幽门螺杆菌鞭毛基因PCR-RFLP分析及其与胃十二指肠疾病关系的研究

目的探讨幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)鞭毛基因(flaA和flaB)PCR—RFLP分型及其与胃十二指肠疾病的关系一方法用PCR技术分别扩增46株从消化性溃疡(25株)和非消化性溃疡(21株)患者胃黏膜中分离得到的H.pylori flaA和flaB基因，并用HpaⅡ和HindⅢ消化PCR扩增产物，琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，将酶切片段编码后输入SPSS10．0软件进行聚类分析．并比较不同的基因型别在溃疡组和非溃疡组的分布。结果46株H．pylori菌株flaA基因HpaⅡ和HindⅢ酶切后分别产生4种和3种酶切图谱；flaB基因HpaⅡ和HindⅢ酶切后分别产生1种和2种酶切图谱：综合flaA和flaB基因酶切结果，46株菌株可分为四个基因型别：但这四个基因型别在溃疡组和非溃疡组的分布差异无统计学意义(P=0．513)。结论应用PCR—RFLP方法可以将H.pylori fla基因分为不同的基因型别．但胃十二指肠溃疡和非溃疡组的菌株fla基因型别无差别。     

幽门螺杆菌16SrDNA指纹图和PCR-RFLP基因分型研究

目的　探讨我国幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)的基因多态性及其与相关疾病之间的关系。 方法　应用PCR掺入法制备 16SrRNA基因探针 ,建立 16SrDNA指纹图技术和尿素酶C(ureC)基因的PCR -RFLP法 ,并结合统计学软件进行聚类分析 ,对临床分离的 14株Hp进行基因分型。结果　 14株Hp的 16SrDNA指纹图谱显示 10个HaeⅢ杂交带型和 12个HindⅢ杂交带型 ;ureC基因的变异度较小 ,14株Hp中有 12株PCR -RFLP图谱完全一致。通过杂交结果示意图和SPSS10 0软件进行聚类分析 ,HaeⅢ、HindⅢ及两种酶杂交结果的综合 ,均将 14株Hp分为两型。两种方法结果综合进行聚类分析 ,14株Hp在基因水平上分为三型。结论　差异显著的DNA指纹图谱说明了不同Hp菌株间基因组结构的高度变异性。 16SrDNA指纹图谱较ureC基因的PCR -RFLP谱型更敏感地表达Hp各菌株的变异 ,可准确有效地对Hp作出基因分型。未发现Hp菌株间有特异的疾病图谱存在     

中国大陆三个地区日本血吸虫基因组DNA的RFLP的初步研究

本文用三种限制性内切酶(HaeⅢ,EocRⅠ,HindⅢ)分析了中国大陆的四川西昌、安徽贵池和湖南君山三个地区的日本血吸虫基因组DNA的限制性片段长度差异(RFLP)。构建了三个地区日本血吸虫两种内切酶的RFLP的图谱。HaeⅢ和EcoRⅠ内切后经电泳检出四川地区日本血吸虫与湖南、安徽两地的日本血吸虫DNA重复序列的差异。其中HaeⅢ酶切图谱中有差异的片段为20.0kb、6.5kb、5.3kb、4.3kb和0.6kb;EcoRⅠ的图谱中为3.3kb、1.2kb和0.9kb。本实验结果从DNA分子水平为中国大陆日本血吸虫地域株分类问题提供了依据。     

山西恙虫病立克次体分型及其56—kD蛋白基因序列分析

作者在我国新发现的山西恙虫病疫区病人血液中分离出3株恙虫病立克次体，SXh951，Sxh952，Sxh953。为明确其分类地位．对其进行了血清型，基因型和56－kD蛋白基因的部分序列分析。用免疫荧光抗体染色法将病人血清抗体与Karp,Gilliam．Kato株抗原反应．结果显示山西株与Gilliam型一致；用来自56－kD蛋白基因的引物扩增后，分别用限制性核酸内切酶Hinfl，HaeⅢ．Hhal消化DNA片段的多态性（PCR／RFLP）显示山西3株基因型一致，但均与Karp，Kato，Gilliam株的电泳图谱不同，显示为一独有的PCR／RFLP基因型；对Sxh951株56-kD蛋白基因片段扩增产物（1．2kb）进行DNA序列分析后．根据所推导氨基酸序列，比较Sxh951株与三个标准株氨基酸序列的同源性，发现Sxh951株与Karp、Kato和Gilliam株均有明显差异。对此，本实验室正在进一步研究，以便进一步确定其分类地位。     

