HD-5分泌性表达载体构建

目的 构建防御素5分泌性表达载体.方法 通过PCR重叠延伸技术得到HD-5信号肽及成熟肽的嵌合分子,并将其插入真核表达质粒pVITRO3.结果 测序结果显示,成功拼接HD-5的信号肽及成熟肽,并插入到真核表达质粒pVITRO3,阅读框正确.结论 PCR重叠延伸技术适用于分泌性载体构建.     

胰高血糖素样肽-2对放射损伤小鼠肠上皮恢复的影响

目的：探讨胰高血糖素样肽－2对放射损伤小鼠肠上恢复的影响。方法：昆明种小鼠经8Gy^60 Co γ射线一次性全身照射后随机分为放射损伤对照组和胰高血糖素样肽－2处理组,检测小肠粘膜组织DNA和蛋白含量,光镜和扫描电镜观察肠上皮形态结构变化。结果：放射损伤小肠粘膜组织DNA和蛋白含量降低,肠绒毛高度下降、数量减少,部分绒毛顶端有糜烂缺损;胰高血糖素样肽－2处理可使肠粘膜组织DNA和蛋白含量降低,肠绒毛增长、数量增多,糜烂发生不明显。结论：胰高血糖素样肽－2可促进放射损伤小鼠肠上皮的恢复。     

黄芩素对2型糖尿病小鼠GLP-1及胰高血糖素分泌的影响

【摘要】 目的 探讨黄芩素对2型糖尿病模型小鼠胰高血糖素样肽-1（GLP-1）及胰高血糖素分泌的影响。 方法 40只8周龄C57BL/6J小鼠适应性饲养1周后,选取30只小鼠给予高脂饲料喂养和链脲佐菌素（STZ）一次性注射,均成功建立2型糖尿病小鼠模型,并随机分为模型组（生理盐水灌胃）、二甲双胍组（二甲双胍0.30 g/kg灌胃）和黄芩素组（黄芩素250 mg/kg灌胃）,每组各10只。以正常饲料喂养的10只小鼠为正常对照组（正常组,生理盐水灌胃）。各组连续灌胃给药6周。分别于给药前和给药后采集尾尖静脉血,检测空腹血糖（FBG）、餐后2 h血糖值（2 h PBG）,酶联免疫吸附实验检测空腹胰岛素、胰高血糖素和GLP-1水平,qRT-PCR检测给药后小鼠回肠组织中胰高血糖素原（PG）和前激素转化酶（PC1/3） mRNA表达,给药结束后行腹腔注射葡萄糖耐量实验评估胰高血糖素分泌功能。 结果 给药前,与正常组比较,模型组、二甲双胍组和黄芩素组FBG和2 h PBG均显著升高,胰岛素水平显著降低,胰高血糖素水平显著升高,血清中GLP-1水平显著降低（均P＜0.05）;给药后,与模型组比较,二甲双胍组和黄芩素组FBG和2 h PBG均显著降低,胰岛素水平显著升高,胰高血糖素水平显著降低,血清中GLP-1水平显著升高（均P＜0.05）;给药后,与正常组比较,模型组小鼠回肠组织中PC1/3 mRNA相对表达量显著下降,与模型组比较,二甲双胍组和黄芩素组小鼠回肠组织中PG 、PC1/3 mRNA相对表达量均明显上升（均P＜0.05）;在葡萄糖注射后0 、30、60 和120 min,模型组血糖和胰高血糖素均显著高于正常组,二甲双胍组和黄芩素组血糖和胰高血糖素均显著低于模型组（均P＜0.05）。 结论 黄芩素可降低2型糖尿病小鼠血糖和胰高血糖素水平,提高血清GLP-1水平,促进肠道GLP-1的合成。     

