反义GFAP逆转录病毒表达载体的构建及其对反应性星形胶质 …

目的 构建反义ＧＦＡＰ逆转录病毒表达载体,评价其对２正常及损僵星形胶质细胞（Ａｓｔ）形态及ＧＦＡＰ基因表达的影响。方法 用定向克隆,将１．１ｋｂ的ＧＦＡＰ基因片段反向插入逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ上,获得重组体ＰＬＢｓｋＧ,经病毒包装,抗性克隆筛选、滴度测定等,挑选滴度高的抗性克隆细胞株扩展培养,收获病毒上清液感染体外培养的Ａｓｔ,通过免疫组织化学、原位杂交、ＲＴ－ＰＣＲ,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ     

逆转录病毒载体介导的HSVtk基因表达及提高重组逆转录病毒滴度的研究

目的 探讨逆转录病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)基因表达及提高逆转录病毒滴度的措施。方法 将HSVtk基因插入逆转录病毒载体pRevTRE中,构建重组逆转录病毒载体。通过微乒乓感染法导入包装细胞PA317中,以潮霉素B筛选克隆细胞,浓缩克隆细胞上清制备重组逆转录病毒。在不同时间及不同丁酸钠浓度下,检测分析经筛选获得阳性克隆靶细胞中有无HSVtk基因的表达及如何获得高滴度的重组病毒液。结果 成功构建了重组逆转录病毒载体RevTRE／tk,制备的重组病毒感染靶细胞后有HSVtk基因的表达。结论 通过微乒乓感染法在包装细胞PA317培养30h和10mmol／L丁酸钠浓度下,经冷冻超速离心能获得携HSVtk基因的高滴度逆转录病毒颗粒,为其基因治疗的应用及研究奠定了基础。     

小鼠IL-23基因的克隆和在逆转录病毒中的表达

从肿瘤组织 (含有活化的淋巴细胞 )提取总RNA ,经逆转录多聚酶链反应 (RT PCR )获得小鼠IL 2 3cDNA。经DNA测序分析 ,证实该片段与GeneBank记载的IL 2 3cDNA序列一致。将该目的基因插入LXSN逆转录病毒载体 ,并转染大肠杆菌DH5α中扩增 ,再感染 ψ2 (ecotropic )和PA317(amphotropic )两种包装细胞 ,经G4 18筛选后获得表达IL 2 3分子的PA317阳性细胞克隆。通过用PCR、RT PCR及Northernblot技术检测目的基因表达 ,结果表明 ,成功地将鼠IL 2 3cDNA插入逆转录病毒载体 ,经转染两种包装细胞产生了高表达IL 2 3的PA317细胞克隆。该克隆细胞产生的逆转录病毒可进一步用于转染肿瘤细胞 ,为制备肿瘤疫苗奠定了基础     

三种反义c-myc逆转录病毒表达载体的纯化、病毒包装、滴度测定及整合检测

为了增强逆转录病毒构建体对靶细胞的转染能力 ,本实验使用 Wizard TMDNA纯化系统对构建成功的三种反义 c- myc逆转录病毒表达载体进行了纯化 ,并经脂质体介导包装 PA317细胞 ,使用 NIH 3T3细胞测定了 PA317抗性细胞克隆的病毒滴度 ,用 neo基因 PCR扩增检测外源基因的整合情况。结果显示纯化后的DNA达到了真核细胞转染的要求 ,但其包装滴度的高低还受靶细胞生长状态、 PA317抽样量的高度影响 ,而neo基因 PCR检测是一种敏感、经济和可靠的基因整合检测法     

携带钙整合素结合蛋白基因逆转录病毒表达载体的构建及包装细胞系的建立

目的:构建钙整合素结合蛋白(CIB)的逆转录病毒表达载体,并建立包装细胞系.方法:质粒pet32-CIB经EcoR I和Xho I双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建重组逆转录病毒表达载体pLXSN-CIB,PCR及双酶切鉴定后,通过脂质体转染导入包装细胞pA317,G418稳定筛选后获得抗性克隆,NIH3T3细胞进行逆转录病毒颗粒谪度测定.结果:重组逆转录病毒表达载体pLXSN-CIB质粒测序结果与GenBank中序列一致,经PCR及酶切鉴定证实,获得了大约574 bp的基因片段,且正确插入pLXSN-CIB载体中；建立了pA317-CIB包装细胞系,采用NIH3T3细胞测定病毒滴度为6.81 ×105 CFU/mL.结论:pLXSN-CIB结构正确,成功构建了CIB基因的逆转录病毒表达载体并建立了pLXSN-CIB包装细胞系.     

