lncRNA RHPN1-AS1靶向miR-485-5p调控骨肉瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及其分子机制

目的:探讨lncRNA RHPN1反义RNA1（RHPN1-AS1）靶向miR-485-5p对骨肉瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响和机制。方法:实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测20例骨肉瘤组织与其对应的癌旁组织、人正常成骨细胞hFOB1.19以及3种骨肉瘤细胞（U-2OS、SAOS-2、HOS）中RHPN1-AS1和miR-485-5p的表达水平。利用脂质体转染法将RHPN1-AS1小干扰RNA（si-RHPN1-AS1）、小干扰RNA阴性对照（si-NC）、miR-485-5p模拟物（miR-485-5p mimics）、miRNA阴性对照（miR-NC）分别转染U-2OS细胞,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,蛋白质印记（Western blot）检测细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、p21、p27、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）和基质金属蛋白酶14（MMP-14）蛋白的表达。双荧光素酶报告基因实验和qRT-PCR验证RHPN1-AS1和miR-485-5p的靶向调控关系。结果:与癌旁组织比较,骨肉瘤组织中RHPN1-AS1的表达水平显著升高,miR-485-5p的表达水平显著降低（P＜0.05）;与hFOB1.19细胞比较,3种骨肉瘤细胞中RHPN1-AS1的表达水平显著升高,miR-485-5p的表达水平显著降低（P＜0.05）。与si-NC组比较,si-RHPN1-AS1组U-2OS细胞的活力显著降低,迁移和侵袭能力显著降低,细胞凋亡率显著升高,Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9和MMP-14蛋白的表达水平显著降低,p21、p27和Bax蛋白的表达水平显著升高（P＜0.05）;与miR-NC组比较,miR-485-5p组U-2OS细胞的活力显著降低,迁移和侵袭能力显著降低,细胞凋亡率显著升高,Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平显著降低,p21和Bax蛋白的表达水平显著升高（P＜0.05）。RHPN1-AS1靶向负性调控miR-485-5p表达。干扰miR-485-5p表达逆转了抑制lncRNA RHPN1-AS1表达对骨肉瘤U-2OS细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。结论:抑制RHPN1-AS1通过上调miR-485-5p抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡。     

长链非编码RNA ARAP1-AS1在肾透明细胞癌中的表达及作用研究

背景与目的：长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）ARAP1-AS1在多种肿瘤中异常表达,但其在肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma,ccRCC）中的作用尚不清楚。探讨ARAP1-AS1在ccRCC中的生物学作用。方法：通过GEPIA数据库分析ARAP1-AS1在ccRCC组织中的表达及其与临床病理学特征及患者生存率的关系。采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR）检测ccRCC组织及邻近的非肿瘤组织中ARAP1-AS1的表达水平。将患者分为ARAP1-AS1高表达组和低表达组,分析ARAP1-AS1的表达水平与患者临床病理学特征之间的关系,并进行生存分析。通过细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）实验、transwell迁移实验及侵袭实验检测ARAP1-AS1对ccRCC细胞体外增殖、迁移及侵袭能力的影响。采用蛋白质印迹法（Western blot）检测Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达变化。采用BALB/c裸小鼠移植瘤模型分析ARAP1-AS1对ccRCC细胞体内成瘤能力的影响。结果：GEPIA数据库分析结果显示,ARAP1-AS1在ccRCC中高表达,且与患者肿瘤高分期及较差的生存率相关（P均<0.05）。RTFQ-PCR显示,ARAP1-AS1在ccRCC组织及细胞系中高表达,ARAP1-AS1的高表达与肿瘤大小和分期相关（P均<0.05）。ARAP1-AS1高表达患者的总生存率较差（P<0.05）。沉默ARAP1-AS1的表达可以抑制ccRCC细胞增殖、迁移和侵袭（P均<0.05）。沉默ARAP1-AS1可以降低Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达水平（P均<0.05）。沉默ARAP1-AS1可使ccRCC细胞体内成瘤能力减弱,并使Ki-67增殖指数降低。结论：ARAP1-AS1可通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进ccRCC的进展。     

