115例汉族骨髓供者HLA-Cw位点基因多态性的研究

目的调查汉族骨髓供者中常见的HLA-Cw等位基因.方法对115例骨髓捐献者采用PCR-SSP方法进行HLA-Cw低分辨和高分辨分型.结果 115例汉族骨髓捐献者中,HLA-Cw位点基因频率分布由高至低依次为Cw*03(0.259 8)、Cw*01(0.214 2)、Cw*07(0.197 8)、Cw*08(0.115 4)、Cw*12(0.058 2)、Cw*14(0.039 9)、Cw*15(0.039 9)、Cw*06(0.039 9)、Cw*04(0.030 9);进一步检测到16种等位基因,其中Cw*010 1、Cw*030 4、Cw*030 2、Cw*040 1、Cw*060 2、Cw*070 2、Cw*080 1、Cw*120 2、Cw*140 2、Cw*150 5、Cw*150 2为对应抗原最为常见的等位基因.结论本研究在DNA水平上,提供了中国汉族人群中HLA-Cw位点基因分布频率及常见等位基因资料.     

中国汉族群体中异基因造血干细胞移植前人类白细胞抗原的高分辨分型

目的:通过对异基因造血干细胞移植无关供受者对的人类白细胞抗原-A,B,DRB1基因的序列分析,探讨中国汉族群体中异基因造血干细胞移植前人类白细胞抗原高分辨分型的必要性。方法:实验于2000-08/2004-03在深圳市血液中心完成。供者和受者114对的血样分别来源中华骨髓库和各移植医院,供者和受者均签署知情同意书。采用聚合酶链式反应-测序分型技术对114对中国汉族无关供受者间的人类白细胞抗原-A,B,DRB1等位基因进行序列分析,观察中国汉族无关供受者对间等位基因水平的配合率、各等位基因家族的配对分布和错配分布规律。某些位点的模棱两可结果,则通过相应位点的高分辨聚合酶链式反应-序列特异性引物分型试剂进行分离并确认最后结果。结果:①高分辨与低分辨分型结果比较:114对无关供受者对中,110对人类白细胞抗原-A,B,DRB1的聚合酶链式反应-测序分型结果与低分辨(等位基因星号后两位数)DNA分型结果相吻合,4对聚合酶链式反应-测序分型结果与低分辨结果不相符。②供受者间人类白细胞抗原-A,B,DRB1高分辨配对分类结果:39%的中国汉族供受者对完全配合,但61%的供受者间存在至少一个等位基因的错配。③供受者间人类白细胞抗原-A,B,DRB1等位基因家族配对分布结果:3个座位的错配率分别为A(23%),B(10%),DRB1(17%);A和DRB1座位的错配比较集中,A座位仅见于A02,A11和A24家族,DRB1座位见于DRB104,DRB108,DRB112,DRB114和DRB115家族;而B座位的错配则比较分散,比较高的是B35,B48,B61和B62。④供受者间人类白细胞抗原-A,B,DRB1错配等位基因组合结果:3个座位的错配等位基因组合呈现较高的多样性,比较常见的几种组合为A0201/0207,A1101/1102,A0201/0206,A0203/0207,B4002/4006,DRB11201/1202和DRB11501/1502。结论:中国汉族异基因造血干细胞移植无关供受者对的人类白细胞抗原等位基因配合率低且其分布具有一定规律和特殊性,在移植前有必要对无关供受者对进行人类白细胞抗原高分辨分型。     

HLA-DRB1高分辨测序分型与48例非亲缘性脐血移植者GVHD相关性分析

1998年6月至2003年7月，广州脐血库向国内21家移植中心提供非亲缘异基因脐血移植54例。本研究采用PCR产物直接测序法对HLA—DRB1进行高分辨分型（PCR—sequencing based typingPCR—SBT），并结合HLA—SSP低分辨分型结果，探讨非亲缘性脐血移植供／受者HLA—DRB1等位基因及其亚型与脐血移植GVHD发生率的关系。利用盐析或柱提法提取48例非亲缘性脐血及移植患者全血DNA，采用HLA—SBT方法分别对HLA—DRB1等位基因进行高分辨分型，并与HLA—SSP（HLA—sequencing specific primers）低分辨结果进行比较分析。结果表明：采用双盲法对48例非亲缘性脐血移植供／受者样本HLA—DRB1进行高分辨分型，结果HLA—DRB1等位基因亚型匹配全相合病例的GVHD发生率（25％）显著低于不完全相合病例的GVHD发生率（65．6％）（P=0．008）。结论：对HLA—DRB1采用高分辨分型方法在非亲缘性脐血移植HLA分型方面具有重要的临床应用价值。     

