抗伏马菌素B1单克隆抗体的制备和特性

目的建立敏感、特异和快速的针对伏马菌素B1(fumonisin B1, FB1)的酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay ,ELISA)检测方法,形成具有我国自主知识产权的快速检测试剂盒.方法利用B细胞杂交瘤技术,建立能分泌抗伏马菌素B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株.结果用伏马菌素B1-牛血清白蛋白(FB1-BSA)偶联物免疫8～10周龄雌性BALB/c小鼠后,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0融合,经过3～4次亚克隆建立了1个稳定分泌抗伏马菌素B1毒素抗体的杂交瘤细胞株,命名为5A9.将杂交瘤细胞打入BALB/c小鼠腹腔,获得含抗伏马菌素B1毒素单克隆抗体的腹水,并将腹水用饱和硫酸铵法进行纯化,得到单克隆抗体.该单克隆抗体的Ig亚类为IgG1,腹水中抗体的滴度分别为2.56×106,参考工作浓度为3.2×105.纯化后抗体的IgG含量为10.4 g/L,亲和常数为8.3×10-8 mol/L.该抗体与其他结构类似物无交叉反应,具有较高的特异性.结论制备了具有高特异性和亲和力的抗伏马菌素B1单克隆抗体,初步形成了针对伏马菌素B1的ELISA检测试剂盒.     

抗T-2毒素单克隆抗体的制备及特性

目的 :建立敏感、特异和快速的针对T 2毒素的ELISA检测方法 ,形成具有我国自主知识产权的快速检测试剂盒。方法 :利用B细胞杂交瘤技术 ,建立抗T 2毒素的单克隆杂交瘤细胞株。结果 :用T 2 羊免疫球蛋白 (T 2 GIgG)偶联物免疫 8～ 10周龄雌性BALB/c小鼠后 ,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2 /0融合 ,经过 3～ 4次亚克隆建立了 2个稳定分泌抗T 2毒素抗体的杂交瘤细胞株 ,分别命名为 2A7和 6E4。将上述 2株杂交瘤细胞分别注入BALB/c小鼠腹腔 ,获得含抗T 2毒素单克隆抗体的腹水 ,并将腹水用饱和硫酸铵法进行纯化 ,得到 2A7和 6E4单克隆抗体。两株单克隆抗体的Ig亚类为IgG1,腹水中抗体的滴度分别为 6 .4× 10 6和 1.1× 10 7,参考工作浓度分别为1.0× 10 6和 3.2× 10 6。纯化后 2A7抗体的IgG含量为 16 .4g/L ,亲和常数为 8× 10 -8mol/L。 2A7抗体与其他结构类似物无交叉反应 ,具有较高的特异性。结论 :制备了具有高特异性和亲和力的抗T 2毒素单克隆抗体 ,初步建立了针对T 2毒素的ELISA检测方法。     

抗PSMA7单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的制备抗蛋白酶体α7亚基(PSMA7)的单克隆抗体,为PSMA7的功能研究奠定基础。方法以纯化的重组蛋白PSMA7为抗原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备PSMA7单克隆抗体,并用间接ELISA法和Western blot法对单克隆抗体的特性进行鉴定。结果成功建立两株稳定分泌抗PSMA7蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为B013和B001。检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1∶128和1∶256,腹水效价为1∶25600和1∶32000。两株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG1。Westernblot及免疫组化实验证实,两株单克隆抗体均能特异性结合真核细胞内源性PSMA7蛋白。结论成功建立了两株效价高、特异性好的抗PSMA7单克隆抗体杂交瘤细胞,制备的单克隆抗体可用于PSMA7蛋白的鉴定,为其生物学功能研究奠定了基础。     

