蚯蚓纤溶酶部分质量标准的研究

采用亲和层析、凝胶层析对蚯蚓粗提液进行分离、纯化,得到蚯蚓纤溶酶纯化样品,并对其活性、含量、纯度等检测方法进行了试验研究,确定HPLC、SDS-PAGE电泳、280nm紫外吸收、琼脂糖-纤维蛋白平板法分别为蚯蚓纤溶酶的纯度、相对分子量、含量及活性的检测方法.同时又对纯化的蚯蚓纤溶酶进行了N-末端的测序,获得了重要的蚯蚓纤溶酶分子生物学的研究资料.     

蚯蚓纤溶酶部分质量标准的研究

采用亲和层析、凝胶层析对蚯蚓粗提液进行分离、纯化，得到蚯蚓纤溶酶纯化样品，并对其活性、含量、纯度等检测方法进行了试验研究，确定HPLC、SDS—PAGE电泳、280nm紫外吸收、琼脂糖-纤维蛋白平板法分别为蚯蚓纤溶酶的纯度、相对分子量、含量及活性的检测方法。同时又对纯化的蚯蚓纤溶酶进行了N-末端的测序，获得了重要的蚯蚓纤溶酶分子生物学的研究资料。     

豆豉纤溶酶的分离纯化及部分酶学性质研究

 目的 从豆豉中分离出具有强纤溶活性的菌株,从该菌株的发酵液中纯化出纤溶酶并对此纤溶酶的部分酶学性质进行研究。方法 利用硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱和Sephadex G-75凝胶过滤色谱等方法进行纯化;利用N-末端氨基酸序列测定及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对此酶进行鉴定。结果 从发酵液中获得了纤溶酶单一组分,表观相对分子质量为30×10³。该纤溶酶在50 ℃以下和pH 7.0~9.0之间保持稳定,最适温度为35 ℃;最适pH为8.6。N-末端氨基酸序列及飞行时间质谱测定结果都表明该酶与纳豆激酶氨基酸序列有着极高的相似性。结论 获得了纤溶酶单一组分,为纤溶酶发酵产品的大规模纯化和进一步研制开发新的溶栓药物提供重要理论依据。     

蚯蚓纤溶酶活性影响因子的研究

目的 :对提取过程中影响蚯蚓纤溶酶活性的 5种因子进行了分析 ,以提高纤溶酶的提取活性。方法 :分别采用 0.9%NaCl抽提、10%蔗糖抽提、75%酒精抽提出粗酶。酶活测定方法采用尿激酶琼脂糖 纤维蛋白平板法。硒含量的测定方法采用 3,3′-二氨基联苯胺比色法 ;砷含量的测定方法采用二乙氨基二硫代甲酸银比色法。结果 :饲养在牛粪饵料中的蚯蚓纤溶酶活性比饲养于生活垃圾中的蚯蚓纤溶酶活性更高 ,蚯蚓体内砷的含量与纤溶酶活性呈正相关 ,而蚯蚓体内硒的含量对纤溶酶活性影响不大。在采用 3种不同的蚯蚓纤溶酶的抽提方法中 ,75 %酒精抽提效率最高 ,0.9%氯化钠次之 ,10%蔗糖最低 ;在蚯蚓纤溶酶纯化过程中 ,透析比超滤对蚯蚓纤溶酶的活性影响更小一些。结论 :通过将蚯蚓饲养在适宜的饵料中 ,使用合适的提取手段和提纯方法 ,可以提高蚯蚓纤溶酶的提取活性。     

蚯蚓溶栓酶基因的克隆及非融合性表达

 目的克隆和表达我国特有的双胸蚓属蚯蚓(Lumbricus bimastus)体内一种具有纤溶活性的蛋白质。方法通过蛋白质N-末端测序、引物设计及合成、RT-PCR得其对应的cDNA，随后构建了pBV₂₂₀-P₃₀重组质粒，在大肠杆菌DH_5α中进行非融合性表达，再经亲和色谱柱纯化复性，得到重组蚯蚓溶栓酶蛋白。结果 克隆cDNA全长888 bp，编码含242个氨基酸的成熟肽，SDS-PAGE电泳显示分子量在30×10-3左右，因此将其命名为P₃₀，经活性测定，具有纤溶活性。结论P₃₀为首次发现的新基因，在国际基因库的输入号为Genebank AF-109648，并获得国家专利，专利号为98102257.X。     