中国汉族群体中异基因造血干细胞移植前人类白细胞抗原的高分辨分型

目的：通过对异基因造血干细胞移植无关供受者对的人类白细胞抗原A．B．DRB1基因的序列分析，探讨中国汉族群体中异基因造血干细胞移植前人类白细胞抗原高分辨分型的必要性。方法：实验于2000—08／2004—03在深圳市血液中心完成。供者和受者114对的血样分别来源中华骨髓库和各移植医院，供者和受者均签署知情同意书。采用聚合酶链式反应-测序分型技术对114对中国汉族无关供受者间的人类白细胞抗原-A，B，DRB1等位基因进行序列分析，观察中国汉族无关供受者对间等位基因水平的配合率、各等位基因家族的配对分布和错配分布规律。某些位点的模棱两可结果，则通过相应位点的高分辨聚合酶链式反应-序列特异性引物分型试剂进行分离并确认最后结果。结果：①高分辨与低分辨分型结果比较：114对无关供受者对中，110对人类白细胞抗原-A，B，DRB1的聚合酶链式反应-测序分型结果与低分辨（等位基因星号后两位数）DNA分型结果相吻合，4对聚合酶链式反应．测序分型结果与低分辨结果不相符。②供受者间人类白细胞抗原-A，B，DRB1高分辨配对分类结果：39％的中国汉族供受者对完全配合，但61％的供受者间存在至少一个等位基因的错配。③供受者间人类白细胞抗原-A，B，DRB1等位基因家族配对分布结果：3个座位的错配率分别为A（23％），B（10％），DRB1（17％）；A和DRB1座位的错配比较集中，A座位仅见于A＊02，A＊11和A＊24家族，DRB1座位见于DRB1＊04，DRB1＊08，DRB1＊12，DRB1＊14和DRB1＊15家族；而B座位的错配则比较分散，比较高的是B＊35，B＊48，B＊61和B＊62。④供受者间人类白细胞抗原-A，B，DRB1错配等位基因组合结果：3个座位的错配等位基因组合呈现较高的多样性，比较常见的几种组合为A＊0201／0207，A＊1101／1102．A＊0201／0206，A＊0203／0207，B＊4002／4006，DRB1＊1201／1202和DRB1＊1501／1502。结论：中国汉族异基因造血干细胞移植无关供受者对的人类白细胞抗原等位基因配合率低且其分布具有一定规律和特殊性，在移植前有必要对无关供受者对进行人类白细胞抗原高分辨分型。     

无关供者骨髓移植中HLA—Cw基因与急性GVHD相关性的初探

目的探讨无关供者骨髓，外周血造血干细胞移植（BMT／PBSCT）后的急性移植物抗宿主病（aGVHD）的发生与供/受者HLA—Cw等位基因匹配程度的相关性。方法选择HLA—A、B、DRB1相同、并业已进行BMT/PBSCT的无关供／受者对，采用PCR—SSP方法对供受者进行HLA—Cw位点的高分辨基因定型，并收集移植后患者的临床资料，对HLA—Cw基因与aGVHD的相关性进行回顾性分析。结果观察4例HLA-A、B、DRBI相同的移植患者，即急淋（ALL）患者1例、慢性髓细胞白血病（CML）患者2例、急性髓细胞白血病（AML）患者1例，HLA—Cw等位基因完全相合、半相合和完全不相合的患者分别为1例、2例和1例．结果1例CML及1例AML患者中出现Ⅲ度aGVHD。结论无关供者骨髓/外周血造血干细胞移植中，供受者HLA—Cw等位基因匹配程度对急性GVHD具有重要影响，并建议对HLA—Cw基因进行常规检测．     

