恙虫病东方体0t56蛋白序列生物信息学分析

目的分析恙虫病东方体Ot56蛋白序列中的变异区和保守区,为恙虫病的蛋白与核酸诊断提供参考。方法从GenBank获取目标序列,用Lasergene、MEGA、Vector NTI suite、AthePort和NCBI Blast等工具进行分析。结果120条Ot56氨基酸序列的相似性为61.4%～100.0%,变异度为0.0～57.1;氨基酸的105～171、179～215、248～285、375～428和447～503区域为高变异区;膜外区200～400具有变异度高、抗原性强的特性。113条Ot56cDNA序列的相似性为41.8%～100.0%,变异度为0.0～116.1;其中303～481、562～667、756～842、1136～1243和1386～1568等5个区域属高变异区,而0～54、97～171、265～303、439～482、1015～1047和1477～1542为6个保守片段。结论恙虫病东方体Ot56蛋白具有5个高变异区,第200～400位氨基酸附近可能是株(型)特异性表位所在区域,其重组蛋白具有潜在的株(型)鉴定价值。根据cDNA6个保守片段设计引物,进行Ot56核酸检测可能在不同株(型)恙虫病东方体检测中具有较高的敏感性。     

新疆昌吉部分地区动物感染恙虫病东方体调查

目的了解新疆昌吉部分地区野生动物自然感染恙虫病东方体(Ot)的情况。方法采用多种方法捕鼠类,提取DNA,应用巢式PCR检测Ot-Sta56基因;阳性核苷酸序列片段测序,通过美国国家生物技术信息中心网站对基因序列进行BLAST比较分析。结果共捕获鼠432只、鸟类53只,仅在木垒县的鼠类、鸟类脾样本中检测到阳性片段,感染率分别为5.3%、11.1%;其他县市未检测到阳性。DNA序列分析表明,鼠类、鸟类阳性标本中扩增产物的核苷酸序列相同,碱基长度均为442bp。BLAST表明目的基因与Karp型的碱基序列同源性最高(98.5%),应属于Karp型。结论新疆昌吉地区木垒县啮齿类及鸟类动物中可能存在Ot感染。     

恙虫病合并慢性血吸虫病发病特点及恙虫病的分型

目的了解恙虫病合并血吸虫病的发病特点以及恙虫病的分型情况。方法收集病例资料并对其进行分析,采用外斐反应和间接免疫荧光方法（IFA）检测患者血清中的恙虫病东方体（Ot）IgG抗体,用巢式PCR法扩增患者血液中的Ot 56kD蛋白基因,并进行核酸序列测定和分析。结果患者有血吸虫肝改变、肝功能受损、脾肿大、焦痂。外斐氏反应检测OXk 1：40,IFA检测Ot IgG抗体Kato型1：160、Karp型1：40,PCR检测Ot 56kD蛋白基因片断阳性,其序列分析结果与PG9、P25、CM438等一些泰国Ot株同源性最高（98%）,与Ot Karp、Gilliam、Kawasaki、TA678、Kato株同源性均在95%以下。结论证实了该患者为恙虫病合并慢性血吸虫病,其Ot血清型可能为Kato＋Karp,遗传进化关系与一些泰国Ot株关系较为密切。     

恙虫病东方体Ot56蛋白序列生物信息学分析

目的分析恙虫病东方体Ot56蛋白序列中的变异区和保守区,为恙虫病的蛋白与核酸诊断提供参考。方法从Gen Bank获取目标序列,用Lasergene、MEGA、Vector NTI suite、Athe Port和NCBI Blast等工具进行分析。结果120条Ot56氨基酸序列的相似性为61.4％-100.0％,变异度为0.0～57．1;氨基酸的105-171、179～215、248～285、375～428和447～503区域为高变异区：膜外区200～400具有变异度高、抗原性强的特性。113条Ot56cDNA序列的相似性为41.8％～100.0％,变异度为0.0～116．1;其中303～481、562～667、756～842、1136～1243和1386～1568等5个区域属高变异区,而0～54、97～171、265～303、439～482、1015～1047和1477～1542为6个保守片段。结论恙虫病东方体Ot56蛋白具有5个高变异区,第200～400位氨基酸附近可能是株（型）特异性表位所在区域,其重组蛋白具有潜在的株（型）鉴定价值。根据cDNA6个保守片段设计引物,进行Ot56核酸检测可能在不同株（型）恙虫病东方体检测中具有较高的敏感性。     