LncRNA AFAP1-AS1对食管鳞癌细胞株EC9706转移潜能影响机制探讨

目的 食管癌是常见的消化道肿瘤,其细胞侵袭与迁移机制尚不清楚.本研究旨在探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA) AFAP1-AS1对食管鳞癌细胞株EC9706侵袭及迁移能力的影响及可能的作用机制.方法 构建AFAP1-AS1真核表达载体,用脂质体2000将pcDNA3.1-AFAP1-AS1表达载体及pcDNA3.1空载体转染食管癌细胞EC9706.通过G418筛选,建立稳定表达AFAP1-AS1 RNA的EC9706-AFAP1-AS1细胞系.Millicell小室检测2株细胞侵袭及迁移能力的变化,Real-time PCR法检测2株细胞中血管内皮生长因子C(vascular endothelialgrowth factor C,VEGF-C)及Artemin的mRNA表达情况,蛋白质印迹法检测2株细胞中VEGF-C及Artemin蛋白表达的变化.结果 成功构建稳定表达AFAP1-AS1的EC9706细胞系,过表达AFAP1-AS1后,EC9706细胞的迁移(数据分布符合正态分布,SW1=0.912,SW2=0.878,均P＞0.05;两组间均值差异有统计学意义,t=0.002,P＜0.001)及侵袭(数据分布符合正态分布,SW1=0.945,SW2=0.972,均P＞0.05;两组间均值差异有统计学意义,t=0.02,P＜0.001)能力均增加,VEGF-C(数据分布符合正态分布,SW1=0.931,SW2=0.922,均P＞0.05;两组间均值差异无统计学意义,t=0.14,P＞0.05)和Artemin(数据分布符合正态分布,SW1 =0.964,SW2=0.981,均P＞0.05;两组间均值差异无统计学意义,t=0.29,P＞0.05)的mRNA表达差异无统计学意义,但VEGF-C(数据分布符合正态分布,SW1=0.762,SW2=0.82,均P＞0.05;两组间均值差异有统计学意义,t=0.005,P＜0.001)及Artemin(数据分布符合正态分布,SW1 =0.892,SW2=0.853,均P＞0.05;两组间均值差异有统计学意义,￡=0.004,P＜0.001)的蛋白表达明显增加.结论 AFAP1-AS1可能通过增加EC9706细胞中VEGF-C及Artemin的蛋白表达来增强其侵袭及迁移能力,在食管癌侵袭及进展中发挥作用.     

长链非编码RNA ZEB1-AS1促进食管鳞癌侵袭转移

背景与目的：长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）锌指E-盒结合同源异形盒1-反义链1（Zinc finger E-box binding homeobox 1 antisense 1,ZEB1-AS1）在多种肿瘤中高表达,与肿瘤患者临床病理学特征及预后相关,但其在食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）中的作用及其机制尚不清楚。从细胞与分子生物学水平探讨lncRNA ZEB1-AS1在ESCC细胞侵袭转移中的作用。方法：通过实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR）方法检测9株ESCC细胞株中lncRNA ZEB1-AS1的表达水平,筛选出一株高表达细胞株。采用小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）转染Eca-109细胞,分成干扰组（siZEB1-AS1）、干扰对照组（siNC）和空白组（Eca-109）。采用RTFQ-PCR方法检测lncRNA ZEB1-AS1的表达水平,采用细胞计数试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）实验检测细胞增殖能力情况,采用划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力情况,采用RTFQ-PCR方法和蛋白质印迹法（Western blot）检测ZEB1的表达水平。结果：9株ESCC细胞株中,Eca-109细胞中lncRNA ZEB1-AS1表达水平最高。siRNA 抑制lncRNA ZEB1-AS1表达,降至对照组的57%。与对照组细胞相比,lncRNA ZEB1-AS1不影响Eca-109细胞增殖,但是能显著促进Eca-109细胞迁移和侵袭。lncRNA ZEB1-AS1上调ZEB1 mRNA和蛋白的表达。结论：lncRNA ZEB1-AS1通过上调ZEB1促进ESCC迁移、侵袭,lncRNA ZEB1-AS1/ZEB1或许可以作为ESCC治疗的潜在靶点。     

