PCSK9抑制剂在脂代谢中的研究进展

前蛋白转换酶枯草溶菌素9（PCSK9）是参与调节低密度脂蛋白受体（LDLR）表达，通过促进溶酶体对LDLR的消化作用降低了细胞表面LDLR的密度，进而导致血浆低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）升高。仅在开始研究10年间，PCSK9抑制剂就被全球多个药监局获批上市，2015年美国FDA批准evolocumab和alirocumab用于临床。目前研发的干预PCSK9的方式包括：单克隆抗体、小干扰（siRNA）、反义寡核苷酸、疫苗接种等。但PCSK9抑制剂的临床使用尚未普及。     

S1PR2在非酒精性脂肪性肝炎中的作用初探

目的：探讨1?磷酸?鞘氨醇受体2（sphingosine?1?phosphate receptor 2,S1PR2）、前蛋白转化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9）对非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis,NASH）肝脏损伤可能的调控机制。方法：将12只C57BL/6J小鼠随机分为对照组和实验组,对照组给予普通饮食,实验组给予蛋氨酸?胆碱缺乏饮食（methio?nine choline deficiency diet,MCD）,MCD 6周建立NASH模型。6周末ELISA检测血清和肝脏生化指标丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）、谷氨酰转移酶（glutamyl transferase,GGT）及炎症因子肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha,TNF?α）、白细胞介素6（interleukin?6,IL?6）、γ?干扰素（interferon?γ,IFN?γ）的水平;HE 染色、油红O染色和天狼星红染色分别观察肝脏炎症、脂质沉积和纤维化情况。小鼠原代肝细胞和HepG2细胞分别予棕榈酸和/或JTE?013（S1PR2 特异性抑制剂）处理,油红O染色观察肝细胞内脂质沉积情况,蛋白免疫印迹实验检测S1PR2、PCSK9和低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein cholesterol receptor,LDLR）的蛋白表达。构建S1PR2干扰、过表达质粒,分别转染HepG2细胞,进行转录组测序寻找 S1PR2 潜在关联基因,并在NASH造模小鼠中检测筛选出的基因的表达情况。结果：喂养6周后实验组小鼠较对照组肝组织S1PR2表达减少、PCSK9表达增加;使用JTE?013可加重小鼠肝原代细胞和HepG2细胞内脂质沉积,使ERK磷酸化增加,PCSK9表达升高、LDLR降低;S1PR2干扰、过表达质粒分别转染的HepG2细胞中,共有343种基因发生改变,其中早期生长反应蛋白1（early growth response protein 1,Egr1）在S1PR2过表达时增加、干扰时降低,并在NASH模型小鼠中表达减少。结论：S1PR2参与NASH的脂质沉积和炎症损伤过程,这可能与炎症状态下S1PR2被抑制后促进PCSK9表达,降低LDLR表达有关。     

降胆固醇药物新靶标前蛋白转化酶枯草溶菌素9的研究进展

他汀类药物主要用于降低血低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)以及预防心血管疾病,但其临床疗效和机体的耐受性尚存在不稳定性.人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)属于前蛋白转化酶家族,主要由肝脏产生并分泌人血,可促进肝脏中低密度脂蛋白受体(LDLR)的降解,从而参与调控血LDL-C水平.人群中PCSK9的功能获得型或缺失型基因突变与血LDL-C含量、心血管疾病患病率密切相关.可通过负反馈机制上调PCSK9,促进LDLR的降解,从而降低他汀类药物的疗效.因此,抑制PCSK9活性可望成为治疗高胆固醇血症的一种新的有效方法.本文主要综述PCSK9调节胆固醇代谢及其临床应用的研究进展.     

TNF-α和IFN-γ对Hep-2喉癌细胞MMPs表达的调节作用

目的:研究喉癌Hep-2细胞系中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2和MT1-MMP的表达及TNF-α和IFN-γ对MMPs表达的调节作用.方法:分别在细胞生长的不同时期收集细胞,采用半定量RT-PCR方法,分析Hep-2细胞MMP-2、MMP-9、MT1-MMP和TIMP-1、TIMP-2 mRNA的表达水平.结果:细胞接种后24 hMMP-2和MMP-9的mRNA水平最高.Hep-2细胞在第2、3天MT1-MMP mRNA的表达水平最高,细胞表达相对恒定的TIMP-1而细胞内TIMP-2 mRNA的表达水平比TIMP-1高2倍.TNF-α可增强Hep-2细胞的MMP-2 mRNA的表达, IFN-γ可抑制MMP-2的表达. 两种因子联合应用时其作用可相互抵消.MT-MMP和TIMP-1对TNF-α和IFN-γ的调节不敏感.TIMP-2 mRNA的水平可被TNF-α抑制1倍,而IFN-γ能够增强TIMP-2 mRNA的水平.结论:细胞因子对MMPs的转录有调节作用,IFN-γ能够降低MMP-2、MMP-9的表达,可成为一种很有价值的喉癌辅助治疗药物.     