承德市部分地区鼠传病原体的调查研究及序列分析

目的 了解承德市部分县区鼠中3种病原体(莫氏立克次体、恙虫病东方体、无形体)的自然感染状况,为承德地区鼠传疾病监测和防控提供参考依据。方法 采用粘鼠板和鼠笼在承德市6个县区捕获鼠(野鼠、家鼠),取鼠肝、脾、肾和肺脏器标本提取总DNA。通过实时荧光定量PCR进行莫氏立克次体和恙虫病东方体检测。利用巢氏PCR对标本进行无形体16S rRNA基因片段扩增,并对产物进行测序,应用生物软件Mega 6.0进行分析。结果 承德市6个县区共检测鼠脏器标本59份,检出无形体片段1份,阳性率为1.7%。未检测到莫氏立克次体和恙虫病东方体。1份PCR阳性产物测序成功,序列分析结果显示检出的序列为沃尔巴克体,与已知序列进行同源性比对,显示与序列号为AY335931株同源性高达88%。结论 初步认定承德市部分县区鼠中存在无形体科病原体,未发现莫氏立克次体和恙虫病东方体病原体。     

海南省发热患者血标本中恙虫病东方体groEL基因检测

目的了解海南省发热病人中感染恙虫病东方体的状况,并确定其基因分型。方法利用巢氏PCR方法,检测海南省各家医院2009~2010年送检的117份不明原因发热病人血标本的groEL基因的特异性片段,对所检测到的部分目的片段进行基因测序,从基因水平进一步证实阳性结果,并对序列同源性及进化分析。结果从117份发热病人血标本中发现有恙虫病东方体阳性15份,检出率为12.8%。取10份PCR阳性产物进行测序,核酸序列基本一致,彼此间仅存在3个核苷酸的差异,构建进化树进行聚类分析,结果示海南省恙虫病东方体序列与R.tsutsugamushi(M31887)恙虫病东方体在同一分支上,同源性高。结论海南省发热病人中存在恙虫病东方体感染的状况,应加强相关监测和防控措施,为给海南省制定恙虫病防治策略提供科学依据。     

新疆部分地区人群及动物感染恙虫病东方体调查

目的 调查新疆部分地区人群及动物感染恙虫病东方体(Ot)情况,并对媒介昆虫进行调查.方法 采用多种方法捕获可能感染Ot动物取脾,当地牧民静脉取血,从野鼠体表捕获恙螨,用试剂盒提取DNA,应用巢式PCR( nPCR)检测Ot-Sta56基因;接种昆明小白鼠进行Ot病原传代分离.结果 共采取人群血液2 430份,在6份血液中检测并分离到Ot;捕获动物13种5 783个(只),从5种啮齿动物(小家鼠、灰仓鼠、大砂土鼠、草原兔尾鼠、灰旱獭)、2种鸟类(麻雀、灰腹鹡鸰)的脾中检测并分离到Ot,从绵羊血液中检测到Ot.其他动物体内未检测到Ot.从野鼠体表分离恙螨5种,从博乐纤恙螨体内检测分离到Ot.基因序列分析表明,新疆地区存在恙虫病东方体的基因型以Karp型为主,可能存在Saitama型.结论 新疆地区存在人群及动物感染Ot,其基因型以Karp为主,可能存在Saitama型.     