蚯蚓纤溶酶去糖基化和免疫反应性分析

 目的对去糖基化的蚯蚓纤溶酶进行免疫反应性分析。方法①将变性的蚯蚓纤溶酶全组分与免疫佐剂混合,免疫家兔制得抗血清,酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和Western-blotting检测抗血清的效价。②三氟甲基磺酸去除蚯蚓纤溶酶全组分及6.5#,7#单组分的糖链,SDS-PAGE和ConA-HRP亲和印迹检测糖链的去除情况。③ELISA和Western-blotting检测糖链去除前后蚯蚓纤溶酶免疫反应性是否有变化。结果去除糖链后蚯蚓纤溶酶全组分及6.5#,7#单组分的免疫反应性基本没有变化。结论糖链的存在与否对蚯蚓纤溶酶组分免疫反应性的影响不大,提示蚯蚓纤溶酶分子上的寡糖链可能不构成其抗原决定簇。     

蚯蚓纤溶酶分离及部分生化性质的研究

采用亲合层析法对蚯蚓纤溶酶进行初步纯化,并对其生化特性进行鉴定。结果表明：经纯化的蚯蚓溶酶其分子量在20KD－30KD之间,对人血纤维蛋白平板具有良好的溶解作用,并考察了其热稳定性。纤溶酶能激活血栓中的纤溶酶原,从而使血栓溶解,直接作用于血栓表面,使形成血栓的纤维蛋白溶解成小分子,达到抗血栓之目的。     

蚯蚓纤溶酶分离及部分生化性质的研究

采用亲合层析法对蚯蚓纤溶酶进行初步纯化,并对其生化特性进行鉴定.结果表明经纯化的蚯蚓纤溶酶其分子量在20KD-30KD之间,对人血纤维蛋白平板具有良好的溶解作用,并考察了其热稳定性.纤溶酶能激活血栓中的纤溶酶原,从而使血栓溶解,直接作用于血栓表面,使形成血栓的纤维蛋白溶解成小分子,达到抗血栓之目的.     

淡豆豉炮制过程中产纤溶酶微生物的筛选和鉴定

目的 筛选和鉴定淡豆豉炮制过程中产纤溶酶的优势菌株。方法 按《中国药典》2020年版制备淡豆豉;采用酪蛋白平板法和纤维蛋白平板法分别对淡豆豉炮制不同时间点样本中产纤溶酶的微生物进行初筛和复筛;将产纤溶酶微生物分别接种在特定的液体培养基中培养,获得纯种发酵液,用纤维蛋白平板法测定发酵液的纤溶酶活力;应用16S rDNA和18S rDNA通用引物分别对产纤溶酶细菌和真菌进行PCR扩增、对扩增产物进行测序,测序结果通过NCBI同源性比对、MEGA 4.1软件构建系统发育树进行分子生物学鉴定。结果 筛选获得3种产纤溶酶细菌,分别为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia、微球菌Micrococcus。纤维蛋白平板法测定纯种发酵液纤溶酶活力的结果显示,嗜麦芽窄食单胞菌所产纤溶酶活力最高,达527.49 IU/mL。结论 淡豆豉炮制过程中存在高产纤溶酶的优势菌株,淡豆豉的溶栓作用值得进一步研究。为揭示淡豆豉炮制中纤溶酶形成机制奠定基础。     

玉郎伞黄酮对心肌缺血再灌注损伤心肌组织ATP酶和凋亡蛋白的影响

目的 :研究玉郎伞黄酮(FYLS)对大鼠离体心肌缺血再灌注损伤(I/R)心肌组织Na⁺-K⁺-ATP酶、Ca²⁺-ATP酶和凋亡蛋白的影响。 方法 :离体大鼠心脏采用Langendorff法灌流,停灌30 min再灌30 min造成I/R模型。测定心肌组织Na⁺-K⁺-ATP酶、Ca²⁺-ATP酶活性。同时观察药物对缺血再灌注后心肌组织病理形态、凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax表达的影响。 结果 :FYLS高剂量(8×10^-3g ·L^-1)可显著改善缺血-再灌注所致的心功能损伤,增加Na⁺-K⁺-ATP酶、Ca²⁺-ATP酶的活性;与模型组比较,FYLS高剂量组病理结果显示心肌组织受损程度明显减轻(P<0.05),且明显降低心肌Bax蛋白表达(P<0.01),对Bcl-2蛋白表达无明显影响,但能显著增加Bcl-2/Bax的比率(P<0.05)。 结论 :FYLS对I/R具有保护作用,其机制可能与减轻钙超载、下调Bax蛋白表达、增加Bcl-2/Bax的比率有关。     

