椰毒假单胞菌部分16SrRNA序列测定及其系统发育地位

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增了椰毒假单胞菌代表菌株Ｔ７７０７的部分１６ＳｒＲＮＡ基因片段，将扩增片段克隆到Ｍ１３ｍｐ１９噬菌体，扩增后提取其单链ＤＮＡ，用ＤＮＡ测序仪进行测序。所得结果与已发表的其它已知假单胞菌的相应序列进行比较，计算出各菌之间的差异，并据此进行聚类。结果表明椰毒假单胞菌在系统发育上与Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属的成员关系密切，而与其它假单胞菌种的关系很远。这表明，椰毒假单胞菌应为Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属的一个种。     

铜绿假单胞菌XN-1随机重组子文库的构建及其在疫苗抗原筛选中的应用研究

目的构建铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)XN-1的全基因组文库,筛选铜绿假单胞菌新的疫苗候选抗原。方法提取我国分离的临床PA XN-1菌株全基因组,Sau3AⅠ酶切成随机片段后经连接至Bam HⅠ酶切后的pMal-c5x载体,转化至X-blue获得随机重组子。随机重组子经IPTG诱导后使用溶菌酶裂解,收集含有融合的麦芽糖结合蛋白(MBP)的随机重组子的裂解上清,制成含有PA全基因组的蛋白随机文库。通过ELISA方法分别检测单个随机文库蛋白的免疫反应性。将经典的PA强反应抗原PcrV做为参照,分别计算单个随机抗原的相对反应强度并进行比较。提取反应较强的重组子的质粒,测定DNA序列后进行翻译和比对,得到整个强反应性抗原的氨基酸信息。结果成功构建PA XN-1的全基因组文库,筛选到强反应性抗原13个,其中4个抗原的反应强度超过PcrV,分别为Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D、Phosphoenolpyruvate-protein phosphotransferase(PtsP)、Phosphate-starvation-inducible E和Very short patch repair endonuclease。结论基于高效表达系统的PA全基因组文库构建成功,可用于PA及其它病原的疫苗候选抗原的筛选研究。     

铜绿假单胞菌胶体金免疫层析法的研制和应用

为建立一种简单、快速、准确的铜绿假单胞菌检测方法,结合抗重组铜绿假单胞菌外膜蛋白单克隆抗体（mAb）、胶体金标记技术,采用双抗体夹心法,建立了检测铜绿假单胞菌的胶体金免疫层析法,并对该方法的特异性、灵敏度和稳定性进行了评价,对临床痰标本进行了检测。结果显示,该胶体金免疫层析法能在3～15min内完成检测,方法的特异性高、稳定性强,检测灵敏度能达到105CFU/mL。与传统细菌培养方法相比,胶体金免疫层析法的相对灵敏度和特异性分别是80%和90.6%,两种方法的总符合率为86%。结论：利用抗铜绿假单胞菌单克隆抗体建立的胶体金免疫层析法,适合现场快速、特异检测铜绿假单胞菌。     

铜绿假单胞菌外毒素A的抗原性及其与辅助细胞？…

目的 研究铜绿假单胞菌外毒素Ａ（ＰＥ）的某些抗原性及其与辅助细胞的关系。方法 用ＭＴＴ法观察ＰＥ在有无辅助细胞参与条件下对鼠脾淋巴细胞的刺激作用并用鼠细胞毒性Ｔ细胞株ＣＴＬＬ进行证实。结果 ＰＥ０．０１～１００ｎｇ／ｍｌ浓度范围能刺激鼠脾淋巴细胞增殖，ＰＥ的丝裂原作用无需粘附细胞的辅助，但粘附细胞及其粘附细胞的ＰＥ刺激上清能协同ＰＥ对鼠脾淋巴细胞的刺激作用。ＰＥ在丝裂原作用范围内能刺激ＣＴＬＬ细胞     