恙虫病东方体Karp株核酸疫苗的构建及其免疫功能初步研究

目的构建恙虫病东方体Karp株Sta56抗原候选核酸疫苗并初步探讨其可能诱导的免疫功能。方法从连有恙虫病东方体Karp株编码56000u表膜蛋白基因开放读码框全长的T载体质粒pMD18/Sta56中双酶切出目的基因,定向亚克隆构建核酸疫苗质粒载体pVAX1-Sta56,转染Hela细胞,WesternBlot分析Sta56蛋白的表达及其免疫原性,转染L929细胞,接种恙虫病东方体,Giemsa染色细胞内恙虫病东方体数目比较,初步探讨pVAX1-Sta56可能诱导的细胞免疫现象。结果pVAX1-Sta56连有正确读码框架的Sta56全长基因。转染有pVAX1-Sta56的Hela细胞培养上清可检测到被兔抗恙虫病东方体Karp株抗血清识别的特异条带。转染有pVAX1-Sta56的L929细胞内恙虫病东方体数目显著少于转染pVAX1的L929细胞(P<0.01)。结论成功构建能够表达Sta56表膜蛋白抗原的核酸疫苗载体pVAX1-Sta56,并能诱导产生细胞免疫功能。     

105例恙虫病疑似患者巢式PCR检测结果分析

目的对泰州市靖江105例恙虫病疑似患者全血进行恙虫病东方体(Ot)检测,分析该地区恙虫病感染情况,为恙虫病预防控制提供科学依据。方法采集靖江市2013年10~11月的105例恙虫病疑似患者全血样品进行巢式PCR检测,并进行个案调查,记录结果,用描述性分析方法对检测结果及个案资料进行分析。结果 105例疑似患者中62例检出恙虫病东方体核酸阳性(阳性率59.0%)。发病人群年龄以50~80岁为主,占69.4%,实验室诊断病例中农民占82.3%,男女性别之比1:1.7。结论靖江市恙虫病发病率较高,应针对流行特征采取综合防制措施。     

南海某岛礁部队恙虫病防治经验和体会

我部驻地位于南海某群岛,地处热带,常年高温,相对湿度为80%,岛上植被茂盛,种类丰富,且无蛇类生存.独特自然条件为鼠类提供了良好的生存环境,岛上主要以黄胸鼠、褐家鼠、臭鼠多见,鼠害较为严重.鼠类是恙螨的宿主动物,是恙虫病的主要传播媒介,故我区是恙虫病自然疫源地之一.据统计,2000年前,岛内官兵恙虫病发病率为11.2%。     

恙虫病东方体56 kD表面抗原基因片段的克隆、表达及纯化抗原在恙虫病抗体检测中的应用

目的　构建恙虫病东方体 5 6 k D表面抗原基因 (sta5 6 )片段的重组表达质粒 ,在 E.coli中表达 Sta5 6重组抗原 ,重组抗原纯化后应用于间接法 EL ISA、金标快速免疫层析法检测恙虫病东方体特异性抗体。　方法　从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出 sta5 6基因的 ORF及其中长 10 5 3bp的大片段 ,用 TA克隆技术将此大片段克隆以该重组质粒为模板 ,扩增出不同长度的截短的 sta5 6片段 ,定向插入p PROEX HTb及 p ET30 a载体 ,转化大肠杆菌 DH 5α或BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,应用 SDS- PAGE观察重组蛋白表达情况 ,应用 Western blot分析重组抗原的活性 ;采用电洗脱、亲和层析等方法纯化重组蛋白。纯化的重组蛋白直接包被聚乙烯 96孔板 ,用于间接法 EL ISA检测恙虫病东方体 Ig G,或以胶体金标记重组抗原 ,运用金标快速免疫层析法检测恙虫病东方体 Ig M和 Ig G抗体。　结果　 (1)从恙虫病东方体 Karp株基因组中扩增出含 sta5 6基因的 ORF,并成功构建含 sta5 6 ORF大片段的重组质粒 TOPO- sta5 6。(2 )以截短的 sta5 6基因片段构建重组表达质粒 p HTb Ot95 7、p HTb O4 98、 p HTb Ot342和 p ETOt95 7、 p ETOt4 98、p ETOt342 ,各重组子均可在 E.coli中以融合蛋白的形式有效表达 ,SDS- PAGE显示各表示重组子     