重组逆转录病毒载体携带乙型肝炎病毒载体的构建与表达

目的 探索利用逆转录病毒载体表达HBV载体的可能性及复制缺损性HBV能否被正确包装。方法 在逆转录病毒载体中插入表达显性阴性突变体的HBV基因复制单元，制备重组逆转录病毒后分别用以感染Hep G2和2．2．15细胞，免疫荧光法检测细胞内HBV核心抗原的表达，PCR检测上清液中重组HBV颗粒。结果 在包装细胞系PA317中能形成较高滴度的重组逆转录病毒，用以感染Hep G2细胞后，可检出核心抗原的表达。感染2．2．15细胞后，在培养上清液中能检测出突变型HBV颗粒。结论 重组逆转录病毒能携带HBV载体在细胞内表达，并在有野生型HBV提供结构蛋白的前提下，发挥HBV载体的功能，可望用于抗HBV基因治疗。     

逆转录病毒载体介导的端粒酶抑制基因促胰腺癌细胞凋亡

目的研究逆转录病毒载体介导的端粒酶反义RNA促进胰腺癌细胞Can-pan-2凋亡的作用。方法通过电穿孔法将携带正反义端粒酶RNA基因的逆转录病毒载体导入PT67包装细胞,G418筛选抗性细胞,获取稳定表达病毒的产病毒细胞株,以病毒上清感染Can-pan-2细胞,G418筛选获得稳定转染细胞集落并扩增培养,PCR鉴定端粒酶RNA基因的表达,TRAP-PCR-ELISA法检测端粒酶活性,免疫荧光化学检测不同处理组细胞的增殖情况,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡。结果两种逆转录病毒上清的滴度分别为0.95×106CFU/mL和1.1×106CFU/mL,PCR法可于约500bp处观察到目的基因的表达,反义端粒酶RNA作用后,Can-pan-2细胞端粒酶活性和细胞增殖受到明显抑制,并出现明显的细胞凋亡。结论反义端粒酶RNA可抑制胰腺癌细胞端粒酶活性,促进胰腺癌细胞的凋亡。     

携带绿色荧光蛋白的外源性胶质纤维酸性蛋白基因稳定转染对胶质瘤细胞分化及增殖的影响

目的观察增强胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)基因表达对恶性胶质瘤细胞生物学特性的影响,为胶质瘤诱导分化及基因治疗研究提供理论基础。方法构建携带1．1kb的GFAP cDNA和绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体,采用脂质体转染法将其导入人恶性胶质瘤细胞系SHG-44,G418结合荧光动态监测筛选阳性克隆;采用原位杂交、免疫细胞化学及Western蛋白印迹等方法检测GFAP基因及其蛋白表达;并通过形态学、细胞生长曲线、软琼脂克隆形成及流式细胞分析等观察GFAP基因对胶质瘤细胞形态、增殖和细胞周期的影响。结果转染阳性的SHG-44细胞GFAP mRNA及其蛋白表达增强,瘤细胞形态趋向成熟,突起增多变细,细胞增殖速度减缓,G0／G1期、G2／M期细胞比例降低。结论增强GFAP基因表达可显著抑制胶质瘤细胞增殖并诱导其分化成熟,提示通过基因治疗策略或诱导分化方法上调GFAP基因表达是恶性胶质瘤治疗的新途径。     

反义RNA阻断Hep G2细胞FasL的表达及功能研究

应用分子克隆技术将人FasLcDNA片段反向插入逆转录病毒载体pLXSN ,构建重组质粒pL (hFasL AS )SN ,转染包装细胞PA317后获得FasL反义RNA重组逆转录病毒表达载体假病毒上清 ,经NIH3T3细胞检测其感染滴度后转染肝癌细胞株HepG2细胞并筛选建系 ,命名为HepG2 hFasL AS。半定量RT PCR检测显示HepG2 FasL AS细胞FasL的mRNA明显少于正常HepG2细胞 ;FACS检测显示HepG2 FasL AS细胞FasL的表达与HepG2细胞相比显著下降 ;同时 ,HepG2 FasL AS细胞导致HL 6 0细胞凋亡能力有所下降。表明人FasL反义RNA重组逆转录病毒表达载体能抑制转染细胞FasL的表达并下调其致凋亡功能     

胶质瘤的白细胞介素-4免疫基因治疗实验研究

胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤。本研究通过逆转录病毒载体将白细胞介素 4 (IL 4 )基因导入逆转录病毒包装细胞 ,注入到脑内荷瘤大鼠肿瘤组织中 ,观察其对胶质瘤的治疗作用。首先构建和鉴定携带IL 4基因的逆转录病毒载体Pbabe IL 4 ,将其导入逆转录病毒包装细胞PA317,通过G4 18抗性筛选 ,得到携带目的基因的包装细胞 ;应用NIH3T3细胞测定抗性细胞克隆上清的病毒滴度 ,扩增培养高滴度产毒细胞克隆 ,命名为PA317IL 4 ;常规提取PA317IL 4细胞基因组总RNA ,通过RTPCR鉴定IL 4基因的整合 ;ELISA法检测PA317IL 4细胞培养上清的I…     