口服谷氨酰胺对2型糖尿病患者血浆胰高血糖素样肽-1分泌的影响

目的:观察口服谷氨酰胺对2型糖尿病患者血浆胰高血糖素样肽-1(GLP-1)分泌的影响。方法:收集10例糖耐量异常者、10例病程<1年的2型糖尿病患者、10例病程≥1年而<5年的2型糖尿病患者、10例病程≥5而<10年的2型糖尿病患者、10例病程≥10年的2型糖尿病患者以及10例非肥胖健康个体作为研究对象。间隔1个月先后口服75 g葡萄糖及30 g谷氨酰胺,在服药前(0 min)及口服药物后30、60、90和120 min分别留血,检测血浆GLP-1、胰岛素以及血糖水平的变化。结果:口服75 g葡萄糖后,健康人及不同病程2型糖尿病患者的血浆GLP-1水平均升高,健康人的GLP-1分泌高峰在30 min(6.167 ng·ml-1),糖耐量异常者、病程<1年、病程≥1年而<5年、病程≥5年而<10年的2型糖尿病患者GLP-1的分泌高峰也在30 min(分别为4.195、3.706、3.794、3.000 ng·ml-1),病程≥10年的2型糖尿病患者GLP-1的分泌高峰在60 min(3.923 ng·ml-1)。口服30 g谷氨酰胺后,所有的受试者的血浆GLP-1的水平也均升高,健康人、糖耐量异常者以及病程<1年的2型糖尿病患者的GLP-1分泌高峰均在30 min(分别为5.488、3.719、3.718 ng·ml-1),病程≥1年而<5年、病程≥5年而<10年以及病程≥10年的2型糖尿病患者GLP-1分泌高峰在60 min(分别为3.667、2.399、2.368 ng·ml-1)。结论:不同病程的2型糖尿病患者存在不同程度的GLP-1分泌缺陷,口服葡萄糖刺激的GLP-1分泌峰值随糖尿病病程的增加呈下降趋势。口服30 g谷氨酰胺可以促进不同病程的2型糖尿病患者血浆GLP-1的分泌,并且不会影响2型糖尿病患者的血糖水平。谷氨酰胺通过促进2型糖尿病患者GLP-1的分泌,可能可以在2型糖尿病患者的血糖控制中发挥作用。     

肠道缺血再灌注后GLP-2对黏膜增殖的影响

目的观察胰高血糖素样肽-2(GLP-2)对小鼠肠道缺血再灌注后肠黏膜增殖的影响及机制。方法将30只ICR雄性小鼠随机分为空白对照组、实验对照组和治疗组。实验对照组和治疗组小鼠均制成肠道缺血再灌注模型。实验对照组予PBS液皮下注射,治疗组予GLP-2皮下注射。于术后第5d处死,行不同肠段黏膜形态学检测、细胞增殖核心抗原(PCNA)测定及原位末端标记(INST)染色。结果治疗组各肠段黏膜形态学指标均显著高于实验对照组和空白对照组(均P<0.05),尤以末端回肠为著(P<0.01);治疗组PCNA指数显著高于实验对照组(P<0.01);治疗组细胞凋亡显著低于实验对照组(P<0.01)。结论GLP-2能刺激小肠黏膜上皮增生,抑制凋亡,显著促进肠道缺血再灌注后的黏膜增殖修复。     

胰高血糖素样肽-2对放射损伤小鼠肠上皮丝裂素活化蛋白激酶活性的影响

目的观察高血糖素样肽-2对放射损伤小鼠肠上丝裂素活化蛋白激酶活性的影响,并探讨其与肠上皮增殖能力变化的关系。方法 昆明种小鼠经8Gy^60Coγ射线一次性全身照射后随机分为放射损伤对照组和胰高血糖样肽-2处理组,检测小肠上皮增殖能力和丝裂素活化蛋白激酶活性。结果 胰高血糖素样肽-2处理后肠上皮BrdU标记阳性细胞百分离明显增加,同时丝裂素活化蛋白激酶活性显著升高,二者呈显著正相关。结论 胰高血糖素样肽-2可促进放射损伤肠上皮增殖,并可能与其激活肠上皮丝裂素活化蛋白激酶有关。     