恙虫病东方体Karp株47kDa蛋白成熟肽的克隆与表达

目的 :克隆表达恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi,Ot)Karp株 4 7kDa表面蛋白的成熟肽 ,探索其作为疫苗及诊断抗原的可能性。方法 :采用PCR方法 ,从 OtKarp株菌种基因组DNA中扩增出 4 7kDa成熟蛋白基因片段 ,将该片段克隆于原核表达载体pQE30 ,构建成重组质粒pQE30 4 7,转化大肠杆菌 (E coli) ,经IPTG诱导表达 ,SDS_PAGE和Western_blotting检测目的蛋白的表达。结果 :①获得长约 12 72bp的OtKarp株 4 7kDa外膜蛋白基因 ;②SDS_PAGE和免疫印迹显示该重组质粒转化的E coli有一相对分子量约为 4 3× 10 4 的独特蛋白带 ;③重组表达质粒序列分析结果显示pQE30 4 7中插入的基因片段的序列与已报告的OtKarp株 4 7kDa外膜蛋白基因序列基本一致 ,并与已知序列相同。结论 :获得了OtKarp 4 7kDa蛋白基因 ,并在E coli中实现了表达 ,表达的重组蛋白具有免疫反应性     

恙虫病东方体Karp株Sta56基因的克隆及序列比较的研究

目的 扩增恙虫病东方体Karp株主要表膜抗原Sta56的开放读码框(ORF)全长，并进行序列比较研究。方法 小鼠接种传代和体外细胞扩增分离恙虫病东方体Karp株，用PCR方法扩增恙虫病东方体Karp株Sta56基因，并采用TA克隆技术构建测序载体，对测序结果进行同源性分析比较。结果 扩增出Sta56的ORF全长，并TA克隆到测序载体pMD18—T vector，测序结果与Karp标准株的同源性为99．4％。结论 Sta56全长ORF克隆扩增成功，为进一步构建表达载体，进行Sta56蛋白表达研究提供基础。     

南澎列岛恙虫病立克次体血清流行病学调查研究

目的 为了解南澎列岛恙虫病立克次体疫源地情况。方法 本文利用免疫荧光法(IFA),检测了驻岛部队官兵和临时居住岛上的渔民等人群血清抗恙虫病立克次体IgG(抗—Rt.IgG)以及啮齿类动物和鸟畜类动物血清抗RtIgG。结果 岛上人群血清抗RtIgG阳性率为8.5％;鼠血清阳性率为64.8％;鸟畜类血清未检出阳性。被检出的抗恙虫病抗体血清型别有Karp型、Ka-to型和Gilliam型三型,以Karp型为主。生态调查表明,岛上啮齿动物种类以褐家鼠为主,其次是黄胸鼠、白腹鼠、社鼠和臭鼩鼱。褐家鼠的感染率最高,为63.3％。结论 南澎列岛驻岛人群和鼠类存在较高的恙虫病自然感染情况,褐家鼠为主要贮存宿主,在该地恙虫病传播中起重要作用。     

宁夏2004-2007年流行麻疹野病毒基因特征分析

目的了解宁夏2004-2007年流行的麻疹野病毒分离株基因特征,为控制、消除麻疹提供科学依据。方法用B95a、Vero/Slam细胞从疑似麻疹暴发和散发患者的标本中分离麻疹病毒,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),从分离到的麻疹病毒中扩增出核蛋白(nucleoprotein,N)基因C末端676个核苷酸片段,再对扩增产物进行核苷酸序列测定和分析,并以C末端456个核苷酸片段构建基因亲缘性关系树,进行核苷酸、氨基酸同源性分析。结果分离的36株麻疹野病毒全部为H1基因型H1a亚型。36株麻疹野病毒的核苷酸同源性为96.2%-100.0%,氨基酸同源性为94.0%-100.0%。宁夏14株麻疹病毒代表株与中国S191疫苗株的核苷酸同源性为91.0%-92.5%,氨基酸同源性为85.4%-89.4%。结论宁夏2004-2007年流行的麻疹野病毒为H1基因型H1a亚型,未发现其它基因亚型。H1a基因亚型病毒株引起了多个传播链造成宁夏各市的麻疹流行。     