维吾尔族人群HLA-Cw等位基因遗传多态性研究

目的研究新疆维吾尔族人群HLA-Cw等位基因的遗传多态性。方法采用自行建立的HLA-Cw基因测序分型方法,并辅以Ariza商品化测序试剂盒,对100份维吾尔族无关个体血样进行HLA-Cw基因的第2和第3外显子进行序列测定;用ABI PrismTM3100检测测序反应产物,Assign3.5分析软件分析结果。结果(1)经As-sign3.5软件分析,能直接分析出明确的HLA-Cw等位基因型的样本占30%;排除罕见等位基因后,可判定HLA-Cw等位基因型的样本占33%;其余的样本经PCR-SSP高分辨分型试剂盒检测后,可判定出等位基因型;(2)在70份模棱两可的结果中,共有41种NMDP Allele Code,出现120次,其中频率在5%以上的有03BPSK等7种,其频率之和>50%(61/120);(3)检出了27种HLA-Cw等位基因,频率大于10%的2种常见等位基因为:Cw*0602>Cw*0102,介于5%—10%的依次为:Cw*0401>Cw*0303>Cw*0701>Cw*1502,维吾尔族中Cw*02,04,05,06组与Cw*01,03,07,08组的频率分别为0.295和0.485;(4)共检出62种HLA-Cw等位基因型,基因型频率的分布符合Hardy-Weinberg定律。结论本文的结果可为骨髓库和临床无关供/受者样本的HLA-Cw高分辨基因分型提供重要参考;所得到的HLA-Cw位点的等位基因频率可为人类学、遗传学等研究提供基础数据。     

4例人类白细胞抗原罕见等位基因的结果分析

背景：虽然国内与国外关于新等位基因的报道较多,但是,因某些等位基因首次发现较晚,而后却再次被检测到,并且等位基因频率很低,此类相关文章报道甚少,这些等位基因往往被忽视。目的：检测与确认4例临床移植配型供受者携带的罕见等位基因。方法：采用快速 DNA提取试剂盒从全血样本中提取基因组DNA,经人类白细胞抗原基因商品化测序分型试剂盒检测和SSP高分辨试剂盒验证,得到人类白细胞抗原高分辨分型结果。结果与结论：被检测到的4个罕见等位基因分别为B*27：15、B*51：39、C*07：66和C*08：22。对于以上4个等位基因虽被美国骨髓库列为罕见等位基因,但在中国可能并不罕见。事实证明,被美国骨髓库列为罕见等位基因的C*08：22为中国汉族人群常见等位基因。     

中国汉族人群HLA-B*40组的多态性研究

为了研究中国汉族人群HLA—B^*40等位基因的分布特点，探讨其可能对临床供者选择的影响，从中华骨髓库深圳分库中随机抽取381名志愿供者，用PCR—SSO方法进行HLA—B基因分型；另从已分型的1270例供者中选出低分辨率结果为B^*40纯合子的样本。所有B^*40阳性标本采用PCR—SBT及PCR—SSP方法进行高分辨率分型。结果表明：随机抽取的381例样本通过Hardy—Weinberg平衡检验，HLA—B^*40的基因频率为0．1692。在实验中仅检测到B^*4001，B^*4002，B^*4003，B^*4006，其血清学特异性分属B60，B61。各等位基因相对频率B^*4001为0．1192，B^*4002为0．0154，B^*4003为0．0038．B^*4006为0．0308。B^*40纯合子在高分辨水平上检测，其等位基因表现出一定的规律性，低分辨结果为B^*40XX(B^*4001组)，一，高分辨都是B^*4001；低分辨为B^*40XX(B^*4002组)．一，高分辨则为B^*4002或B^*4006或二者杂合子。结论：中国汉族人群B^*40基因家族中B^*4001占绝对优势。为了选择最适供者，建议临床配型中使用高分辨率基因分型。     