抗铜绿假单胞菌 PcrV 蛋白单克隆抗体的筛选和功能验证

目的:获得能应用于治疗铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)感染的抗PcrV 蛋白全人源单克隆抗体。方法:以铜绿假单胞菌PAO1 基因组为模板,PCR 扩增PcrV 基因并构建重组表达载体pET-28a-PcrV,转化至大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG 诱导表达,并通过镍离子螯合树脂亲和纯化PcrV 蛋白。利用噬菌体抗体库筛选PcrV 结合的噬菌体克隆并进行序列测定,以测序正确的阳性克隆质粒为模板,PCR 扩增该抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因并构建重组表达载体转染至293E 细胞,收取培养细胞上清,并利用Protein A 树脂亲和纯化抗体。利用ELISA 实验检测抗体亲和力,并通过小鼠铜绿假单胞菌感染肺炎模型验证抗体活性。结果:获得重组蛋白PcrV,通过噬菌体展示技术筛选并制备了一株全人源抗PcrV单克隆抗体YG5。ELISA 实验结果表明YG5 抗体具有较高的亲和力(EC50 =61 ng/ ml),进一步的实验结果表明,YG5 能有效抵抗铜绿假单胞菌感染,降低小鼠的死亡率。结论:靶向铜绿假单胞菌PcrV 蛋白的全人源单克隆抗体YG5 能够有效地抑制铜绿假单胞菌致病性,降低其对机体感染,有可能成为抗铜绿假单胞菌感染的治疗性抗体。     

铜绿假单胞菌的GM-PFGE分型的研究

目的研究全基因组ＤＮＡ稀有位点限制性内切酶酶切脉冲电场电泳图谱（ＧＭ－ＰＦＧＥ）在铜绿假单胞菌基因分型中的应用,并与表型分型比较。方法对１个月内来自两个医院的病人及环境的２０株铜绿假单胞菌进行了ＧＭ－ＰＦＧＥ图谱分析,同时进行３０种生化反应的统计分型、２３种药物的敏感性分型、胞外脂多糖的血清抗原分型;并利用数值分类软件包进行相关性比较研究。结果临床致病铜绿假单胞菌的生化表型基本稳定,但其药物抗性的获得与丢失较为明显。血清型、生化性状及药物抗性之间无明显对应关系。当２菌株ＧＭ－ＰＦＧＥ图谱条带相似系数大于８０％时,为同一菌株的不同克隆亚型,当相似系数在２５％～７０％之间时,则为不同菌株。结论ＧＭ－ＰＦＧＥ分析可显示染色体结构的区域多型性,其重复性好,分辨率明显高于表型分型,结果可靠,必将成为铜绿假单胞菌或其它病原微生物分子流行病学研究的有力工具。     

耐环丙沙星铜绿假单胞菌的耐药性分析

目的 了解本地区铜绿假单胞菌的耐药情况及超广谱β-内酰酶（ESBLS）的检出率，以指导临床合理用药。方法对90株临床分离菌用纸片扩散法（K-B法）进行药物敏感性试验；纸片扩散表型确证法进行ESBLS检侧。结果本地区铜绿假单胞菌对氨苄西林、萘啶酸、哌拉西林、头胞噻肟、头胞吡肟、阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星、司帕沙星、加替沙星、氨曲南、头胞他啶、亚胺培南、头胞呋辛的耐药率分别是90．0％、83．3％、77．2％、29．4％、5％、8．9％、65．0％、60．0％、62．2％、50．0％、7．2％、18．3％、0、47．2％；ESBLS的检出率为24．4％。结论本地区铜绿假单胞菌耐药情况不容乐观且多重耐药菌株较多；氟喹诺酮药物之间交叉耐药明显；产ESBLS率较高。     

耐喹诺酮类铜绿假单胞菌的耐药机制研究

目的探讨广州地区铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物的耐药机制。方法对喹诺酮耐药株的gyrA和parC基因进行限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）,并对其中的高水平耐药株gyrB和parE基因进行测序;用琼脂稀释法测定加入碳酰氰基-对-氯苯腙（CCCP）前后环丙沙星的最小抑菌浓度（MIC）;同时用SDS-PAGE对高水平耐药株的外膜蛋白进行电泳分析。结果有72.7%（72/99）的菌株发生gyrA突变,主要为Thr-83-Ile;25.3%（25/99）的菌株发生parC突变,主要为Ser-87-Leu,且均是gyrA和parC双基因突变;gyrB和parE突变较少见。53.3%（53/99）的菌株的MIC可被CCCP逆转,其MIC能明显降低;7%（7/10）的高水平耐药株的外膜蛋白在43～67kDa间条带增多,其蛋白含量有差异。结论抗菌药物作用靶位的改变和外排泵机制是本地区铜绿假单胞菌对喹诺酮类耐药的重要机制。     