AQP1通过Wnt通路促进乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移与侵袭

目的:探讨过表达水通道蛋白1（aquaporin 1,AQP1）基因对人乳腺癌细胞MCF-7增殖、迁移、侵袭能力的影响,分析其对Wnt通路的调控作用。方法:构建和包装pBabe-puro-AQP1逆转录病毒载体,建立稳定过表达AQP1基因的MCF-7细胞。细胞免疫荧光染色法检测外源性AQP1在MCF-7细胞内的定位,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Western blot检测AQP1 mRNA及蛋白表达变化;采用CCK-8法检测细胞的增殖活性;流式细胞法检测细胞周期;划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell法检测细胞的侵袭能力;基因表达谱芯片、Western blot检测转染后Wnt细胞通路相关基因表达改变。结果:稳定过表达AQP1后MCF-7细胞增殖、迁移、侵袭能力显著增加,差异有统计学意义（P＜0.001）。基因表达谱芯片结果显示,过表达AQP1后22个差异表达基因富集于Wnt细胞信号通路,mRNAs表达明显增强（P＜0.000 1）,Wnt细胞通路关键基因β-catenin及下游靶基因细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、C-Myc蛋白表达也显著增加。结论:AQP1可能通过激活Wnt信号通路促进MCF-7细胞增殖、迁移与侵袭。     

LncRNA UCA1对卵巢癌细胞侵袭及迁移的影响及机制

目的:探讨长链非编码RNA UCA1对卵巢癌细胞SKOV3侵袭及迁移能力的影响及可能的作用机制。方法:用脂质体2000将pc DNA/UCA1表达载体及pc DNA3.1空载体转染卵巢癌细胞SKOV3细胞。用G418筛选,建立稳定表达UCA1 RNA的SKOV3/pc DNA-UCA1细胞及转染空载体的SKOV3/pc DNA3.1细胞。RT-PCR方法检测两株细胞中UCA1的表达,鉴定阳性细胞株。Millicell小室检测两株细胞侵袭及迁移能力的变化,蛋白印迹法检测两株细胞MMP2及MMP9蛋白表达的变化。结果:成功构建稳定表达UCA1的SKOV3细胞,表达UCA1 RNA后,SKOV3细胞的侵袭及迁移能力均增加,MMP2及MMP9蛋白表达增加。结论:UCA1 RNA可能通过增加SKOV3细胞中MMP2及MMP9的表达来增强其侵袭及迁移能力,在卵巢癌侵袭及进展中发挥作用。     

KiSS-1抑制骨肉瘤MG63细胞的侵袭和迁移

摘 要　目的：探讨人肿瘤转移抑制基因KiSS-1对人骨肉瘤MG63细胞侵袭、迁移能力的影响。方法:构建KiSS-1表达质粒pSNAV2.0-KiSS-1。pSNAV2.0-KiSS-1质粒转染骨肉瘤MG63细胞,经G418筛选稳定表达KiSS-1基因的MG63细胞。应用real-time PCR、Western blotting检测KiSS-1 mRNA和蛋白的表达。Transwell小室法检测MG63细胞的侵袭力,millicell小室、细胞划痕愈合实验检测KiSS-1基因对MG63细胞迁移能力的影响。结果:成功建立pSNAV2.0-KiSS-1质粒并稳定转染MG63细胞（MG63-KiSS-1细胞）,MG63-KiSS-1细胞高表达KiSS-1 mRNA和蛋白。转染KiSS-1质粒后的MG63细胞侵袭力显著降低（P<0.05）;millicell法、细胞划痕愈合实验证实转染KiSS-1质粒后的MG63细胞迁移力也明显降低（P<0.05）。结论:KiSS-1基因能显著抑制人骨肉瘤MG63细胞的侵袭和迁移能力,在骨肉瘤的转移中起重要作用。     