慢性胃炎、胃癌组织中幽门螺杆菌基因分型的临床研究

目的 探讨幽门螺杆菌(HP)基因分型与慢性胃炎、胃癌的关系。方法 应用PCR—RFLP方法对36例慢性胃炎及45例胃癌组织中的幽门螺杆菌菌株进行检测。并用HindⅡ酶切尿毒酶B(UreB)扩增基因产物进行多态性分析。结果 36例慢性胃炎HP阳性24例(66．7％)，45例胃癌组织中HP阳性23例(51．1％)。二者差异无显著性。47例HP阳性标本均显示不同的RFLP图谱。胃癌组织中未发现特异性条带。结论 慢性胃炎、胃癌与HP感染密切相关。HP基因具有多态性，HP菌株存在基因型差异。PCR—RFLP方法可对HP菌株进行鉴定并将其分型。     

不同宿主肝片吸虫DNA限制性片段长度多态性分析

本文首次对分离自黄牛、水牛和牦牛的肝片吸虫的基因组DNA，以BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ、HindⅢ和PStⅠ等6种限制性内切酶消化后进行琼脂糖电泳，分析比较它们基因组DNA的限制性片段长度多态性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）；同时用地高车标记的牦牛肝片吸虫基因组DNA为探针对不同宿主肝片吸虫DNA进行Southern印迹杂交，限制性内切酸酶切结果显示只有两种限制性内切酶（BamHⅠ和EcoRⅠ）在寄生于牦牛的肝片吸虫中检测到多态性，而水牛肝片吸虫与黄牛肝片吸虫基因组DNA之间没有检测到多态性，根据此结果计算了牦牛肝片吸虫与黄牛肝片吸虫和水牛肝片吸虫基因型间的遗传距离，Southern杂交结果显示牦牛肝片吸虫基因DNA的杂交谱带与黄牛肝片吸虫、水牛肝片吸虫基因组DNA的杂交港带存在一定的差异，本文的实验结果表明牦牛肝片吸虫与黄牛肝片吸虫、水牛肝片吸虫的亲缘关系相对较远，而水牛肝片吸虫与黄牛肝片吸虫的亲缘关系较近。     

3种线虫rDNA-ITS2-RFLP分析

目的爪哇根结线虫(Meloidogynejavanica)、鼠蛲虫(Enterobiussp·)和犬钩虫(Ancylostomacaninum)是来自不同种属的3种线虫,利用rDNA-ITS2-RFLP方法分析3种不同线虫种间多态性,为将来进一步发展以rDNA-ITS-RFLP分析为基础的土源性线虫的分子诊断方法建立基础。方法应用种间具有较为保守性的遗传区域-内转录间隔区,包括部分的5·8S序列、ITS2和28S的序列,以爪哇根结线虫、鼠蛲虫、犬钩虫3种不同种类线虫的基因组DNA为模板,设计特定引物用PCR扩增rDNA-ITS2+片段,用限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅠ、EcoRⅤ、PstⅠ、KpnⅠ和SalⅠ酶切PCR扩增产物进行RFLP分析。结果PCR扩增爪哇根结线虫、鼠蛲虫、犬钩虫得到的ITS2+片段大小分别为1000bp、1800bp、1800bp,用6种限制性内切酶酶切PCR扩增产物,共产生12条酶切片段。用限制性内切酶HindⅢ/EcoRⅠ,PstⅠ/EcoRⅠ,HindⅢ/PstⅠ双酶切爪哇根结线虫、鼠蛲虫和犬钩虫的rDNA-ITS2+的PCR扩增产物,除爪哇根结线虫外,鼠蛲虫和犬钩虫均可得到2条以上的RFLP片段。结论爪哇根结线虫、鼠蛲虫、犬钩虫rDNA-ITS-RFLP分析显示这3种不同线虫rDNA-ITS2+存在着种间多样性,其中爪哇根结线虫为植物寄生性线虫,而鼠蛲虫和犬钩虫均为动物寄生性线虫,说明rDNA-ITS2+-RFLP方法可用来作为判断线虫种间多样性以及诊断和区分不同线虫的有用依据。     