反义nov基因对培养神经元神经递质分泌的影响

目的：研究nov基因在神经元功能分化和神经递质分泌中的作用。方法：利用反义核酸技术构建成反义nov基因真核表达载体pBK-nov。采用脂质体转染技术，交坂义表达载体导入培养的大鼠大脑皮质神经元和纹状体神经元，经G418筛选出被转染的神经元继续培养，RT－PCR检测围染后nov mRNA的表达量。采用高效氨基酸分析仪和高效液相色说 ，检测抑制表达后氨基酸类递质和多巴胺类递质的变化。结果：谷氨酸和肾上腺素的分泌量明显下降，γ－氨基酸上升，而对多巴胺的分泌没有显著的影响。结论以上结果提示，nov基因在中枢神经系统神经递质的生成释放和代谢中起作用，可能籍此调节神经系统的功能。     

表达反义c-myc RNA的重组逆转录病毒载体对人胰腺癌细胞恶性表型的逆转作用

为研究表达反义c－mycRxA的逆转录病毒载体抑制靶基因的表达和翻译，使胰腺癌细胞恶性表型逆转的机理，利用PXTI逆转录病毒载体构建了一个能表达反义c－mycRNA的质粒，经病毒包装细胞PA317包装后，使之成为具有感染力的重组病毒。用该病毒感染人胰腺癌细胞系PC－2细胞，经G418筛选得到稳定的转化细胞系。Northernblot杂交证实包装细胞PA317及转化的PC－2细胞中均有病毒的高表达，体外合成的单链RNA探针杂交结果表明转化PC－2细胞中有高表达的反义c－mycRNA，而内源性c－mycRNA的表达明显受抑；Westernblot分析发现c－myc癌基因产物P62蛋白的表达显著下降。反义c－mycRNA使人胰腺癌细胞生长速率、~3H-胸腺嘧啶掺入、软琼脂集落形成能力以及探鼠致瘤能力等均明显下降。实验结果表明：表达反义c－mycRNA的逆转录病毒载体能有效地抑制靶基因的表达和翻译，使胰腺癌细胞恶性表型部分逆转。     

转染反义Fas阻断T细胞凋亡及对肿瘤的治疗意义

目的 通过阻断Ｔ细胞的Ｆａｓ信号传递途径,探讨消除肿瘤对Ｔ细胞的攻击及其对肿瘤的治疗意义。方法 流式细胞术、ＲＴ－ＰＣＲ方法检测卵巢癌细胞表达Ｆａｓ和ＦａｓＬ。构建ｐｃＤＮＡ３－反义Ｆａｓ真核表达载体,经脂质体转染Ｊｕｒｋａｔ细胞,流式细胞仪检测Ｆａｓ表达变化。以Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ和ＭＴＴ法检测转染反义Ｆａｓ基因对Ｊｕｒｋａｔ细胞凋亡的影响。采用ＭＴＴ体外杀伤实验观察３ＡＯ对Ｊｕｒｋａｔ细胞杀伤变化。结果 ６种卵巢癌细胞均表达Ｆａｓ和ＦａｓＬ。ｐｃＤＮＡ３－反义Ｆａｓ基因可以使Ｊｕｒｋａｔ细胞表达Ｆａｓ量下降并部分阻断Ｆａｓ单抗诱导的Ｊｕｒｋａｔ细胞凋亡,３ＡＯ对其杀伤减弱。结论 卵巢癌细胞表达ＦａｓＬ可能是其逃逸免疫监视并产生对淋巴细胞攻击的原因之一;应用反义技术阻断Ｆａｓ表达,可部分阻断Ｆａｓ单抗诱导Ｊｕｒ     

8-Br-cAMP对人视网膜母细胞瘤HXO-Rb44细胞抑癌基因表达的效应

目的 探讨８－Ｂr－CＡＭＰ对人视网膜母细胞瘤之ＨＸＯ－Ｒb４４细胞抑癌基因表达的 效庆及其对细胞生长的影响。方法 应用原位杂交、ＲＮＡ斑点印迹检测Ｐ１６＾ＩＮＫ４mＲＮＡ、p２１＾ＷＡＦ１mＲＮＡ、wp５３mＲＮＡ、mp５３mＲＮＡ和ＲｂｍＲＮＡ,应用免疫组织和化学和蛋白质斑点印迹技术检测ＰＣＮＡ－ＩＲ、p２１＾ＷＡＦ１－ＩＲ、 ｐ１６－ＩＲ、ｐＲｂ－ＩＲ、ｃｄｋ２、ＩＲ和ｃｄｋ４－ＩＲ。结果 在人ＨＸＯ－Ｒ     