KIR2DS4等位基因在无关全相合异基因造血干细胞移植中的作用

目的 研究中国南方汉族人群中KIR2DS4等位基因分布及2DS4基因对无关供者全相合造血干细胞移植(HSCT)的影响.方法 采用基因测序(Sequenee-based testing,SBT)和TOPO-TA 克隆相结合的方法 ,对接受HSCT的75对HLA-A、-B、-Cw、-DRB1、-DQB1高分辨全相合的供、受者进行KIR2DS4等位基因分型,150名供、受者均为中国南方汉族人群,75例受者中急性淋巴细胞白血病(ALL)29例,慢性粒细胞白血病(CML)24例,急性髓系白血病(AML)19例,其他恶性血液病3例.结果 150名供、受者中139例(92.7%)存在KIR2DS4基因,对2DS4基因全长测序后发现4个2DS4等位基因:KIR2DS4*00101、*003、*004和*007;109例(78.4%)存在2DS4*00101;2DS4缺失型(具有1个或缺失2DS4*00101基因)与完整型(具有两个2DS4*00101基因)的存在比率为1:2;发现3个KIR2DS4新基因.当供者KIR分型为B/x(40例)时,移植后总体生存率明显高于供者为A/A组(35例)[RR=3.1(95%CI 1.1～8.6),P=0.007];当供者为完整型(36例)时,移植后总体生存率低于供者为缺失型(39例)(P=0.031);在A/A组中,当供者为完整型(14例)时,移植后急性移植物抗宿主病(GVHD)的发生率明显高于供者为缺失型(21例)[RR=9.0(95%CI 1.2～66.9),P=0.010],并以Ⅲ～Ⅳ度aGVHD尤为明显(P=0.006).结论 SBT与TOPO-TA基因克隆的高分辨分型方法可用于研究KIR基因家族多态性,并且移植前在HLA分型的基础上对供受者进行KIR2DS4基因分型,可能对临床选择合适的供者提供有利的依据.     

HLA测序技术在非亲缘性脐血移植应用价值探讨

1998年6月至2004年7月，广州脐血库向国内21家移植中心54例患者提供了非亲缘性异基因脐血。为了探讨非亲缘性脐血移植供／受者HLA等位基因及其亚型与脐血移植GVHD发生率的关系，对54例非亲缘性脐血移植病例中，半年后有反馈随访资料的48例，利用盐析或柱提法提取移植的非亲缘性脐血的DNA及移植病例的全血DNA，采用HLA—SBT方法分别对HLA—A、B、DRB1位点进行了高分辨分型，并与我库脐血收集常规采用的HLA—SSP（HLA—Sequencing specific primers）低分辨结果进行了比较分析。结果发现，HLA不合位点不多于2个和HLA不合位点不少于3个的病例GVHD的发生率具有统计学显著性差异（P〈0．05）。在对HLA—A、B、DRB1等位基因高分辨单因素分型结果中，HLA—B和HLA-DRB1等位基因匹配全相合的病例GVHD发生率显著低于不完全相合病例GVHD的发生率（P=0．000，P=0．005）。结论：PCR—SBT技术在非亲缘性脐血移植HLA配型方面具有重要的临床应用价值。     

中国北方汉族人群HLA-Cw~*高分辨等位基因频率分析

本研究从基因水平了解HLA-Cw*位点在中国北方汉族人群中的分布频率,分析HLA-Cw*等位基因的群体遗传学特点及基因频率分布的地区差异。采用PCR-SSP分型技术对420名中国北方汉族人群HLA-Cw*位点进行高分辨基因分型,并对其分布规律进行统计学分析。结果表明:共检出30个HLA-Cw*等位基因,分布频率最高的有Cw*0102;0702;0602(0.1776;0.1217;0.1150),其他频率较高的等位基因依次为Cw*0304,0801,0303,0302,0401,1402。首次在该人群中检测到HLA-Cw*0506,0810,1510,1601和1701较少见等位基因。统计分析表明,HLA-Cw位点基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(p0.05)。结论:采用高分辨等位基因分型,可准确了解HLA-Cw*位点等位基因在我国北方汉族群体中的分布规律和特征,为HLA-Cw*座位的相关研究提供了依据。     