肠道GLP-1受体表达水平与T2DM及肥胖的关系

目的 分析肠道胰高血糖素样肽（GLP）-1受体表达水平与2型糖尿病（T2DM）及肥胖的关系。方法 选取2017年7月至2019年6月三亚中心医院接受结肠外科手术的肥胖型T2DM、单纯T2DM、体质量与血糖均正常的患者各30例,分别为A组、B组、C组。对比各组研究对象的基本信息资料、生化指标检测结果,并取正常近端肠道病理切片观察肠道GLP-1受体表达情况;采用Pearson相关系数评价肠道GLP-1受体相对表达量与各指标的关系,多元逐步回归法分析GLP-1表达的影响因素。结果 A组体质指数（BMI）、腰臀比、体脂率均高于B组、C组,差异有统计学意义（P<0.05）。空腹血糖（FBG）、服糖后2小时血糖（2 h PG）、空腹胰岛素（Fins）、糖化血红蛋白（HbA1c）、C肽比较,A组>B组>C组,各组间差异均有统计学意义（P<0.05）。免疫组化显示GLP-1受体高表达于近端结肠黏膜层,肌间神经层、环肌层中可见少量表达,且A组、B组、C组GLP-1受体表达依次升高,其相对表达量分别为（98.22±17.30）、（117.85±24.07）、（149.62±29.40）,差异有统计学意义（P<0.05）。肠道GLP-1受体相对表达量与BMI、腰臀比、体脂率及FBG、2 hPG、Fins、HbA1c、C肽呈负相关（r=-0.326,-0.338,-0.421,-0.625,-0.520,-0.471,-0.394,-0.362,P<0.05）。多元逐步回归分析显示,BMI、腰臀比、体脂率、FBG、2hPG、Fins、HbA1c、C肽均为肠道GLP-1受体相对表达量变化的独立影响因素（P<0.05）。结论 肠道GLP-1受体表达水平受T2DM、肥胖的影响,且与BMI、腰臀比、体脂率、糖代谢及胰岛素功能密切相关。     

GLP-1与2型糖尿病及糖尿病肾病的相关性研究

目的 探讨2型糖尿病者(T2DM)和健康对照者(NC),糖尿病肾病者(DN)和糖尿病非肾病者(NDN)血浆胰高血糖素样肽-1(GLP-1)水平的差异.方法 选择144例云南汉族人群为研究对象,包括2型糖尿病患者86例[其中55例糖尿病无肾病(NDN),30例糖尿病肾病(DN)],为T2DM组,健康对照者59例,为NC组.采用EIA法测定空腹GLP-1浓度,比较不同组别之间血浆GLP-1水平的差异.结果 T2DM患者空腹血浆GLP-1浓度低于NC者,[(3.83±6.84) pmol/L vs (2.78±2.95) pmol/L,P＜0.05];NDN患者与DN患者空腹血浆GLP-1浓度差异无统计学意义[(2.68±2.57) pmol/L vs (2.96±3.58) pmol/L,P＝0.665].血浆GLP-1水平与HDL-C呈正相关,与年龄呈负相关.结论 血浆GLP-1水平的降低可能是2型糖尿病的危险因素,而GLP-1水平增高有可能在2型糖尿病患者大血管并发症的发生中发挥作用.年龄的增长引起GLP-1浓度下降可能为T2DM的发病机制之一.     

糖尿病前期患者GLP-1及胰高血糖素的分泌特点分析

目的:探讨糖尿病前期空腹血糖受损(IFG)、糖耐量低减(IGT)及IFG合并IGT患者血清胰高血糖样肽-1(GLP-1)和胰高血糖素(GC)水平的变化。方法 :IFG组19例、IGT组21例、IGT+IFG组21例和正常血糖(NGT)的对照组20例。4组均行口服葡萄糖耐量试验,测定0、30、60、90、120min时静脉血清中GLP-1和胰高血糖素水平。结果:IGT+IFG组患者空腹GLP-1较NGT组(16.67±11.62vs 20.68±9.17)明显降低。其余各组(IFG、IGT)较NGT组间无显著性差异。IFG组的2hAUCGLP较IGT、IFG+IGT(48.02±0.50VS 45.33±0.41;34.31±0.47)组均显著升高;而IFG+IGT组的2hAUCGLP较NGT组(34.31±0.47VS 46.25±0.62)显著下降。3个糖调节受损组(IFG;IGT;IFG+IGT)的空腹胰高血糖素(0.56±0.20;0.59±0.18;0.62±0.3VS 0.46±0.12)pmol/L和2hAUCGC(1.32±0.35;1.34±0.46;1.55±0.52VS 1.08±0.12)较NGT组显著升高,且有显著性差异(P<0.05)。IGT+IFG组的2hAUCGC较IFG组显著升高(1.55±0.52VS 1.32±0.35);与单纯IGT组间无显著性差异。结论:对于糖尿病前期患者,IFG+IGT患者的空腹及餐后GLP-1较NGT均显著降低;空腹GC及2hAUCGC较NGT均显著升高。IFG组2hAUCGLP、空腹胰高血糖素、2hAUCGC较NGT均显著升高。     