沉默SDC1通过ERK信号通路促进胆囊癌细胞的侵袭和迁移

目的:观察沉默黏结蛋白聚糖1（syndecan-1,SDC1）对胆囊癌细胞侵袭和迁移能力的影响,并探讨其分子机制。方法:采用RNA干扰技术敲低胆囊癌细胞系GBC-SD中SDC1的表达,Western blot和qRT-PCR验证转染效果;Transwell侵袭实验、划痕愈合实验检测细胞侵袭和迁移能力;Western blot分析ERK1/2、p-ERK1/2、Snail、E-cadherin和N-cadherin蛋白表达。结果:成功构建SDC1低表达的胆囊癌细胞系;转染后各组细胞SDC1 蛋白和mRNA表达水平显著低于shNC组（P＜0.05）;与BC组和NC组相比,shSDC1组细胞侵袭和迁移能力明显提高（P＜0.01）;与BC组和NC组相比,shSDC1组细胞p-ERK1/2、Snail、N-cadherin蛋白表达水平显著上调,而E-cadherin蛋白表达水平显著降低。结论:沉默SDC1可能通过ERK信号通路促进胆囊癌细胞的侵袭和迁移。     

siRNA沉默YAP1对宫颈癌Hela细胞增殖和侵袭的影响

目的:用小干扰RNA(siRNA)沉默宫颈癌Hela细胞中YAP1基因的表达,观察YAP1表达降低对细胞增殖和侵袭能力的影响,初步探讨YAP1在宫颈癌中的作用。方法:qRT-PCR和Western blot方法检测宫颈癌Hela细胞及正常宫颈上皮细胞H8中YAP1的表达,siRNA YAP1转染Hela细胞沉默YAP1表达,并以转染control siRNA的细胞作为对照,转染48h后,分别用qRT-PCR和Western blot方法检测沉默效果。用MTT法检测沉默后细胞增殖情况。Transwell 检测细胞侵袭能力。结果:YAP1在宫颈癌细胞中高表达。siRNA能够有效沉默Hela细胞中YAP1的mRNA 及蛋白的表达。沉默YAP1表达能够明显抑制Hela细胞的增殖及侵袭能力。结论:YAP1蛋白在宫颈癌细胞中高表达并具有促进细胞增殖及侵袭的能力。     

沉默MTA1表达对胃癌SGC7901细胞增殖和侵袭能力的影响

目的:观察转移相关基因1（MTA1）基因沉默对人胃癌细胞SGC7901增殖和迁移侵袭能力的影响,探讨 MTA1基因在胃癌发生发展中的作用。方法:利用脂质体法将靶向MTA1的小分子干扰 RNA（siRNA） 转染到胃癌细胞株 SGC7901中。运用Real time PCR 和Western blot 技术检测SGC7901细胞内MTA1的 mRNA和蛋白表达水平。CCK-8法检测细胞增殖能力,Transwell小室实验观察细胞迁移和侵袭能力。结果:MTA1 siRNA 可有效抑制SGC7901细胞MTA1基因在 mRNA 和蛋白水平上的表达（P﹤0.01）。CCK-8实验表明MTA1 siRNA 转染后细胞增殖不受影响;Transwell小室实验表明细胞迁移和侵袭能力明显下降。结论:沉默MTA1表达可抑制胃癌细胞株 SGC7901迁移和侵袭,而不影响细胞增殖。MTA1在胃癌侵袭转移过程中可能发挥重要作用。     

长链非编码RNA FOXD2-AS1对卵巢癌细胞增殖和迁移的影响

  目的  观察长链非编码RNA（lncRNA）FOXD2-AS1对卵巢癌细胞增殖和迁移的影响。  方法  收集2017年2月至2017年9月华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院（武汉市妇幼保健院）手术切除的16例卵巢癌患者的组织标本,采用荧光实时定量聚合酶链式反应（quantitative PCR,qPCR）检测组织标本、人卵巢癌细胞系及人正常卵巢上皮细胞系中的FOXD2-AS1表达水平。将HO-8910细胞分为实验组和对照组,分别转染siRNA-FOXD2-AS1和阴性对照RNA。细胞计数CCK-8法、Transwell迁移实验分别检测沉默FOXD2-AS1表达对卵巢癌HO-8910细胞增殖活性和迁移能力的影响。生物信息学方法预测FOXD2-AS1的下游靶基因,qPCR检测下游靶基因表达,Western blot法检测葡萄糖调节蛋白94（glucose regulated protein94,GRP94）和信号通路Wnt/β-catenin的蛋白表达。  结果  卵巢癌组织中的FOXD2-AS1相对表达量8.56±0.51明显高于正常癌旁组织的2.38±0.21（P < 0.01）,FOXD2-AS1在卵巢癌细胞系OC3、HO-8910、A2780、SKOV-3中表达明显增加（P < 0.05）。下调FOXD2-AS1表达明显抑制卵巢癌HO-8910细胞的增殖活性和迁移能力（均P < 0.01）。生物信息学方法显示,FOXD2-AS1靶向结合miR-150-5p后,可靶向结合GRP94基因。实验组和对照组miR-150-5p相对表达量分别为5.45±0.91和1.01±0.08（P < 0.01）,GRP94 mRNA相对表达量分别为0.32±0.05和1.02±0.11（P < 0.01）。GRP94和Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达减少。  结论  FOXD2-AS1在卵巢癌组织和细胞系呈高表达,下调FOXD2-AS1可调控miR-150-5p表达,抑制卵巢癌HO-8910细胞的增殖和迁移,可发挥抑癌基因的功能。      