顶空气相色谱法测定鸡肝散7种挥发油成分的含量

 目的建立同时测定鸡肝散(Elsholtzia blanda)中7种挥发油成分含量的方法,并初步比较不同提取方法对挥发油组成的影响。方法采用顶空毛细管气相色谱法,INNOWAX型毛细管柱(0.53 mm×30 m,5μm),氢离子化检测器(FID),以乙酸乙酯为溶剂,采用程序升温法:初始温度60℃,以30℃·min^-1升至90℃,再以5℃·min^-1升至180℃;进样口温度200℃,检测器温度240℃。结果7种成分能较好分离,其线性范围分别为α-蒎烯33～330 mg·L^-1(r=0.9999);β-蒎烯32～320 mg·L^-1(r=0.9998);1,8-桉叶醚111～1110mg·L^-1(r=0.9998);樟脑238～2380 mg·L^-1(r=0.9996);芳樟醇140～1400 mg·L^-1(r=0.9997);乙酸龙脑酯65～650 mg·L^-1(r=0.9995);龙脑53～530 mg·L^-1(r=0.9995)。该法的平均回收率分别为96.6%,97.0%,97.8%,99.9%,96.5%,97.4%,97.1%。结论该法简便、准确、灵敏,可为该药材的质量控制和进一步研究开发提供科学依据。     

影响胃蛋白酶和胰蛋白酶纤溶活性因素初探及其纤溶活性失活研究

目的通过探讨影响胃蛋白酶和胰蛋白酶纤溶活性的因素及其纤溶活性失活方法,排除胃蛋白酶和胰蛋白酶对中药鼠妇Armadillidium vulgare活性粗蛋白纤溶活性检测的干扰,以在鼠妇活性粗蛋白酶解过程,获取相对分子质量更小、效价更高的蛋白质或多肽。方法采用纤溶蛋白平板法分别研究pH值、温度、金属离子、酶抑制剂和表面活性剂对胃蛋白酶和胰蛋白酶纤溶活性的影响,以获取较佳的酶失活工艺,并研究较佳酶失活工艺对尿激酶、蚓激酶、鼠妇纤溶酶纤溶活性的影响。结果 pH值、温度、金属离子、酶抑制剂和表面活性剂均可对胃蛋白酶和胰蛋白酶纤溶活性产生影响,其中胃蛋白酶的最优失活方案为pH 6.0~8.0;胰蛋白酶的最优失活方案为质量浓度25 mg/mL TLCK和浓度1 mmol/L EDTA的混合制剂。结论研究所获取的较佳酶失活工艺,可用于以纤维蛋白平板法检测胃蛋白酶、胰蛋白酶降解产物的纤溶活性,操作简单,重复性好,稳定性好。     

氯沙坦钾复方制剂毛细管区带电泳色谱分析

 目的　寻找准确而简便地测定氯沙坦钾复方制剂中氢氯噻嗪、氯沙坦钾两种成分含量的方法。方法　采用毛细管区带电泳色谱(CZE),以0.02mol·L^-1磷酸-硼酸盐缓冲液(pH=7.5),分离电压18kV(运行电流35～40μA)。结果　两种成分在6min内达到完全基线分离,保留时间在4～6min之间,氢氯噻嗪、氯沙坦钾线性范围分别为76～570mg·L^-1和79～590mg·L^-1,浓度与峰面积呈良好的线性关系。选用乙基巴比妥酸为内标,可对氯沙坦钾复方制剂中氢氯噻嗪、氯沙坦钾两种成分分别进行含量测定,批内RSD均小于1%(n=9),两种成分的加样回收率不低于97%,RSD均小于3%(n=9)。结论　本实验结果表明,用毛细管区带电泳(CZE)法进行氯沙坦钾复方制剂中氢氯噻嗪、氯沙坦钾两种成分的含量测定,方法准确、可靠,简便易行。     

沙蚕纤溶酶的一种纯化方法

目的 从双齿围沙蚕体内提取并纯化一种新的纤溶酶。方法 应用硫酸铵沉淀、透析、凝胶柱层析（Sephadex G-100）以及电泳等生化手段对沙蚕纤溶酶进行分离纯化。用平板法测定它降解纤维蛋白的活性。结果 得到纯的沙蚕纤溶酶,测出其等电点为4．5左右,由两条边组成,其相对分子量分别为33000u和14400u。结论 该酶为首次从沙蚕中发现的一种新的纤溶酶。     

豆豉AprE9912D血栓溶解酶的制备与活性评价

目的 通过基因工程技术生产的豆豉血栓溶解酶,研究其安全性及溶栓功效.方法 采用酪蛋白平板从豆豉中分离获得具有纤溶活性的候选菌株,利用基因工程技术将其AprE9912D基因在大肠杆菌BL21(DE3)-pDEl中过表达AprE9912D重组蛋白.经过Ni-NTA纯化柱和透析纯化AprE9912D重组蛋白,体外采用纤维蛋白...     