白念珠菌烯醇化酶单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备并鉴定抗白念珠菌烯醇化酶单克隆抗体杂交瘤细胞株。方法：提取白念珠菌标准株ATCC-9002胞内烯醇化酶做抗原,再用细胞融合技术制备单克隆抗体,采用间接ELISA法对单克隆抗体进行筛选和鉴定。结果：建立了1株持续分泌抗白念珠菌烯醇化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中Mab07．4G6-F3-C7小鼠腹水单克隆抗体的最高稀释度达1：12800,单克隆抗体的重链属IgG1亚类,轻链属K型;Western blot证实单抗能与自念珠菌烯醇化酶抗原特异性地结合。结论：本研究建立了抗白念珠菌烯醇化酶杂交瘤细胞株单克隆抗体,为快速诊断白念珠菌感染奠定了实验基础。     

盐酸克仑特罗单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗盐酸克仑特罗(clenbuterol ,CL)的单克隆抗体并进行免疫学特性鉴定.方法:用重氮化法将盐酸克仑特罗偶联于载体牛血清白蛋白(BSA),形成的结合抗原BSA-CL作为免疫原免疫BALB/c小鼠,同时将CL与卵清白蛋白(OVA)偶联制备检测原(OVA-CL).应用杂交瘤技术建立分泌抗盐酸克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水并进行纯化.用竞争性ELISA法测定抗体的亲和常数及交叉反应性.结果及结论:获得了18株稳定分泌抗盐酸克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株,挑选其中E9-C11、C11-E3、E7-G8三株高亲和力的细胞株进行免疫学特性鉴定.三株抗体的亚类均为IgG1.细胞上清的间接ELISA效价分别为1:1 280、1:1 000、1:800,三株腹水效价都约为1×10-6.亲和常数分别为2.4×10-8mol/L、2.83×10 -8 mol/L 、3.28×10-8 mol/L .E9-C11单抗对CL的IC50为6.1035μg/L;对沙丁胺醇的IC50大于781.25 μg/L,交叉反应性小于0.78%;对肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素、莱克多巴胺及部分维生素和抗生素均无交叉反应性.蛋白免疫印迹分析证明三株单抗特异性均很高,可用于与其相关的免疫检测或应用研究.     

抗河流弧菌单克隆抗体的建立及初步鉴定

目的 制备高效、特异的抗河流弧菌单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),为海洋致病细菌的快速免疫诊断提供技术支持.方法 选用雌性BALB/c小鼠(8周龄)制备成为灭活河流弧菌免疫小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术,制备出抗河流弧菌杂交瘤细胞株,用Giemsa染色对其进行染色体鉴定,并用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法筛选其与河流弧菌及其他重要海洋细菌的交叉反应特异性.结果 共获得4株抗河流弧菌mAb,均符合杂交瘤细胞染色体特点,具有良好的特异性和免疫反应性,分别命名为01H10,02F12,05F3和03G10.结论 本研究制备、筛选出抗河流弧菌的mAb,有助于建立抗河流弧菌快速免疫检测试剂盒.     

抗莱氏无胆甾原体单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

本文采用浓缩提纯的莱氏无胆甾原体做为抗原,多途径免疫 BALB/C 小鼠,取脾细胞与 SP_2/O-Ag~(14)小鼠骨髓瘤细胞融合,建立了4株分泌抗莱氏无胆甾原体单克隆抗体杂交瘤细胞。分析了杂交瘤细胞的染色体,平均数为103条;制备了腹水抗体,经 APAAP 法(碱性磷酸酶—抗碱性磷酸酶桥联酶标显色技术)和 IFA 法检测,抗体效价在80～320之间;对免疫球蛋白亚类进行了鉴定,其抗体均为 IgM。上述细胞经3～4个月稳定传代后,冻存于液氮中。该单克隆抗体的制备对细胞培养中支原体污染的检出可能有重要意义。     