我国汉族人群HLAⅠ类经典基因单倍型及连锁分析

本研究旨在探讨我国汉族人群HLAI类经典基因座位HIA—A、HLA—B、HIA—Cw位点的基因频率，单倍型频率及连锁特征。采用序列特异性引物（SSP）PCR低分辨基因分型技术对1014例随机选择的无关个体的经典HIAⅠ类位点进行基因分型，并对其相关遗传学参数进行统计学分析。结果发现汉族人群中较为常见的HIA—Ⅰ类基因是A＊02（0．33）、A＊11（0．24）、B＊15（0．14）、B＊13（0．13）、Cw＊03（0．25）、Cw＊07（0．18）；较为常见的单倍型是A＊02-B＊46（0．071）、A＊11—B＊15（0．051）、A＊02-Cw＊01（0．084）、A＊11—Cw＊03（0．079）、B＊46-Cw＊01（0．095）和B＊13-Cw＊03（0．071）等，其中A＊02-B＊46、A＊30-B＊13、A＊30-Cw＊06、A＊02-Cw＊01、B＊46-Cw＊01和B＊58-Cw＊03等单倍型呈现出显著的连锁不平衡；而A＊02-B＊15、A＊02-B＊40、A＊24-Cw＊03、A＊02-Cw＊03、A＊31—Cw＊03等连锁不平衡性相对较低，其中A＊24-Cw＊03在重组事件中较常出现。此外，A＊02-B＊46-Cw＊01（0．075）、A＊30-B＊13-Cw＊06（0．046）、A＊11—B＊13-Cw＊03（0．045）、A＊33-B＊58-Cw＊03（0．044）、A＊11—B＊15-Cw＊08（0．027）、A＊02-B＊38-Cw＊07（0．023）、A＊11—B＊40-Cw＊07（0．022）等为常见扩展单倍型。结论：本研究较系统地分析了我国汉族人群的HIA遗传学分布特点，为群体进化、临床移植及疾病相关研究等提供了有价值的遗传学资料。     

中国壮族群体人类白细胞抗原HLA-Cw基因遗传多态性的测序分型研究

本研究探讨壮族人群HLA—Cw基因的遗传多态性。采用自行建立的HLA—Cw基因测序分型方法,对150份壮族非血缘个体血样HLA-Cw基因的第2、3、4外显子进行序列测定;测序反应产物用ABIPrism^TM3730测序仪电泳检测,用Assign3．5分析软件分析结果。结果表明：经Assign3．5软件分析,能直接分析出明确的HLA—Cw基因型的样本占33．33％;排除罕见等位基因后,可判定HLA—Cw基因型的样本占63．33％;其余的5份样本（3．33％）经PCR—SSP高分辨分型试剂盒检测后,可判定基因型;共检出了16种HIA．Cw等位基因,频率大于10％的4种常见等位基因为Cw＊0304〉Cw＊0102〉Cw＊0801〉Cw＊0702,基因多样性（genediversity,GD）为0．9297。Cw＊01,03,07,08,12,14（Cw1组）与Cw＊02,04,05,06,15,16,17,18（Cw2组）的频率分别为0．8967和0．1032,与KIR的识别方式以Cw1组等位基因为主。在检出的51种基因型中,纯合子比例占9．33％（14／150）,基因型频率的分布符合Hardy．Weinberg定律。结论：本研究所得到的壮族群体HLA—Cw位点的等位基因频率及其分布特点,可为人类学、HIA-Cw基因与疾病关联等研究提供基础数据。     

山东省汉族人群HLA-A、B、DRB1位点基因多态性研究

目的分析山东省汉族人群HLA-A、B、DRB1位点基因多态性,获得更完整、准确的群体HLA分子遗传学数据。方法应用PCR-SSP及SSOP技术对7418名山东省汉族造血干细胞志愿捐献者进行HLA-A、B、DRB1位点基因分型。结果共检出低分辨HLA-A基因18种,B基因44种,DRB1基因13种,其中包括一些以前国内未检出的低频率基因。山东汉族人群最常见的HLA基因为A*02、B*13和DRB1*15,其相应基因频率分别为0.2883、0.1431和0.1762;山东汉族人群最常见的A-B单倍型为A*30-B*13,频率为0.0896,最常见的A-B-DRB1单倍型是A*30-B*13-DRB1*07,频率为0.0743。结论山东省汉族人群HLA-A、B、DRB1基因具有显著多态性,大样本和DNA分型有助于低频率基因的检出,适当扩大造血干细胞库志愿捐献者登记人数及各地重新进行HLA多态性分析实有必要。     