沉默LncRNA WT1-AS对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭和迁移的影响

目的 探讨LncRNA WT1-AS对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭和迁移的影响.方法 qRT-PCR检测WT1-AS在三阴性乳腺癌细胞中的表达及基因沉默的效率;Transwell实验检测WT1-AS对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响;划痕实验检测WT1-AS对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响;W...     

下调Skp2表达抑制骨肉瘤U2OS细胞恶性表型的实验

 目的 通过使用小干扰RNA（siRNA）降低骨肉瘤中S期激酶相关蛋白2（Skp2）的表达，探讨Skp2对骨肉瘤恶性生物学行为的影响及其分子机制。方法 转染Skp2 siRNA敲低骨肉瘤U2OS细胞中Skp2的表达。通过RT-qPCR和Western blot法检测细胞内Skp2的mRNA和蛋白表达水平，确定Skp2 siRNA的沉默效率。MTT法检测细胞增殖情况，PI单染及Annexin V/PI双染后用流式细胞仪检测对骨肉瘤细胞周期及凋亡的影响。Transwell实验和钙黄绿素乙酰甲酯（Calcein-AM）染色检测细胞的迁移和侵袭。Western blot检测细胞内Skp2的下游基因p21、p27、p-Akt及E-cadherin的表达变化。结果 转染Skp2 siRNA在U2OS细胞中获得较高的敲除效率。Skp2表达下调抑制了骨肉瘤细胞的增殖，并且使细胞生长阻滞在G0/G1期，细胞的凋亡率明显增加。抑制Skp2后U2OS细胞的侵袭和迁移能力明显降低。U2OS细胞Skp2敲低后其下游调控分子p21、p27及E-cadherin的表达显著升高，而p-Akt的表达则明显减弱。结论 Skp2在骨肉瘤细胞中发挥癌基因的作用，通过调控其信号通路中p21、p27、p-Akt及E-cadherin的表达影响细胞生长、周期、凋亡、侵袭和迁移能力等恶性生物学行为。     

靶向沉默人类真核翻译延长因子1A2可抑制胰腺癌细胞BxPC-3体外迁移和侵袭

目的:探讨靶向沉默人类真核翻译延长因子1A2 (homo sapiens eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2,EEF1A2)对胰腺癌BxPC-3细胞体外迁移和侵袭的影响及其可能的分子机制.方法:应用RT-PCR和蛋白质印迹法检测4种胰腺癌细胞株中EEF1A2的mRNA和蛋白表达水平.将EEF1A2-小干扰RNA (smallinterference RNA,siRNA)和阴性对照siRNA转染到BxPC-3细胞中,随后采用RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测EEF1A2的mRNA及蛋白表达,应用体外划痕和Transwell侵袭实验分别检测BxPC-3细胞的体外迁移和侵袭能力,蛋白质印迹法检测转染前后细胞中p -Akt和总Akt蛋白的表达变化.结果:4种胰腺癌细胞株中除SW1990细胞呈EEF1A2低表达外,BxPC-3、Patu8988和Panc-1细胞均呈EEF1A2高表达.EEF1A2-siRNA转染BxPC-3细胞48 h后,EEF1A2 mRNA及蛋白表达水平较阴性对照siRNA转染的细胞和空白对照细胞明显降低(P＜0.01).EEF1A2-siRNA转染组BxPC-3细胞的体外迁移和侵袭能力明显低于阴性转染对照组和空白对照组(P＜0.05).EEF1A2-siRNA转染组细胞中Akt的磷酸化水平明显低于对照组细胞(P＜0.05),而总Akt蛋白表达水平未显著改变(P＞0.05).结论:siRNA干扰下调EEF1A2基因表达可明显抑制胰腺癌BxPC-3细胞的体外迁移和侵袭,其机制可能与EEF1A2调控Akt信号通路有关.     