脂多糖上调小鼠肝脏PCSK9升高血浆低密度脂蛋白胆固醇

目的:研究感染和炎症时前蛋白转化酶枯草溶菌素9 ( proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)在调节血浆低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)代谢中的作用及其可能的分子机制?方法:用全自动生化仪监测小鼠血浆总胆固醇?高密度脂蛋白胆固醇?甘油三酯?磷脂以及谷氨酸氨基转移酶含量?同时,用快速液相色谱(fast protein liquid chromatography,FPLC)分析混合的小鼠血浆?血浆淀粉样蛋白A(serum amyloid A,SAA)浓度用酶联免疫吸附法测定?用定量PCR法检测肝脏组织的PCSK9?LDL受体等脂代谢相关基因mRNA丰度,并用Western blot 分析肝组织中LDL受体表达变化?结果:研究发现低剂量脂多糖(liposacaridica,LPS)注射24 h后血浆谷氨酸氨基转移酶无明显变化,小鼠血浆LDL-C增高43.02%,高密度脂蛋白胆固醇增高30.09%?甘油三酯增高27.21%,磷脂增高25.50%?LPS注射组动物的血浆SAA明显增多至(1 271.05 ± 94.13) ng/ml,增多的SAA主要与高密度脂蛋白和低密度脂蛋白结合?LPS处理诱导肝脏PCSK9基因表达上调,抑制肝脏LDL受体的蛋白表达?结论:研究表明LPS引起肝细胞中PCSK9上调,LDL受体蛋白表达受抑制,同时小鼠血浆LDL-C迅速增多,提示PCSK9抑制LDL受体通路可能通过影响血浆脂蛋白代谢在炎症导致的宿主反应中起重要作用?     

膜型基质金属蛋白酶-1表达对肝细胞癌血管生成拟态形成的影响

目的 研究膜型基质金属蛋白酶-1（MT1-MMP）表达对肝细胞癌血管生成拟态（VM）形成的影响及机制。方法 构建靶向MT1-MMP的RNA干扰质粒载体,转染肝癌细胞系Bel7402,实时定量PCR及Western blot检测干扰效果;在体外三维细胞培养体系中观察其对VM管状结构形成的影响;Transell侵袭小室实验检测细胞侵袭能力。结果 靶向抑制MT1-MMP的表达下调肿瘤细胞侵袭能力,影响肝癌细胞在三维细胞培养体系中VM管状结构的形成。结论 MT1-MMP表达影响肝细胞癌VM的形成,可能成为肝细胞癌抗血管生成治疗的新靶点。     

MT1-MMP在病毒性心肌炎小鼠中的表达及三七总皂甙的干预作用

目的观察膜型基质金属蛋白酶-1（MT1-MMP）在病毒性心肌炎小鼠中的表达及意义。方法选用近交系4~6周龄雄性BALB/C小鼠,采用随机数字表法分为3组：空白对照组、心肌炎组、治疗组。于病毒接种后第8、15、21天分别采血后处死小鼠并留取心脏标本。分别采用RT-PCR法及免疫组化法检测心肌MT1-MMP的mRNA及蛋白表达,光镜观察心肌组织病理改变。结果心肌炎组和治疗组各时间点心肌细胞MT1-MMP的mRNA含量明显高于空白对照组（P＜0.01）,治疗组在第15、21天明显低于心肌炎组（P＜0.05或0.01）;心肌炎组和治疗组各时间点心肌细胞MT1-MMP免疫组化染色呈强阳性表达,空白对照组呈弱阳性。与心肌炎组比较,治疗组心肌细胞MT1-MMP表达在第15、21天降低,差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）。结论MT1-MMP可能参与了病毒性心肌炎小鼠的发病,中药三七总皂甙可能通过降低MT1-MMP的表达起治疗作用。     