新疆北部地区恙虫病疫源地宿主动物和传播媒介调查

目的了解新疆北部地区恙虫病疫源地的传播媒介与宿主。方法 2008-2011年新疆北部3个地区恙虫病疫源地进行定期捕鼠和分离恙螨,采集老鼠的肝脾,利用PCR法检测恙虫病东方体(Orentia tsutsugamushi,Ot)。结果小家鼠、灰仓鼠、草原兔尾鼠、大砂土鼠为当地不同生境的优势鼠种,自然感染Ot的动物7种,其中啮齿动物5种、鸟类2种。采集纤恙螨属5种,其中二肩纤恙螨、岩栖纤恙螨、博乐纤恙螨为优势种。结论新疆北部地区木垒、博东、新源等地具有恙虫病疫源地存在的宿主、媒介条件。     

恙虫病东方体56kD表达抗原基因片段的、表达及纯化抗原在恙虫抗体检测中的应用

目的：构建恙虫病东方体56kD表面抗原基因（sta56)片段的重组表达质粒，在E.coli中表达Sta56重组抗原，重组抗原纯化后应用于间接法ELISA，金标快速免疫导析法检测恙虫病东方体特异性抗体，方法：从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出sta56基因的ORF及其中长1053bp的大片段，用TA克隆技术将此大片段克隆以该重组质粒为模板，扩增出不同长度的截短的sta56片段，定向插入pPROEX HTb及pET30a载体，化大肠杆菌DH5a或BL21（DE3），IPTG诱导表达，应用SDS－PAGE观察重组蛋白表达情况，应用Western blot分析重组抗原的活性；采用电洗脱，亲和层析等方法纯化重组蛋白。纯化的重组蛋白直接包被聚乙烯96孔板，用于间接法ELISA检测恙虫病东方体IgG，或以胶体金标记重组抗原，运用金标快速免疫层析法检测恙虫病东方体IgM和IgG抗体，结果：（1）从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出含sta56基因的ORF，并成功构建含sta56 ORF大片段的重组质粒TOPO－sta56.(2)以截短的sta56基因片段构建重组表达质粒pHTbOt957,pHTbO498,pHtbOt342和pETOt957,pETOt498,pETOt342，各重组子均可在E.coli中以融合蛋白的形式有效表达，SDS－PAGE显示各表示重组子表达不同分子量的重组蛋白，Western blot证实各重组蛋白均能被恙虫病患者阳性血清所识别。（3）电洗脱、Ni-NTA并和层析均可用于重组蛋白的纯化，并获得高纯度的重组蛋白。（4）纯化的重组蛋白应用于间接法ELISA检测恙虫病东方体特异性IgG，与间接免疫荧光法IFAT比较，其敏感性和特异性分别91．7％和76．5％。（5）纯化的重组蛋白应用于金标免疫层析法，可直接快速检测恙虫病东方体特异性IgM和IgG。与间接免疫荧光法IFAT比较，其检测IgG的敏感性和特异性分别为94．2％和84．2％，结论：恙虫病东方体Karp株sta56基因可在大肠杆菌获得高效表达。重组蛋白具有免疫反应性，纯化后可用作免疫诊断抗原；以重组抗原建立的间接法ELISA检测IgG，适用于大规模的流行病学调查，以胶体金标记重组抗原建立的免疫层析法用于同时检测IgM和IgG抗体，具有简便，快速的特点，适于在缺乏实验条件的基层医院，农村对门诊病人进行诊断。     