云南省龙陵县HIV阳性者感染弓形虫的SAG2基因位点分析

目的初步了解云南省龙陵县HIV阳性者感染弓形虫的基因型特征。方法使用基因提取试剂盒提取龙陵县HIV阳性者感染弓形虫的基因,运用巢式PCR技术分别对弓形虫SAG2基因(241bp、221bp)进行扩增,扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,紫外投射仪下观察结果。用DNA胶回收试剂盒切胶回收PCR产物并进行酶切,酶切产物置于37℃恒温培养箱孵育16h,孵育后的酶切产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统摄像观察结果并与弓形虫基因Ⅰ型标准株进行对比鉴定。结果 112份HIV阳性者全血37份扩增出弓形虫SAG2基因(241bp、221bp)。从37份弓形虫SAG2基因(241bp、221bp)扩增阳性的全血标本中选择条带较亮的6份进行酶切,并与弓形虫基因I型标准株比对,初步确定2号标本为基因Ⅲ型,其他标本为基因Ⅰ型。从酶切的6份标本中选择2份进行测序,其中1份为酶切Ⅲ型(测序的2号标本)。经过基因序列对比分析,各弓形虫株之间SAG2基因的碱基对差异较小。其中基因Ⅰ型36份,Ⅲ型1份。结论初步确定云南省龙陵县HIV阳性者感染弓形虫的基因型以Ⅰ型为主,Ⅲ型少见,未见Ⅱ型及其他基因型。     

采用通用引物PCR及RFLP快速检测下呼吸道感染常见病原菌的临床研究

目的 采用聚合酶链反应(PCR)配合限制性酶切片段多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析检测下呼吸道感染的常见病原菌,探讨其在临床快速诊断细菌感染中的应用价值.方法 在下呼吸道感染的住院患者中筛选出合格痰标本125例,分为2份,1份行痰培养作为对照,另1份以16S rRNA基因为靶序列,在其保守区建立通用引物进行PCR扩增,再分别用限制性内切酶HaeⅢ、MnlⅠ、AluⅠ、DdeⅠ和BstBⅠ酶切,进一步行RFLP分析,根据下呼吸道常见病原菌建立的特异酶切图谱诊断鉴定细菌,比较两种方法的检测结果.结果 125例合格痰标本中,PCR配合RFLP检测阳性85例,阳性率为68.0%,痰培养阳性72例,阳性率为57.6%,前者明显高于痰培养(P<0.01),其中肺炎链球菌及流感嗜血杆菌阳性率明显高于痰培养,部分革兰阴性杆菌阳性率也高于培养组,但部分革兰阳性球菌(溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌及屎肠球菌)阳性率较培养组低于痰培养.结论 PCR配合RFLP分析方法检测下呼吸道感染病原菌较常规培养方法敏感快捷,是一种具有临床应用价值的快速诊断方法.     

云南临沧HIV阳性者血液中弓形虫SAGSAG2基因位点分析

目的初步了解云南临沧HIV阳性者血液中弓形虫的基因型特征。方法运用巢式PCR法对弓形虫SAG2基因的两个片段分别进行基因提取、扩增,然后对PCR产物进行回收纯化、酶切及测序,并与弓形虫基因I型标准株进行对比鉴定。结果从170份HIV阳性者全血样本中分别扩增出35个弓形虫SAG2基因(241、221 bp),从其中扩增阳性的全血样本中各选择4份分别进行酶切,扩增出目的基因片段,进一步从酶切样本中选择2份与弓形虫基因标准株RH株进行对比,酶切SAG2基因(241 bp)显示血液样本基因型为Ⅰ型或Ⅱ型,酶切SAG2基因(221 bp)确定基因型均为Ⅰ型。结论初步确定云南临沧HIV阳性者弓形虫基因型以Ⅰ型为主。