膜型基质金属蛋白酶-1增强乳腺癌细胞系MCF-7的恶性表型

目的：探讨膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)蛋白酶-1表达对人乳腺癌细胞系MCF-7细胞生物学行为的影响及MT1-MMP催化亚单位在其中的作用。方法：应用脂质体转染法将携带MT1-MMP及其突变体基因MT1-MMP-E240A的pcDNA3.1载体分别稳定导入MCF-7细胞，通过超微结构观察及体外生长、迁移实验检测MCF-7细胞生物学行为的变化。结果：转染后的细胞经RT-PCR证实MT1-MMP mRNA的表达与对照组比较明显增强；免疫荧光细胞化学染色显示MT1-MMP蛋白呈强阳性表达，阳性颗粒分布于肿瘤细胞的胞浆和胞膜。透射电子显微镜观察显示pcDNA3.1组和MCF-7组细胞未见异常，而MT1-MMP组与MT1-MMP-E240A组细胞与对照组相比出现较多处于分裂期的细胞和瘤巨细胞，部分细胞胞浆内出现糖原池和髓样小体样溶酶体。细胞增殖周期、细胞生长曲线测定结果显示，MT1-MMP组与MT1-MMP-E240A组处于G₂M期的细胞比率明显高于对照组（P＜0.01），提示转染组细胞的增殖能力增强。转染组细胞在Matrigel和FN上的迁移能力较对照组明显增强（P＜0.05）。结论：MT1-MMP能够促进肿瘤细胞的增殖、迁移，在一定程度上增加其恶性表型；MT1-MMP催化亚单位在其中不发挥主要作用。     

家族性高胆固醇血症(FH)致病基因的研究进展

 家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemia,FH)的临床特征为血总胆固醇升高,尤其是低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-c)升高,沉积于组织,形成皮肤或肌腱黄色瘤,导致动脉粥样硬化甚至早发冠心病。FH的发病机制为LDL受体(LDL receptor,LDLR)或apoB基因突变引起LDL受体途径功能缺陷,主要为常染色体显性遗传疾患,具有基因剂量效应;部分患者为常染色体隐性遗传,机制为LDL受体衔接蛋白1(LDL receptor adaptor protein 1,LDLRAP1)失功能型突变,导致LDL内化活性降低。罕见的人类枯草溶菌素转化酶9 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)发生功能型突变也可引起严重的FH表型。PCSK9通过降解LDLR蛋白间接下调LDL受体途径,其失功能突变可致血浆LDL水平下降。因此PCSK9是目前降脂药物的研究热点。     

人MT1-MMP真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达及意义

目的：克隆人膜型基质金属蛋白酶1（MT1-MMP）基因,构建真核表达载体,并检测其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法：采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从人正常肝组织中扩增MT1-MMP全长cDNA,将之与pMD18-T载体连接,测序后将该片段亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1中。将构建好的pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体经酶切鉴定后,采用脂质体法转染入HepG2细胞,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株。应用RT-PCR检测转染前后该细胞株MT1-MMP mRNA表达水平。结果：①RT-PCR获得长度约为704 bp的目的片段,与预期片段相符;②将pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定,得到约5 400 bp和704 bp两个片段,测序结果证实所插入目的片段与GenBank中MT1-MMP cDNA序列匹配;③重组质粒转染株MT1-MMP mRNA表达水平（1.66±0.43）明显高于空质粒组（1.21±0.25）和对照组（1.19±0.18)(P<0.01）。结论：成功构建pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体,并在人肝癌细胞株HepG2中稳定表达。     

Lp(a)对THP-1源性巨噬细胞基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶抑制剂表达和活性的影响

目的通过研究脂蛋白a对巨噬细胞源性基质金属蛋白酶（MMPs）和基质金属蛋白酶内源性组织拟制剂（TIMPs）表达的调节作用，探讨脂蛋白a促动脉粥样硬化的机制。方法利用从新鲜混合血浆经超速离心和亲和层析纯化的脂蛋白a刺激人单核细胞白血病THp01细胞经豆蔻酰佛波醇乙酯诱导24h转化而成的巨噬细胞。孵育10h和36h后收集细胞裂解液和条件培养基分别进行MMPs／TIMPs mRNA和蛋白检测及明胶酶谱分析MMPs活性。结果免疫印迹结果显示脂蛋白a可使巨噬细胞培养基中MMP-1、MMP-2、MMp09、MT1-MMP水平明显上调．其中MMP-2和MT1-MMP的活性形式明显增加；而其抑制剂TIMP-1、TIMP-2水平则明显减少，以前者的剂量效应最为明显。明胶酶谱分析表明条件培养基中MMP-9活性增强。逆转录聚合酶链式反应结果显示，MMP-1、MMP-2、MMP-9mRNA水平随Lp（a）刺激增强而增加，TIMP-1 mRNA水平则梯度降低，而MT1-MMP、TIMP-2的mRNA水平未见明显改变。结论研究发现Lp（a）可促进巨噬细胞表达多种MMPs，同时抑制TIMPs的表达，由此所致的MMPs／TIMPs表达及活性失衡最终可致基质过度降解，在整体情况下则可能促进斑块进展成不稳定斑块并破裂。为阐明Lp（a）的促动脉粥样硬化机制提供了新的线索。     