日本血吸虫循环抗原与抗独特型抗体的检测及其比较

以日本血吸虫肠相关ＭｃＡｂ－Ｇ３及单克隆抗独特型抗体ＮＰ３０致敏红细胞，建立ＲＩＨＡ诊断血吸虫病。结果是正常人、急、慢性及晚期血吸虫病人Ｇ３－ＲＩＨＡ阳性率分别为２．１７％、９８．７９％、８４．０％、３２．１４％；ＮＰ３０－ＲＩＨＡ阳性率各为１．４５％、９７．５８％、８１．３％、２８．５７％。７５例慢性感染人群中，两者与Ｋａｔｏ阳性符合率分别为８４．０％、８１．３％；而阴性符合率各是３１．５％、３７．０％轻、中、重感染度人群循环抗原／抗独特型抗体阳性率：Ｇ３－ＲＩＨＡ分别为８０．３３％、１００．０％、１００．０％；ＮＰ３０－ＲＩＨＡ为８０．３３％、８８．８９％、８０．０％，显示慢血病人血清中循环抗原及／或抗独特型抗体与ＥＰＧ无相关性。本文提示循环抗原、抗独特型抗体在免疫调变及／或免疫网络系统中呈竞争与抑制状态。     

鼠抗人Fas单克隆抗体的制备及鉴定

采用Ｊｕｒｋａｔ细胞Ｂａｌｂ／ｃ小鼠制备１株抗人ＦａｓｍＡｂ２Ａ１,它能特异性识别Ｊｕｒｋａｔ,Ｒａｊｉ,ＴＨＰ－１细胞膜表面５０ＫＤ左右的蛋白,并能与ＳｒＦａｓ标准蛋白反应,其识别的细胞膜蛋白与单抗特异性抗人Ｆａｓ ＰｃＡｂＮ－１８相一致。ｌｅｑ     

痢疾菌侵袭性质粒抗原（Ipa）及O抗原与侵入细胞能力的关系研究

采用痢疾菌Ｉｐａ＋Ｏａｇ－，ＩｐａＯａｇ＋及Ｉｐａ＋Ｏａｇ＋等三种不同的菌株分别进行了毒力及毒力相关表型实验。结果发现，Ｉｐａ＋ＯａＧ－株Ｓ１Ｒ１０１／ｐＨＳ４１０８与Ｉｐａ＋Ｏａｇ＋株ＢＳ１６９／ｐＨＳ４１０８都有侵入ＨｅＬａ细胞的能力，而Ｉｐａ－Ｏａｇ＋株Ｔ３２则无侵入ＨｅＬａ细胞的能力，只表达多肽ａ、ｅ、ｄ的菌株Ｓ１Ｒ１０２／ｐＪＭ５６亦不能侵入ＨｅＬａ细胞。从而证明，侵袭性质粒抗原（Ｉｐａ）对于细菌侵入ＨｅＬａ细胞则是足够的，其中多肽ｂ起关键性作用，而Ｏ抗原并不参与侵入过程或不成为其必要的前提条件。     

小鼠后肢跖部免疫法在抗包虫囊液抗原单克隆杂交瘤技术中的应用

在抗包虫囊液抗原（ＥｇＣＦＡｇ）单克隆抗体（ＭｃＡｂ）杂交瘤细胞技术中，采用改进的一次基础免疫法免疫淋巴细胞供体小鼠后肢跖部，９ｄ后剖取后肢引流淋巴结用于细胞融合。与常规体内免疫法相比，该法所需抗原少，免疫周期短，融合后抗体分泌细胞株多，抗体特异性强，操作简便，尤其适用于来源困难的抗原免疫，是ＭｃＡｂ融合技术中淋巴细胞供体免疫较好的方法之一。     

肾移植HLA配型影响因素的探讨

为了快速准确地配型肾移植受体的ＨＬＡ型别，对ＨＬＡ分型试验的影响因素进行了探讨，结果显示：采用玻璃珠脱纤维抗凝血标本，可以获得比肝素抗凝法更高纯度的淋巴细胞，并能大大地降低细胞悬液中血小板的污染，加样时采用软加法可避免相邻孔间反应的相互污染，ＨＬＡ抗体和补体相互间能弥补因为方效价下降而引起的试验敏感性降低，使用淋巴细胞分离液分离细胞时应根据不同的试剂生产厂家而区别对待细胞分离时的离心时间。     

IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDIES ON CARCINOEMBRYONIC ANTIGEN IN ADENOCARCINOMAS OF THE UTERUS

In order to distinguish endocervical adenocarcinoma from endometrial adenocarcinoma, an immunoperoxidase stain for carcinoembryonic antigen (CEA) was tried. All of 10 endocervical adenocarcinomas revealed CEA and an adenosquamous carcinoma in the uterine cervix also showed it, while a mesonephroid adenocarcinoma in the uterine cervix did not. The immunohistochemical reaction products for the antigen were not observed in the glandular structures of 20 endometrial adenocarcinomas, although CEA was detected in all foci of squamous epithelial metaplasia occurred within 7 endometrial adenocarcinomas. CEA was detected in the endocervical type of glandular epithelium within a special endometrial adenocarcinoma containing predominantly endocervical type glandular epithelium. The immunoperoxidase staining pattern for CEA in the endocervical adenocarcinoma was related to the degree of histological differentiation of tumors, as follows; in the well differentiated glandular structure CEA was located on the luminal surface, while it was detected in the whole cytoplasm of tumor cells within the moderately and poorly differentiated areas. In conclusion, the immunoperoxidase stain for CEA would be useful for estimating malignancy of glandular structures within the uterus, distinguishing endocervical adenocarcinoma from endometrial adenocarcinoma, and grading of histological differentiation of endocervical adenocarcinoma.     

乙酰胆碱对大鼠腹腔巨噬细胞内钙离子浓度和表面Ia抗原表达的影响

用Ｆｕｒａ－２作为荧光探针测定大鼠腹腔巨噬细胞（Ｍ）内钙离子浓度（［Ｃａ￣（２＋）］ｉ），ＡＰＡＡＰ桥联酶标法检测Ｍ表面Ｉａ抗原的表达。结果表明：５×１０￣（－６）ｍｏｌ／Ｌ的乙酞胆碱（Ａｃｈ）可使Ｍ［Ｃａ￣（２＋）］ｉ；明显上升，可促进Ｍ表面Ｉ－Ａ和Ｉ－Ｅ抗原的表达，而阿托品（１０￣（－５）ｍｏｌ／Ｌ）可阻断Ａｃｈ升高［Ｃａ￣（２＋）］ｉ的作用。阿托品、三氟啦嚎（ＴＦＰ，５０μｍｏｌ／Ｌ）、ＥＧＴＡ（６ｍｍｏｌ／Ｌ）均可阻断Ｍ促进ＭＩａ抗原表达的作用，ｃＡＭＰ依赖性蛋白激酶抑制剂（ＰＫＩ，２５μｇ／ｍｌ）对Ａｃｈ促进ＭＩａ抗原表达的作用无影响。     

IMMUNOELECTRON MICROSCOPIC STUDY OF THYROID MICROSOMAL ANTIGEN

Using human IgG F(ab')₂ prepared from pooled sera containing a high titer of thyroid microsomal antibody (TMAb), localization of thyroid microsomal antigen (TMAg) was studied electron microscopically in dissociated follicular cells obtained from 25 thyroids of patients with Basedow's disease. Twenty out of the 25 cases were positive for serum-TMAb. In 18 of these cases, the reaction product for spontaneous membrane-bound IgG was demonstrated only on the apical plasma membrane of a small number of follicular cells, but was not observed anywhere in 5 cases without serum-TMAb. After masking the spontaneous membrane-bound IgG with anti-human IgG-goat IgG Fab, deposits of the reaction product disappeared or were significantly decreased. After the masking, all cases incubated in the above-mentioned TMAb-positive IgG F(ab')₂ showed an intense reaction product located linearly on the apical plasma membrane of a large number of follicular cells, but not on the lateral and basal plasma membrane and in the cytoplasm. On the other hand, after the masking, the control group incubated in human IgG F(ab')₂ from a normal subject revealed the same result as that in the group with masked spontaneous membrane-bound IgG. These findings indicate that TMAg is located only on the apical plasma membrane of follicular cells. ACTA PATHOL JPN 38 : 1141 -1148, 1988.     

普氏立克次体120kDa表面蛋白N端和C端重组蛋白的抗原特异性研究

用免疫印迹和酶联免疫吸附试验分析普氏立克次体N端和C端重组蛋白,发现2个重组蛋白除与普氏立克次体免疫血清发生特异性反应外,并与立氏立克次体免疫血清发生反应,这2种立克次体也被这2个重组蛋白免疫血清所识别,提示这2个重组蛋白含有普氏和立氏立克次体的共同抗原决定簇。