IGF-1R表达下调抑制肾癌786-0细胞的增殖、迁移、侵袭和细胞周期G1/S期转变

目的:观察小干扰RNA (siRNA)介导的胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)基因沉默对肾癌细胞786-0增殖、迁移、侵袭和细胞周期的影响.方法:采用实时定量PCR(real-time PCR)和蛋白印迹法(West-ern blot)测定转染后肾癌细胞IGF-lR及下游相关产物的表达;采用Cell counting kit-8(CCK-8)检测细胞增殖能力;Transwell实验及划痕实验检测细胞迁移及侵袭能力;流式细胞仪检测细胞凋亡及周期改变.结果:IGF-1R基因的siRNA可有效抑制IGF-1R mRNA及蛋白的表达(P＜0.01);细胞增殖实验结果显示IGF-1R-siRNA转染组增殖能力显著减弱(P＜0.01);Transwell实验及划痕实验结果显示IGF-1R-siRNA转染组侵袭及迁移能力明显降低(P＜0.01);流式细胞术检测到转染后细胞G1期细胞数明显升高,发生G1/S期阻滞(P＜0.05);IGF-1R下游蛋白p-IRS1、p-IRS2、p-SHC水平显著降低.结论:IGF-1R表达下调可以抑制肾癌786-0细胞的生长、增殖、迁移和侵袭的能力,并可以使肾癌786-0细胞G1/S期细胞周期停滞.     

TTTY10 调控miR-490-3p 通过HMGB1 信号通路对宫颈癌细胞迁移和侵袭的影响

[摘要] 目的：探讨长链非编码RNA（long-chain non-coding RNA,lncRNA）TTTY10 对宫颈癌细胞迁移和侵袭的影响及其对miR-490-3p 及高迁移率族蛋白1（high mobility group box 1, HMGB1）信号通路的调控作用。方法：收集华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院妇产科2013 年8 月至2014 年10 月14 例宫颈癌患者的癌组织及相对应的癌旁组织标本,qPCR检测宫颈癌组织及不同宫颈癌细胞株中TTTY10 表达情况。将编码TTTY10-siRNA 的质粒或空载质粒转染至宫颈癌CasKi 细胞中,qPCR检测质粒TTTY10-siRNA转染宫颈癌细胞的转染效率,Transwell 迁移和侵袭实验检测沉默TTTY10 后宫颈癌细胞迁移和侵袭能力的变化,qPCR检测沉默TTTY10 后miR-490-3p 和HMGB1 mRNA的表达。双荧光素酶报告基因检测miR-490-3p 与HMGB1 的相互作用,Western blotting 检测沉默TTTY10 后HMGB1 信号通路蛋白的表达情况。结果：宫颈癌组织中TTTY10 的表达显著高于癌旁组织,宫颈癌细胞株中TTTY10 的表达显著高于宫颈上皮永生化细胞（P<0.01）;TTTY10-siRNA 质粒可以有效转染进入CasKi细胞内并敲减TTTY10 的表达（P<0.01）,沉默TTTY10 可以抑制宫颈癌CasKi 细胞的迁移和侵袭能力,促进宫颈癌细胞miR-490-3p 的表达和抑制HMGB1 mRNA的表达（P<0.05 或P<0.01）。miR-490-3p 能与HMGB1 mRNA的3′ -UTR特异性结合,沉默TTTY10后HMGB1 信号通路蛋白表达水平下调。结论：TTTY10 可以靶向调节miR-490-3p,并且通过HMGB1 信号通路影响宫颈癌CasKi细胞的迁移和侵袭能力;TTTY10 可作为宫颈癌的诊断标志物和潜在的药物治疗靶点。     