RNA干扰抑制血管平滑肌细胞MT1-MMP基因表达的实验研究

目的 探讨膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)shRNA真核表达载体(pGenesil-1-MT1-MMP)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)MT1-MMP基因mRNA表达及蛋白表达的影响.方法 构建质粒表达载体pGenesil-1-MT1-MMP和pGenesil-1-HK;实验分为3组:空白对照组,阴性对照组(加入pGenesil-1-HK),RNA干扰(RNAi)组(加入pGenesil-1-MT1-MMP).用脂质体瞬时转染VSMC,48 h后通过荧光显微镜观察转染效果,流式细胞仪检测转染效率.于转染后72 h采用RT-PCR方法检测MT1-MMP mRNA表达水平,用Western blot方法检测MT1-MMP蛋白质表达水平.结果 瞬时转染VSMC 48 h后通过流式细胞仪检测转染效率高达85.5%,转染pGenesil-1-MT1-MMP质粒72 h后,RNAi组MT1-MMP mRNA及蛋白质水平明显下调(P<0.05).结论 靶向MT1-MMP的短发夹RNA质粒能够高效地转染入VSMC,并能有效下调MT1-MMP基因mRNA和蛋白的表达.     

PCSK9在脂代谢调节中作用的研究进展

血清中低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)浓度与冠心病的发生密切相关,而LDL-C主要是通过肝细胞表面的LDL受体(LDL receptor,LDLR)清除。前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin kexin type 9,PCSK9)可结合肝细胞表面LDLR并与其共同内吞入内体,介导LDLR进入溶酶体使其降解,从而参与血胆固醇的调节,在维持脂代谢稳态中发挥重要作用。目前对PCSK9的研究已取得一定的进展,但其发挥作用的确切机制还不是很清楚,在本文中作者就PCSK9在脂代谢调节中的作用以及其发挥作用的分子机制作一综述。     

骨形成蛋白-2对肺癌A549细胞膜型基质金属蛋白酶-1表达的影响

目的:探讨骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)对人肺癌A549细胞膜型基质金属蛋白酶-1(membrane type 1-matrix metalloproteinase,MT1-MMP)表达的影响.方法:Western杂交检测MT1-MMP蛋白质表达.采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)检测细胞培养液中活性基质金属蛋白晦-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)的浓度.结果:BMP-2可促进A549细胞MT1-MMP蛋白质表达,并呈剂量和时间依赖关系.ELISA进一步显示BMP-2可增加A549细胞培养液中活性型MMP-2的含量.结论:BMP-2可促进A549细胞MT1-MMP的表达及MMP-2的激活.肺癌组织中BMP-2表达的增加可通过促进肺癌细胞MT1-MMP表达及MMP-2激活而促进肺癌细胞的侵袭转移,此可能为肺癌侵袭转移的另一重要机制.     

RNAi沉默Furin基因对人宫颈癌HeLa细胞增殖和转移的影响

目的研究Furin基因沉默对宫颈癌HeLa细胞株生长转移的影响。方法脂质体法将质粒Furin siRNA转染人宫颈癌HeLa细胞。MTT法检测细胞的增殖情况,Boyden细胞迁移和侵袭实验观察HeLa细胞的迁移和侵袭能力。Western blot检测Furin及产物MT1-MMP蛋白量的变化,ELISA法检测细胞上清中MMP2的浓度。结果细胞增殖实验中Furin siRNA处理后48h的HeLa细胞与空质粒转染组相比体外生长抑制38.6%,差异有统计学意义(P<0.01);细胞迁移和侵袭实验中,Furin siRNA处理后,HeLa细胞穿过滤膜和基质胶的细胞数量均明显少于空质粒转染(P<0.05);它可显著降低MT1-MMP蛋白表达及MMP2的分泌。结论 Furin siRNA可有效抑制人宫颈癌HeLa细胞的生长及肿瘤细胞转移,机制可能与降低Furin产物MT1-MMP的表达及MMP2合成有关。     

清痰散结方对裸鼠MKN-45人胃癌组织中MT1-MMP表达的影响

目的观察消痰散结方对裸鼠胃癌组织中胃癌细胞MT1-MMP表达的影响,初步探讨消痰散结方抑制胃癌浸润转移的作用机理.方法建立裸鼠MKN-45人胃癌模型,采用免疫组化S-P法检测胃癌组织中MT1-MMP的表达.结果中药组胃癌组织中MT1-MMP表达水平明显低于生理盐水组和空白对照组.结论消痰散结方抑制胃癌细胞浸润转移的作用机理可能与其影响膜型金属蛋白酶的表达,减少对细胞外基质和基底膜的降解有关.     

