Val/V）,使翻译终止。保肝药和干扰素引起131位鸟嘌呤G突变为腺嘌呤A,进而甘氨酸（Gly/G）变为谷氨酸（Glu/E）,且9和213位氨基酸突变率为100%。C基因型HBV则发生26位胞嘧啶C突变为胸腺嘧啶T,即脯氨酸（P）变为亮氨酸（L）及53位点丝氨酸（Ser/S）突变为亮氨酸L。保肝药物作用主要引起68位点异亮氨酸（Ile/I）突变为苏氨酸（Thr/T）和49位点P变L。干扰素和中成药均可引起225位酪氨酸-异亮氨酸（YI）变为异亮氨酸-组氨酸（IH）和9位氨基酸P变L。 结论不同HBV基因型对药物反应不同,B、C基因型HBV对药物反应可产生相同突变位点。     

闽南地区核苷（酸）类药物经治的乙型肝炎患者乙型肝炎病毒基因型与逆转录酶区耐药突变特点

目的分析闽南地区核苷酸（类）药物（NAs）经治的乙型肝炎患者乙型肝炎病毒（HBV）基因型与逆转录酶区（RT）耐药突变特点。 方法采用PCR产物直接测序法分析2012年1月至2017年12月中国人民解放军联勤保障部队第910医院肝病中心收治的524例HBV感染者HBV RT区K169～M250核苷酸序列。随访患者抗病毒治疗史,同时检测其血清中HBV e抗原（HBeAg）、HBV DNA、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）等水平。 结果入组524例患者中,293例（55.92%）为HBV B型,231例（44.08%）为HBV C型。HBV B型和C型患者性别、HBeAg状态、病程、NAs药物选择、不同药物治疗方式下NAs相关耐药突变率、NAs用药时间及血清HBV DNA载量、ALT、AST水平差异均无统计学意义（P均> 0.05）。但HBV C型患者年龄（t = 6.486、P < 0.001）和NAs相关耐药突变率（64.94% vs. 51.88%,χ² = 8.493、P = 0.003）显著高于HBV B型患者。524例患者中NAs相关耐药突变检出率为57.63%（302/524）,204位点突变频率最高,其次为180、181和229。10个位点突变均伴随M204变异出现,包括169、173、180、200、202、207、214、237、245和250。HBV C型患者在9个位点上（180、181、184、191、200、221、224、229和238）的突变率显著高于B型患者,差异有统计学意义（P均< 0.05）。HBV B型患者在236和250位点的突变率显著高于C型患者（χ² = 5.867、P = 0.015,χ² = 4.226、P = 0.040）。M204相关的伴随突变在基因型B和C中亦表现出不同的倾向性：M204I突变更易出现在B型患者中,而L180 + M204I、T184 + L180 + M204V更易出现在C型患者中。 结论在NAs药物选择压力下,HBV B型感染者和C型感染者表现出不同耐药突变特点。     

Genotypic resistance of hepatitis B virus to lamivudine in renal transplant recipients

Renal recipients with hepatitis B virus (HBV) should be treated with prolonged lamivudine. However, lamivudine resistance usually results after YMDD mutation within the HBV polymerase gene. Thereupon, the aim of this study was to investigate the genotypic resistance to lamivudine among renal transplant recipients to identify its effect on the clinical course of HBV in these patients. Between March 1997 and September 2003, eight of 17 renal transplant patients with hepatitis B virus were enrolled into this study and treated with 100 mg of lamivudine once each day. We amplified a selected region of the polymerase gene of HBV in order to confirm mutations in the YMDD motif. Mutations of YMDD region were observed in five of eight patients (62.5%). Out of five patients positive for HBV DNA, three (60%) showed genotypic resistance (YMDD mutation) with a normal ALT level. Two patients converted to HBV DNA negative. But, they were not associated with HBeAg seroconversion. Out of three patients who were pretransplant HBV DNA negative, genotypic resistance was observed in two patients (67%) revealing both positivity of HBe antibody and negativity of HBV DNA. In conclusion, although a normal ALT level and HBV DNA negative are maintained, the mutation of the YMDD locus may develop. Accordingly, we suggest that if the YMDD mutation is not involved in the progression of hepatitis B, lamivudine therapy should be continued despite genotypic resistance.     

肝移植术后HBV再感染的治疗

目的分析肝移植术后乙型肝炎病毒（HBV）再感染患者的抗病毒治疗与乙肝病毒基因变异情况。方法317例HBV相关终末期肝病患者肝移植术后15例单独使用LAM，302例使用小剂量乙肝免疫球蛋白（hepatitis B immune globulin，HBIG）和拉米夫定（lamivudine，LAM）（或adefovir dipivoxil，ADV）联合预防HBV再感染，同时检测HBV血清标志物、血清HBV DNA、YMDD区变异、及肝活检组织乙型肝炎标记物。结果术后LAM组有4例术前HBV DNA阳性患者术后HBV再感染，LAM＋HBIG联合用药组16例HBV再感染，两组术后HBV再感染差异有统计学意义（26．7％VS．5．30％，P〈0．01）。317例患者术后12例发生YMDD变异，发生率为3．79％，再感染病例60％（12／20）。经加用ADV治疗后5例HBV DNA转阴性，4名患者HBV DNA滴度下降，肝功能显著改善，3例发生纤维淤胆性肝炎，2例死亡，1例经再次肝移植治愈。结论小剂量HBIG＋LAM可以有效地预防肝移植术后HBV再感染；在小剂量HBIG＋LAM用药基础上HBV再感染可能产生YMDD（tyrosine，methionine，aspartate，aspartate）变异；ADV可作为LAM耐药后用药，对于发生突破性感染的患者应采取以ADV为主的综合治疗。     

瘢痕疙瘩RUNX3基因RH120480片段突变的研究

目的 探讨瘢痕疙瘩患者RUNX3基因RH120480片段突变的情况.方法 收集瘢痕疙瘩标本20例,设患者自身静脉血标本为正常对照,提取基因组DNA,PCR扩增RUNX3基因RH120480片段,采用变性高效液相色谱法对扩增片断进行基因变异检测,将不同类型的PCR片断进行全序列测定,测序结果与GeneBank比较.结果 DHPLC筛查血液样品均为单个色谱峰显示为纯合链;瘢痕疙瘩组织样品95%(19/20)为双峰显示有突变的异源双链存在.基因序列分析发现20例瘢痕组织DNA样本中,有19例突变,突变率为95%,发现2个突变位点,其中96位碱基A的缺失率为90%(18/20),对照组缺失率为10%(2/20);第279位碱基的C的插入突变率为95%(19/20),对照组缺失率为0%(0/20);两个突变位点的差异均具有统计学意义(P＜0.01).结论 RUNX3基因RH120480片段突变与瘢痕疙瘩的发生有关,RUNX3基因可能为一瘢痕抑制基因.