A new PCR-SSP method for HLA DR-DQ risk assessment for celiac disease

BackgroundSusceptibility to celiac disease is essentially restricted to carriers of specific HLA DQA1 and DQB1 alleles. We have developed a semi-automated sequence specific primer (SSP) PCR method for clinical HLA typing and compared the test results with those from a commercial method.MethodsPrimers for each DQA1 and DQB1 allele group were included in our PCR-SSP reaction to allow differentiation of homozygous from heterozygous carriers of risk alleles. Primers detecting the tightly linked DRB1*04, *03, *07 and *09 alleles were included to resolve potentially ambiguous results. Fluorescently labeled PCR products of 119 clinical samples were analyzed by capillary electrophoresis, and results were compared to those previously obtained from the DELFIA® Type 1 Diabetes Genetic Predisposition assay.ResultsThe risk assessment derived from the two methods was 100% concordant. One previously unreported haplotype was detected and haplotype assignments in two of the 119 samples were improved from previous reports.ConclusionsThe use of three PCR reactions and a single electrophoretic step for DQA1, DQB1 and DRB1 typing provides distinction of celiac disease associated alleles and their homo- or heterozygous status. This multiplex analysis reduces reagent costs, personnel and instrument time, while enabling improved allelic assignment through HLA-DR-DQ haplotype association.     

HLA-Cw基因常规检测区外第1、5、6、7外显子核苷酸序列测定的研究及临床应用

目的 研究中国人群HLA-Cw基因第1、5、6、7外显子的分子遗传多态性,探讨增加第1、5 6 7外显子核苷酸序列测定在临床组织配型工作中的重要性及意义.方法 应用PCR-SBT法,对324份样本的HLA-Cw基因第2、3、4外显子作常规测序分型.对检出的模棱两可结果,设计HLACw第1、5 6 7外显子序列测序引物并优化测序反应条件,增加第1、5、6、7外显子核苷酸序列分析.结果 对HLA-Cw基冈第2、3、4外显子常规检测,一次性获得等位基因前4位数分型结果 的样本占23.8%(77/324);出现模棱两可结果的样本数占76.2%(247/324),检出的模棱两可等位基因组合有73种;增加HLA-Cw基因的第1、5、6、7外显子多态性检测,可解决Cw* 030201/030202、030301/0320N、Cw* 040101/0409N/0430、Cw* 070201/0750、Cw* 0403/0409N/0430和Cw* 080101/0822等10种常见的模棱两可等位基因组合.结论 在临床HLA-Cw基因配型中增加第1、5、6、7外显子多态性检测,有助于解决测序分型中的模棱两可的结果 和提高HLA-Cw基因分型精确度,对临床组织配型工作具有重要意义.     

HLA-Cw基因常规检测区外第1、5、6、7外显子核苷酸序列测定的研究及临床应用

目的 研究中国人群HLA-Cw基因第1、5、6、7外显子的分子遗传多态性,探讨增加第1、5 6 7外显子核苷酸序列测定在临床组织配型工作中的重要性及意义.方法 应用PCR-SBT法,对324份样本的HLA-Cw基因第2、3、4外显子作常规测序分型.对检出的模棱两可结果,设计HLACw第1、5 6 7外显子序列测序引物并优化测序反应条件,增加第1、5、6、7外显子核苷酸序列分析.结果 对HLA-Cw基冈第2、3、4外显子常规检测,一次性获得等位基因前4位数分型结果 的样本占23.8%(77/324);出现模棱两可结果的样本数占76.2%(247/324),检出的模棱两可等位基因组合有73种;增加HLA-Cw基因的第1、5、6、7外显子多态性检测,可解决Cw* 030201/030202、030301/0320N、Cw* 040101/0409N/0430、Cw* 070201/0750、Cw* 0403/0409N/0430和Cw* 080101/0822等10种常见的模棱两可等位基因组合.结论 在临床HLA-Cw基因配型中增加第1、5、6、7外显子多态性检测,有助于解决测序分型中的模棱两可的结果 和提高HLA-Cw基因分型精确度,对临床组织配型工作具有重要意义.