罗勒多糖对乳腺癌细胞系MDA-MB-231侵袭的影响

目的 观察罗勒多糖对乳腺癌细胞系MDA-MB-231侵袭性的影响。方法 将体外培养的MDA-MB-231细胞分为实验组和对照组。实验组细胞用不同浓度罗勒多糖（100、300μg/mL）处理,对照组不加任何刺激因子。Transwell小室检测细胞侵袭能力,RT-PCR、Western blotting方法检测与侵袭相关的基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）和膜型基质金属蛋白酶1（MT1-MMP）的表达。结果 ①罗勒多糖可抑制MDA-MB-231细胞的侵袭力（P<0.01）;②罗勒多糖抑制MT1-MMP分子的mRNA表达（P<0.05）及下调其蛋白表达水平。③罗勒多糖对MMP-2及MMP-9分子的mRNA表达无影响。结论 罗勒多糖可通过下调MT1-MMP的表达抑制MDA-MB-231细胞的侵袭。     

基于CRISPR/Cas9技术PCSK9基因敲除小鼠模型的构建及表型验证

目的 基于CRISPR/Cas9技术构建前枯草杆菌蛋白原转换酶9(Preprotein convertase subtilisin/kexin type9,PCSK9)基因敲除小鼠模型并对其表型进行初步验证。方法 利用非同源末端连接(NHEJ)修复引入突变的方式,针对PCSK9基因靶序列设计单链向导RNA(sgRNA),将sgRNA和Cas9 mRNA显微注射到C57BL/6J小鼠受精卵,获得F0代敲除小鼠,通过繁育及基因型鉴定获得PCSK9基因敲除(PCSK9 KO)纯合子小鼠。采用PCR方法对PCSK9 KO小鼠进行基因鉴定,Western Blot检测肝组织PCSK9及低密度脂蛋白受体(LDL-R)蛋白的表达,同时检测心、脑、肾、脂肪组织中的PCSK9蛋白表达水平,q-PCR检测PCSK9的mRNA表达水平。采用酶法检测血清中总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)水平。结果 PCR产物凝胶电泳以及PCSK9蛋白及mRNA表达结果表明成功获得全身性PCSK9基因敲除小鼠,肝组织LDL-R(3.42±0.56)蛋白表达显著增高。与WT组相比,PCSK9小鼠血清TC(90.75±17.81...     

PCSK9与细胞凋亡

前蛋白转化酶枯草溶菌素转化酶9(proprotein convertase subtilisin/kexin 9,PCSK9)基因所编码的蛋白为神经凋亡调节转化酶-1(neural apoptosis-regulated convertase1,NARC-1),PCSK9主要在肝脏表达,它的主要作用是降解细胞表面的低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDLR),从而调节胆固醇代谢.另有研究表明,PCSK9还参与细胞的凋亡,影响神经系统的分化和发育,并与炎症过程及糖尿病有一定的相关性.神经细胞凋亡是神经退行性疾病的主要病理基础之一,研究PCSK9对细胞凋亡的作用及机制,对于防治神经退行性疾病等细胞凋亡所引起的疾病,具有十分重要的意义.本文对PCSK9与细胞凋亡之间的关系作一综述.     

胃癌细胞血管生成拟态的形态学及机制研究

目的:血管生成拟态(Vasculogenic mimicry,VM)是近年来发现的一种全新的肿瘤微循环模式.本研究通过体外三维培养的方式对胃癌细胞血管生成拟态进行形态学的研究,并探讨其可能的分子机制.方法:体外三维培养SGC-7901细胞,观察其是否可以形成血管生成拟态.免疫细胞化法检测参与血管生成拟态形成的胃癌细胞中MMP-2与MT1-MMP的表达水平.观察PI3K信号通路抑制剂对MMP-2和MT1-MMP的表达水平及对胃癌细胞血管生成拟态的影响.结果:胃癌细胞SGC-7901在体外三维培养条件下能够形成血管生成拟态.参与血管生成拟态的癌细胞中MMP-2与MT1-MMP高表达.PI3K信号通路抑制剂能够抑制MMP-2与MT1-MMP的表达,导致SGC-7901细胞血管生成拟态的能力明显降低.结论:体外三维培养时胃癌细胞SGC-7901具有形成血管生成拟态的能力.PI3K信号通路的抑制剂可以抑制胃癌血管生成拟态的形成,其机制之一可能是通过抑制MMP-2与MT1-MMP的表达.