含I-A~dα和β链cDNA的三顺反子逆转录病毒载体构建及真核表达

为了协同表达MHCII类分子的两个链α和 β ,利用脑心肌炎病毒和脊髓灰质炎病毒的内核糖体进入位点 ,构建了含MHCII类分子α和 β链及选择标记新霉素磷酸转移酶基因的三顺反子逆转录病毒载体。经包装细胞包装成重组逆转录病毒后 ,感染NIH3T3、MM45T Li、COS7细胞 ,经PCR、RT PCR、Southern印迹、Northern印迹及流式细胞术在多水平上证实了α链和 β链的基因表达和MHCII类分子的正确组装。     

大鼠Fas配体基因的克隆

目的 研究Ｆａｓ配体（Ｆａｓ ｌｉｇａｎｄ,ＦａｓＬ）在移植免疫方面的作用,克隆其编码的全部ｃＤＮＡ序列,并添加Ｋｏｚａｋ序列,以便在直核细胞高效表达大鼠ＦａｓＬ。方法 从大鼠的睾丸组织中提取总ＲＮＡ。下游引物以ＲＴ－ＰＣＲ的方法扩增出－９３１ｂｐ的ＤＮＡ征段,将这一片段重组于ｐＢＲ－ＲＳＶ载体中,酶切鉴定插人片段正确后进行全列分析。结果 证实该研究所克隆的ｃＤＮＡ是编码正确的大鼠ＦａｓＬ基因,与     

逆转录病毒载体介导乙型肝炎病毒反义基因的转录表达

为了探索在真核细胞内转录表达乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）反义核酸的方法，用基因重组技术将ＨＢＶ前Ｃ／Ｃ基因（ＰｒｅＣ／Ｃ）和前Ｓ／Ｓ基因（ＰｒｅＳ／Ｓ）片段反向插入逆转录病毒载体质粒，再将重组体分别转染ＰＡ３１７包装细胞，进而获得能够介导ＨＢＶ反义基因向小鼠ＮＩＨ３Ｔ３细胞转移表达的重组逆转录病毒。经分子杂交试验表明，含有ＨＢＶ反义基因的重组逆转录病毒序列已经整合到转染的ＰＡ３１７细胞染色体上；转导的ＮＩＨ３Ｔ３细胞内有ＨＢＶ反义ＲＮＡ转录表达。结论：逆转录病毒载体包装细胞系统能够介导ＨＢＶ反义基因在真核细胞中转录表达，因而有可能利用反义技术和基因转移方法进行抗－ＨＢＶ基因治疗     

融合蛋白Epo-Tpo(C)的表达及初步活性检测

目的 进一步研究促血小板生成素Tpo的功能,探讨新型Epo的可能性。方法 构建了融合蛋白Epo-Tpo（C）的真核表达载体,在CHO细胞中表达融合蛋白,染料亲合柱Blue-SepharoseCL－6B初步纯化,网织红细胞计数法体内测活并测定了体内半衰期和融合蛋白对大鼠肾衰模型的疗效。结果 初步纯化的融合蛋白体内活性比ELISA结果高20％,半衰期为12h,比标准Epo长近50％,对大鼠肾衰模型有良好的疗效。结论 Tpo富糖基化的C端结构域有显著延长Epo的半衰期,融合蛋白Epo-Tpo(C)具有一定的应用价值。     

反义周期蛋白B1基因抑制HT29细胞的增殖

用ＤＮＡ重组技术将人类ｃｙｃｌｉｎＢ１基因的全长ｃＤＮＡ，反向插入到真核表达载体ｐＸＪ４１－ｎｅｏ的ＢａｍＨ１位点，得到ｃｙｃｌｉｎＢ１基因的反义ＲＮＡ表达载体ｐＡＳ－Ｂ１。利用ＤＮＡ磷酸钙共沉淀方法，将ｐＡＳ－Ｂ１转染进ＨＴ２９细胞。在含有Ｇ４１８的培养基中，挑选出独立的细胞克隆。利用ｃｙｃｌｉｎＢ１ｃＤＮＡ作探针，Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交鉴定出一株内源性ｃｙｃｌｉｎＢ１ｍＲＮＡ受到抑制的细胞株ＨＴＢ１。比较ＨＴＢ１与对照细胞ＨＴ２９发现，ｃｙｃｌｉｎＢ１的反义ＲＮＡ明显抑制ＨＴ２９细胞的增殖，细胞内３Ｈ－ＴｄＲ参入量减少。流式细胞光度术分析，处于Ｇ１期细胞比率的升高与Ｓ期、Ｇ２＋Ｍ期细胞数量的下降都十分显著。