重叠区扩增基因拼接法在构建膜锚定金黄色葡萄球菌肠毒素A融合基因上的应用

目的：将超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因与人胎盘碱性磷酸酶(hPLAP-1)C末端信号肽序列进行拼接，形成融合基因。方法：利用重叠区扩增基因拼接法，分别扩增hPLAP-1C末端信号肽序列和SEA基因序列。然后，将二段基因拼接并与pGEM-T克隆栽体连接，酶切和测序鉴定。结果：成功扩增出hPLAP-1C末端信号肽序列131bp和SEA基因序列796bp；经测序证实，二段基因序列成功拼接(901bp)。结论：重叠区扩增基因拼接法能将SEA基因与hPLAP-1C末端信号肽序列拼接，形成融合基因。     

人NKG2D真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达

目的 :构建人NKG2D重组真核表达载体 ,并研究其在COS 7细胞中的表达。方法 :应用RT PCR ,自健康人外周血单个核细胞 (PBMC)中获取NKG2DcDNA ,应用基因重组技术构建含目的基因的T载体克隆后 ,构建含目的基因的真核细胞表达质粒 ,并经酶切和测序证实。然后应用脂质体介导将重组真核表达质粒转染COS 7细胞 ,用RT PCR和流式细胞术 (FCM)检测转染细胞NKG2D表达。结果 :重组真核表达载体中插入片段序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。NKG2D在COS 7细胞中获得表达。结论 :成功地构建了重组表达载体pcD NA3.1 NKG2D ,并实现了在COS 7细胞中的瞬时表达 ,为研究NKG2D的生物学活性奠定了基础。     

MIA2慢病毒表达载体构建及其表达活性的研究

目的：构建黑色素瘤抑制蛋白2（MIA2）慢病毒表达载体,并将其通过脂质体转染到HepG2细胞中,观察转染前后MIA2表达变化及其对细胞凋亡的影响。方法以pDONR223‐MIA2为模板,PCR扩增MIA2,构建pLVX‐IRES‐ZsGreen1‐MIA2慢病毒表达载体,体外瞬时转染肝癌细胞HepG2,荧光显微镜下观察MIA2的表达情况,用实时荧光定量PCR（RT‐PCR）检测HepG2细胞中MIA2mRNA的表达情况,噻唑蓝（MTT）法和克隆形成实验检测细胞增殖的情况。结果成功构建pLVX‐IRES‐ZsGreen1‐MIA2慢病毒表达载体;RT‐PCR结果显示,阴性对照组与实验组细胞MIA2mRNA表达水平差异有统计学意义（P＜0．05）;MTT检测发现,实验组细胞增殖数目较阴性对照组明显减少,差异有统计学意义（P＜0．05）;此外,实验组的克隆形成数和细胞迁移数均较阴性对照组明显减少,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论pIRES2‐ZsGreen1‐MIA2可显著下调MIA2的表达水平进而抑制肝癌细胞HepG2的体外增殖及迁移能力。     

重叠延伸PCR技术定点突变TFEB原核表达载体的构建及体外诱导表达和纯化

目的：基于重叠延伸PCR (SOE PCR)技术构建转录因子EB (TFEB)丝氨酸114位点突变体原核表达质粒,并进行体外诱导表达和纯化。方法：根据SOE PCR技术原理设计突变引物,以pGEX-6p-1-TFEB质粒为模板,分别采用外侧引物F和R及突变引物Fn和Rn进行第1步PCR扩增,获得含突变位点的产物1和产物2。经第2步PCR退火延伸对产物1和产物2进行重叠拼接,以拼接后DNA片段为模板,采用外侧引物F和R进行第3步PCR扩增获得含突变位点的目的 DNA;将其克隆至pGEX-6p-1载体,采用Bam HⅠ和SalⅠ进行酶切鉴定,DNA测序验证突变结果。于大肠杆菌(E. coli)中分别采用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在不同条件下诱导TFEB及其突变体重组蛋白表达。Glutathione-Sepharose 4B琼脂糖凝珠分离纯化蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化产物蛋白浓度和相对分子质量。结果：第1步PCR扩增获得均含有突变位点的2条DNA片段,经第2步PCR退火延伸和第3步PCR扩增后获得大量含有突变位点的完整DNA片段。双酶切鉴定,连接的DNA片段...     