破伤风毒素单克隆抗体的制备及鉴定

目的 一株抗破伤风毒素鼠源单克隆抗体的制备与鉴定.方法 从实验室前期以破伤风类毒素为抗原筛选得到的6株稳定细胞株中选取4E12进行制备及鉴定,首先将4E12细胞株扩大培养后腹腔注射BALB/c小鼠制备腹水,经Protein G柱和PD10脱盐柱两步纯化鼠源单抗;其次通过SDS-PAGE电泳检测抗体纯度并通过分型试剂盒鉴定抗体轻重链亚型,免疫印迹法鉴定抗体结合区域及表位类型,非竞争ELISA法测定抗体亲和力常数以及小鼠中和实验评价抗体中和活性.结果 获得能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株4E12,其细胞培养上清效价为4×103,抗体轻重链分别为κ型和IgG1型,CDR3序列分别为SQSTHVPPT和ARKGTGTGFNY;4E12腹水抗体效价为3.2×104,抗体经纯化后纯度＞95％,以线性表位与TeNT/Hc结构域特异性结合,两者的亲和力常数为3.6×10-10 mol/L,小鼠中和实验结果显示,4E12抗体可部分中和破伤风毒素.结论 筛选到一株高亲和力的鼠源单抗,为破伤风毒素检测及中和抗体研发奠定了基础.     

定量检测肝细胞生成素Cn的双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的 建立定量检测肝细胞生成素Cn (HPPCn)的双抗体夹心ELISA方法.方法 利用杂交瘤方法获得8个抗HPPCn单克隆抗体(mAb),并行SDS-PAGE和Western印迹对纯化抗体特性进行鉴定.利用镀金芯片法对8个抗体进行配对检测.通过方阵滴定法确定包被抗体和酶标抗体的最适工作浓度.以纯化的HPPCn抗原为标准品建立标准曲线.结果 得到了8株稳定分泌抗人HPPCn抗体的杂交瘤细胞株,分别为Ab 65-29-6,Ab_3-3-3,Ab_9-34-1,Ab_4-8-12,Ab_7-8-10,Ab_2-30-23,Ab_1 1-11-12和Ab_12-27-23.8个抗体均能够特异结合HPPCn抗原,其中Ab_65-29-6与细胞中HPPCn结合的特异性最好.经抗体配对检测证实最佳配对组合为:Ab_2-30-23和Ab_4-8-12.包被抗体Ab_2-30-23和识别抗体Ab 4-8-12的最适工作浓度为2.5 μg/ml,最适稀释度为1∶2000,标准曲线检测的线性范围为5.0～60 ng/ml.结论 制备了可特异性检测人HPPCn蛋白的单克隆抗体,并建立了一种可用于定量检测人HPPCn的双抗体夹心ELISA方法.     

咪唑啉受体抗血清选择性蛋白的表达、纯化及单克隆抗体制备

目的:表达和纯化咪唑啉受体抗血清选择性蛋白(imidazoline receptor antiserum-selected protein,IRAS protein),制备IRAS蛋白的单克隆抗体.方法:采用基因重组技术在大肠杆菌表达IRAS蛋白;金属镍螯合的Ni-NTA亲和层析柱进行蛋白纯化;杂交瘤技术建立分泌IRAS单克隆抗体的杂交瘤细胞株;以间接ELISA方法筛选分泌特异性IRAS单克隆抗体的杂交瘤细胞;采用蛋白免疫印迹、间接免疫荧光方法鉴定单克隆抗体的特异性.结果:成功表达并纯化了IRAS重组蛋白,纯度达到95%.共筛选出5株分泌IRAS单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备腹水并纯化了IRAS的单克隆抗体,腹水中单克隆抗体效价分别为1∶ 8×106,1∶ 2×106和1∶ 5×106,属于IgG1亚型.该抗体能与原核及真核系统表达的IRAS重组蛋白发生特异性反应,间接免疫荧光显示IRAS蛋白主要定位于细胞质中.结论:建立了稳定分泌IRAS单克隆抗体的杂交瘤细胞株,成功制备了特异性好的IRAS单克隆抗体,为研究IRAS的功能提供了有力的研究工具.