Livin促进骨肉瘤细胞增殖和侵袭作用的实验研究

目的：探讨凋亡抑制蛋白（IAP）家族成员Livin基因在骨肉瘤发生发展以及转移中的作用.方法：联合RNA干扰和质粒重组技术构建Livin基因短发夹RNA （shRNA）表达载体,筛选稳定沉默Livin表达的克隆.四甲基偶氮唑蓝法（MTT法）测定细胞增殖状况.划痕实验（Wound healing）和侵袭实验（Matrigel invasion assay）评价沉默Livin表达后细胞迁移和浸润能力的变化.免疫印迹法（Western blot）检测细胞周期蛋白Cyclin D1和基质金属蛋白酶-2,9（MMP-2,9）的蛋白表达变化.结果：shRNA稳定转染的骨肉瘤U2-OS细胞中Livin mRNA和蛋白水平明显下调.与对照组相比,细胞增殖,游走和侵袭能力明显下降,并且该克隆中Cyclin D1,MMP-2和MMP-9的蛋白表达也明显减弱.结论：凋亡抑制蛋白Livin能够在体外条件下促进骨肉瘤细胞增殖和侵袭作用,这一过程可能与Cyclin D1和MMP-2,9的表达增强有关.     

lncRNA HOXA11-AS对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的:探究长链非编码RNA(long-nocoding RNA,lncRNA) HOXA11-AS在骨肉瘤中的表达及其对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制.方法:采用2012年1月至2015年12月浙江省人民医院骨外科13例骨肉瘤组织及癌旁正常组织,以及骨肉瘤细胞系MG63、U20S和人成骨细胞株hFOB1.19,用实时荧光定量PCR检测骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞系MG63和U20S中lncRNA HOXA11-AS的表达水平.用慢病毒载体构建稳定过表达lncRNA HOXA11-AS的骨肉瘤MG63及U20S细胞,用CCK-8和克隆形成实验、Transwell小室法分别检测过表达lncRNA HOXA11-AS对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响.建立过表达lncRNA HOXA11-AS MG63骨肉瘤细胞裸鼠移植瘤模型,以空载体慢病毒Lv-NC转染的细胞作为对照,观察过表达lncRNA HOXA11-AS对裸鼠移植瘤生长的影响.结果:lncRNA在骨肉瘤组织和MG63及U20S细胞中表达水平显著下调(P＜0.01).与hFOB1.19细胞比,过表达lncRNA HOXA11-AS细胞后,(1)显著抑制骨肉瘤MG63及U20S细胞的增殖[(4.03 ±0.98) vs(6.96 ±0.54),(4.68±0.77) vs (8.87±1.23),均P＜0.01]、迁移细胞数[(83.00 ±6.03) vs(168±12.54),(96.00 ±8.77)vs(184.00±14.63)个,均P＜0.01]和侵袭细胞数[(35.00±3.48) vs (97.00±8.32),(38.00±1.73) vs (87.00±6.37)个,均P＜0.01];(2)显著抑制骨肉瘤裸鼠皮下移植瘤的生长(P＜0.01).结论:lncRNA HOXA11-AS在骨肉瘤细胞中低表达,且lncRNA HOXA11-AS过表达对骨肉瘤的发生发展具有抑制作用,可以作为骨肉瘤治疗潜在的分子靶点.     