河南省柯萨奇病毒A组16型VP4基因特征分析

目的分析河南省手足口病标本分离柯萨奇病毒A组16型(coxsachievirus A 16,CVA16)VP4的基因特征,并比较VP4与VP1遗传进化分析的差异。方法对分离自河南省手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)患儿的8株CVA16,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行VP4区域扩增并对扩增产物进行测序,用分子生物学软件ATGC进行序列拼接,Bioedit比对剪齐,用MEGA 4.0软件进行同源性分析,并与已报道的CVA16标准株序列构建基因进化树。结果河南省8株毒株VP4核苷酸同源性为91.3%~98.1%、氨基酸同源性为100.0%,与国际原型株CA16/G10/RSA/1951(A型)比对,VP4核苷酸同源性为79.7%~82.6%,氨基酸同源性为100.0%;与B1a、B1b和B2型代表株核苷酸同源性分别为92.3%~95.7%、92.8%~98.6%、88.9%~91.8%,氨基酸同源性均为100.0%。河南省分离的CVA16毒株均属于B1亚型,有B1a和B1b两个进化支共同存在和循环,但VP4与VP1的进化树分型不完全一致。结论 VP4基因不能作为CVA16病毒基因亚型分型的依据。     

人副流感病毒广州分离株ZYMgz01全基因组序列测定及分析

目的探讨广州地区副流感病毒的基因组结构和基因型。方法参照GenBank副流感病毒(U51116)全基因组序列设计11对引物,覆盖副流感病毒基因组的全长。以副流感病毒cDNA为模板分段扩增病毒基因组的全长,各片段克隆到T载体上,并进行序列测定和分析。结果人副流感病毒ZYMgz01株全基因组核酸序列为15462bp,提交到GenBank的序列号为EU326526,与3型副流感病毒保守基因同源性为94.0%,具有3型副流感病毒的结构特征。基因组序列同源性比较结果显示,ZHYMgz01株病毒与兰州的LZ22(FJ455842)病毒株的同源性最高,为99.1%;与美国突变病毒株(U51116)同源性为95.1%;与美国病毒株(Z11575)同源性为95.2%;与日本(ABO12132)病毒株的同源性为94.8%,而与加拿大(EU424062)病毒株的同源性为94.8%。系统进化树显示ZHYMgz01病毒株与兰州的LZ22病毒株同属一个进化分支。结论广州地区儿童呼吸道感染的副流感病毒ZHYMgz01全基因组为15462bp,与3型副流感病毒的同源性最高,确定ZHYMgz01是3型副流感病毒。3型副流感病毒系统进化可能与地域差异有一定的关系。     

不同血清型汉坦病毒基因重排的研究

目的探明汉坦病毒HTN型与SEO型、HTN型与PHV型之间基因重排的频率和特点。方法分别用相同滴度的汉坦病毒HTN型与SEO型(76-118株与SR-11株),及汉坦病毒HTN型与PHV型(76-118株与PHV株)毒株分别混合感染VeroE6细胞,用空斑形成试验挑选子代病毒克隆,挑得的单个病毒克隆在VeroE6细胞上扩增。分别用分型引物对子代病毒进行RT-PCR实验,以确定子代病毒L、M、S片段核酸的来源,鉴定子代病毒基因型。结果发现76-118株与SR-11株混种的子代病毒株基因30/44株来源于亲代病毒,9/44株子代病毒发生了基因片段重排。76-118株与PHV株混种的子代病毒株基因26/36株来源于亲代病毒,3/36株子代病毒发生了基因片段重排。76-118株与SR-11株混种的子代病毒株的基因重排率(20.45%)明显高于76-118株与PHV株混种的子代病毒株(8.33%)。结论这种重排率的差异可能是由于HTN型与SEO型HV基因核酸序列之间的同源性较高,而更容易发生基因重排。而HTN型与PHV型HV基因核酸序列之间的同源性较低,发生基因重排的机会显著降低。