复合T辅助细胞表位基因质粒的构建及测序

目的制备复合T辅助细胞表位基因。方法复合T辅助细胞表位由5个T辅助细胞表位组成(结核杆菌热休克蛋白65p120、风疹蛋白E2-4p5465、人工合成T辅助细胞表位PADRE、沙眼衣原体热休克蛋白60p3548、破伤风类毒素p830843),其基因序列由219个核苷酸组成。人工合成4条69bp的DAN片段,各片段首尾之间有19bp的互补序列,应用DNA互补延伸拼接技术将4条DNA片段拼接成复合T辅助细胞表位,通过克隆、测序进行筛选。结果通过人工合成基因片段,应用DNA互补延伸拼接技术,成功制备了219个碱基的复合T辅助细胞表位基因,构建了复合T辅助细胞表位基因质粒。结论复合T辅助细胞表位基因的成功制备为研究复合T辅助细胞表位高效疫苗奠定了基础。     

EBNA2基因真核表达载体的构建及表达产物的功能

目的: 构建EB病毒核心抗原2(EBNA2)的真核表达载体,在真核细胞中表达,并检测其表达产物的功能.方法: 应用DNA重组和PCR方法从质粒pSG5-EBNA2中亚克隆EBNA2的编码基因,插入到真核表达载体pCMV-HA中.应用脂质体的方法将重组质粒pCMV-EBNA2瞬时转染Cos-7细胞,通过Western blot和免疫荧光方法检测EBNA2的表达.应用荧光素酶报告实验检测EBNA2蛋白的活性.结果:克隆EBNA2的编码基因,经序列分析证实与GenBank中的序列完全一致.以含有EBNA2编码基因的真核表达载体瞬时转染Cos-7细胞,EBNA2基因的表达产物通过Western blot和免疫荧光方法得到证实.荧光素酶报告实验显示所表达的蛋白具有转录激活活性.结论:成功构建EBNA2的真核表达载体,证实其在真核细胞Cos-7可以表达,并具有转录激活功能.     

乙型肝炎病毒基因生物信息学分析及特异片段的制备

目的制备HBV基因分型芯片模板。方法通过不同基因型HBV全基因组的序列比对,选取6个碱基位点作为分型位点,应用重叠区扩增基因拼接法(SOEing法)对C型HBV片段进行点突变。结果在所选位点上成功引入点突变。结论SOEing法是一种简便引入点突变的方法,可以应用此法制备HBV基因分型检测基因所需的模板DNA。     

人UROC28基因真核表达载体的构建

目的:构建人UROC28基因的真核表达载体,观察其在HEK293细胞中的表达。方法:以PUC-19-UROC28质粒为模板,扩增UROC28基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3中,酶切鉴定目的基因。重组质粒用脂质体转染HEK293细胞,Western blot观察基因表达情况。结果:PCR扩增的特异性片段长度为430bp,以此构建的重组质粒pcDNA3-UROC28,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5.4kb和430bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人UROC28cds序列一致。证明UROC28因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcD-NA3中。Western blot证实pcDNA3-UROC28转染HEK293细胞24 h后有UROC28的表达。结论:成功构建了pcD-NA3-UROC28重组真核表达载体,并在HEK293细胞中表达。     

凋亡抑制基因survivin表达载体的构建及其在HepG2中的表达

目的:克隆细胞凋亡抑制蛋白Survivin(SVV)的编码序列,构建含SVV基因的真核细胞表达载体并在肝癌细胞系HepG2中表达,为进一步研究该基因在肝癌发病中的作用奠定基础. 方法:根据已发表的SVV基因的核苷酸序列设计并合成一对引物,以HL-60细胞系抽提的RNA为模板进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用BamHI和XhoI双酶酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.0中,用限制性内切酶酶切重组质粒pcDNA3.0-SVV和DNA序列测定进行鉴定. 用脂质体法将pcDNA3.0-SVV导入肝癌细胞系HepG2中,G418选择培养,经免疫组化法和RT-PCR鉴定其表达. 结果:RT-PCR扩增出长445 bp的特异性片段,经克隆至pcDNA3.0后酶切鉴定证实,并测序表明序列与GenBank报道完全一致. pcDNA3.0-SVV在HepG2细胞中有稳定表达. 结论:成功克隆了SVV的编码序列,构建了其真核细胞表达载体pcDNA3.0-SVV,有助于对SVV基因在肝癌发生中的致瘤机制做进一步研究.