ROR1-AS1调控Notch1信号通路对乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡影响

摘 要：［目的］ 研究酪氨酸蛋白激酶跨膜受体 1 反义 RNA 1（tyrosine protein kinase transmembrane receptor 1 antisense RNA 1，ROR1-AS1）调控Notch1信号通路对乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡及上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的影响。［方法］ 实时荧光定量PCR方法检测乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-361细胞和正常乳腺上皮MCF10A细胞中ROR1-AS1表达变化。乳腺癌MCF-7细胞分成对照、sh-NC（转染shRNA 对照）、sh-ROR1-AS1（转染ROR1-AS1 shRNA）、sh-ROR1-AS1+Jagged1组（转染ROR1-AS1 shRNA，Notch1通路激活剂Jagged1处理）。CCK-8实验检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，Transwell小室检测细胞迁移和侵袭，Western blot方法检测细胞中活化的半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶9（cleaved cysteinyl aspartate-specific protease-9，C-Caspase-9）、上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）、活化的半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶3（cleaved cysteinyl aspartate-specific protease-3，C-Caspase-3）、神经型钙黏蛋白（N-cadherin）、Notch1、Hes1蛋白表达。 ［结果］ 乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-361细胞中ROR1-AS1水平明显高于正常乳腺上皮MCF10A细胞（P<0.05）。与对照组、sh-NC组比较，sh-ROR1-AS1组乳腺癌MCF-7细胞存活率降低(100.00%±9.82%，99.74%±12.05%，58.91%±6.33%)，细胞凋亡率升高(4.81%±0.26%，4.93%±0.34%，20.58%±2.11%），细胞迁移数目( 225.36±12.84个，224.89±19.56个，140.89±13.64个）和侵袭数目(180.47±16.32个，177.54±16.92个，110.44±10.87个)减少，细胞中C-Caspase-9、E-cadherin、C-Caspase-3蛋白表达水平增加，N-cadherin、Notch1、Hes1蛋白表达水平降低（P<0.05）。与sh-ROR1-AS1组比较，sh-ROR1-AS1+Jagged1组乳腺癌MCF-7细胞存活率升高(100.00%±11.58% vs 147.36%±12.05%），细胞凋亡率降低(19.54%±1.74% vs 8.36%±0.75%)，细胞迁移数目(139.58±12.78个 vs 175.26±16.94个)和侵袭数目（107.45±9.35个 vs 162.04±13.67个）均升高，C-Caspase-9、E-cadherin、C-Caspase-3蛋白水平降低，N-cadherin、Notch1、Hes1蛋白水平升高（P<0.05）。［结论］ 下调ROR1-AS1通过抑制Notch1信号减弱乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移、侵袭和EMT能力，激活细胞凋亡。     

lncRNA LAMA5-AS1通过上调TFPI2表达抑制鼻咽癌细胞的增殖和迁移

目的:检测鼻咽癌组织和细胞株中长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）LAMA5-AS1的表达，观察lncRNA LAMA5-AS1对鼻咽癌细胞增殖和迁移的影响并探讨其作用机制。方法:荧光实时定量聚合酶链式反应（qPCR）分别检测lncRNA LAMA5-AS1在68例鼻咽癌组织及62例慢性鼻咽炎组织、鼻咽癌细胞株及永生化鼻咽上皮细胞中的相对表达。选择lncRNA LAMA5-AS1表达最少的细胞株，分别转染阴性对照质粒（对照组）或载有lncRNA LAMA5-AS1序列质粒（实验组）。MTS法和细胞划痕实验分别检测高表达lncRNA LAMA5-AS1对细胞增殖和迁移能力的影响。qPCR检测高表达lncRNA LAMA5-AS1对组织因子途径抑制物2（tissue factor pathway inhibitor 2，TFPI2）基因mRNA表达的影响，Western blotting检测TFPI2蛋白和ERK信号通路蛋白表达。结果:与慢性鼻咽炎组织比较，lncRNA LAMA5-AS1在鼻咽癌组织中表达明显降低（P＜0.01）。与人永生化鼻咽上皮细胞比较，lncRNA LAMA5-AS1在鼻咽癌细胞株中表达明显降低（P＜0.01），在CNE-2Z细胞中的表达最少（P＜0.01）。与对照组比较，实验组CNE-2Z细胞的增殖能力从第3天开始明显降低（P＜0.05），实验组CNE-2Z细胞迁移能力明显下降（P＜0.01）。与对照组比较，实验组CNE-2Z细胞中TFPI2在mRNA和蛋白水平的表达明显增加（P＜0.01），ERK信号通路蛋白p-ERK、MSK1、MNK和STAT3表达明显降低。结论:lncRNA LAMA5-AS1在鼻咽癌组织和细胞株中表达明显降低，高表达lncRNA LAMA5-AS1可通过上调TFPI2基因表达、下调ERK信号通路活性，抑制鼻咽癌CNE-2Z细胞的增殖和迁移能力。