豆豉溶栓激酶DCK的体内溶栓抗栓作用

目的:探讨贵州豆豉溶栓激酶DCK(DCK酶)的体内溶栓抗栓作用及其相关机制。方法:雄性昆明小鼠随机分为模型组,尿激酶(150 U·g~(-1))组,DCK酶低、中、高剂(150,300,450 U·g~(-1))组,ip 7 d,每日1次,第7天给药30 min后,各组小鼠ip 0.8%角叉菜胶,继续每天给药,观察尾部血栓的变化,于24,36 h游标卡尺测量鼠尾长度和血栓长度,计算血栓形成率和血栓形成相对长度。Wistar大鼠随机分为模型组,尿激酶(100 U·g~(-1))组,DCK酶低、中、高剂量(100,200,300 U·g~(-1))组,ip 10d,每日1次。第10天给药30 min后,水合氯醛溶液麻醉大鼠,分离右颈总动脉、左颈外静脉,构建右颈总动脉-左颈外静脉旁路循环,比较该旁路循环异物所致血栓湿重。新西兰大耳白兔随机分为模型组,尿激酶(38 U·g~(-1))组,DCK酶低、中、高剂量(38,76,114 U·g~(-1))组,耳缘静脉注射给药,给药1 h后耳缘静脉采血,进行凝血酶原时间(PT),活化部分凝血活酶时间(APTT),凝血酶时间(TT),纤维蛋白原(FIB),优球蛋白溶解时间(ELT),纤维蛋白(原)降解产物(FDP)的检测。结果:与模型组比较,DCK酶组在24,36 h各组小鼠鼠尾血栓形成相对长度均明显减少(P0.05,P0.01);DCK酶高、中剂量组的旁路循环血栓湿重明显减少(P0.05,P0.01)。DCK酶高、中剂量组的PT,APTT,TT时间明显延长(P0.05,P0.01),DCK酶高、中剂量组FIB明显减少(P0.05,P0.01),DCK酶高、中剂量组ELT的水平明显降低(P0.05),DCK酶组FDP含量均增加,中剂量组明显增加(P0.05)。结论:DCK酶具有良好的体内溶栓抗栓作用。     

21种不同产地中药淡豆豉中5种活性成分的对比

目的:对不同产地市售淡豆豉中总异黄酮、大豆皂苷、多糖、总蛋白、纤溶酶的含量进行测定,并进行聚类分析,为淡豆豉的工艺研究和质量评价应用提供科学依据。方法:采用紫外分光光度法,以染料木素为对照品,测定总异黄酮的含量,测定波长为260 nm,染料木素在0.996 4~14.946 mg·L-1呈良好线性关系;采用香草醛-高氯酸比色法,以齐墩果酸为对照品,测定大豆皂苷的含量,测定波长520 nm,齐墩果酸在2.2~11 mg·L-1呈良好线性关系;采用苯酚-硫酸比色法,以葡糖糖为对照品,测定多糖的含量,测定波长490 nm,葡糖糖在0.002 5~0.02 g·L-1呈良好线性关系;采用考马斯亮蓝法测定总蛋白的含量,测定波长595 nm;采用纤维蛋白平板法测定豆豉纤溶酶活力,以尿激酶为对照品,尿激酶在100~10 000 U·mL-1呈良好线性关系。使用SPSS 16.0以淡豆豉中5种有效成分的含量为参数组合对市售淡豆豉进行聚类分析。结果:各地市售淡豆豉主要活性成分含量有明显差异,这21种淡豆豉中总异黄酮的质量分数最低为0.518 mg·g-1,最高为4.511 mg·g-1;大豆皂苷的质量分数最低为0.873 mg·g-1,最高为8.623 mg·g-1;多糖的质量分数最低为0.28%,最高为1.81%;总蛋白的质量分数最低为4.675%,最高为36.133%;7号样品中淡豆豉无纤溶酶活性,其他有活性的产品,纤溶酶活性最低为15.49 U·g-1,活性最高为1 752.08 U·g-1。聚类分析的树状图结果与地理位置有明显的对应关系。结论:21批不同产地淡豆豉中活性成分存在明显差异。     

毛细管区带电泳法对马钱子药材中生物碱质量控制的研究

 目的建立马钱子药材中生物碱质量控制的方法。方法利用毛细管区带电泳法,以来涂层石英毛细管(75μm×50 cm)为分离通道,80mmol·L^-1Tris-H₃BO₃(醋酸调pH至4.0)为运行缓冲溶液,分离电压23 kV,进样3.45×10³ Pa,10s；柱温25℃；DAD检测波长214 nm。结果士的宁和马钱子碱的浓度均在1.0～120 mg·L^-1内呈良好线性关系,r分别为0.9999和0.9997；加样回收率分别为96.57%(RSD=1.73%)和102.04%(RSD=1.62%)；最低检测限分别为0.490 mg·L^-1和0.957 mg·L^-1。结论实验证明利用毛细管区带电泳法,马钱子药材中士的宁和马钱子碱能够与其他组分得到很好的分离,方法简单、快速,可作为中药材中有效成分质量控制的方法。