锶盐与模拟失重大鼠骨细胞的凋亡

摘要 背景：模拟失重促进成骨细胞、骨细胞凋亡,而锶能降低失重状态下骨组织中成骨细胞、骨细胞凋亡率,促进骨形成。 目的：观察锶盐对失重状态下骨组织中细胞凋亡的防治效应。 方法：5周龄SD大鼠建立失重动物模型,在悬吊前3 d或悬吊时开始以锶盐灌胃。建模后7 d,使用全自动生化仪检测大鼠血清中钙、磷、碱性磷酸酶水平,放射免疫分析法测定骨钙素质量浓度,原位细胞凋亡检测技术检测骨组织中细胞凋亡,免疫组化方法检测骨组织中Fas蛋白水平。 结果与结论：模型组大鼠血清中碱性磷酸酶、骨钙素水平均显著低于相应对照组(P < 0.05),但血钙,磷浓度均较相应对照组升高(P < 0.05),骨组织中成骨细胞、骨细胞及骨髓间充质细胞凋亡指数、骨组织中Fas抗原水平均高于相应对照组(P < 0.01)。悬吊前3 d始及悬吊时始锶盐灌胃组碱性磷酸酶,骨钙素水平均显著高于模型组(P < 0.05),而血钙、骨组织中成骨细胞、骨细胞及骨髓间充质细胞凋亡指数、骨组织中Fas抗原水平均显著低于模型组(P < 0.05)。说明尾部悬吊模拟失重增加骨组织中Fas蛋白表达,从而增加大鼠骨组织中成骨细胞、骨细胞及骨髓间充质细胞凋亡,而锶盐可降低失重状态下大鼠骨组织Fas蛋白表达,从而降低成骨细胞、骨细胞及骨髓间充质细胞凋亡。     

模拟失重状态下成骨细胞胰岛素样生长因子1基因表达与降钙素的干预

背景：航天飞行、长期卧床等低重力负荷状态会引起骨吸收和骨形成的代谢紊乱,导致骨质疏松。有研究显示降钙素有直接促进成骨细胞增殖的作用,并可增加成骨细胞胰岛素样生长因子1 mRNA的表达。 目的：观察降钙素和体外模拟失重状态对成骨细胞功能及胰岛素样生长因子1基因表达的影响。 方法：采用二次酶消化法提取新生SD大鼠颅骨的成骨细胞,凝胶化形成成骨细胞海藻酸钠微包囊后进行实验。实验分为正常重力组、模拟失重组、模拟失重+降钙素(10,40,80 IU/L)组。将细胞置于模拟失重三维回转培养器中培养72 h后,检测成骨细胞的增殖、凋亡及碱性磷酸酶活性;采用RT-PCR 方法检测胰岛素样生长因子1、碱性磷酸酶、骨钙素mRNA的表达。 结果与结论：与正常重力组比较,模拟失重组细胞增殖率及培养基中碱性磷酸酶活性均明显降低(P < 0.01),胰岛素样生长因子1、骨钙素、碱性磷酸酶mRNA表达减少,凋亡增多;与模拟失重组比较,模拟失重+降钙素组细胞增殖率,胰岛素样生长因子1、骨钙素、碱性磷酸酶mRNA表达均有所增加,但无剂量依赖关系。说明降钙素可通过上调胰岛素样生长因子1 mRNA表达改善模拟失重条件下成骨细胞的增殖与分泌功能。     

骨髓间充质干细胞成骨方向诱导过程中的基因表达

背景：目前骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化演变中的基因表达模式尚不明确。 目的：观察骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,验证骨髓间充质干细胞是否向成骨细胞成熟分化。 方法：抽取2月龄新西兰大白兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法培养获得骨髓间充质干细胞,用矿化诱导培养基(DMEM/F12、地塞米松1×10-8 mmol/L、β-磷酸甘油钠0.01 mol/L、维生素C 0.05 g/L)进行成骨诱导培养,用反转录-聚合酶链反应方法检测诱导培养后第一二代骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,并对该骨髓间充质干细胞表面抗原CD44进行鉴定。 结果与结论：经矿化诱导培养基诱导培养后,第一二代骨髓间充质干细胞阶段性表达碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因;第1代骨髓间充质干细胞抗原CD44阳性率达44.4%。提示兔骨髓间充质干细胞在体外矿化诱导培养中逐渐向成骨细胞分化,分别于诱导后第一二代细胞中阶段性顺序表达成骨细胞特异性基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素,该细胞已具备成骨细胞特征,为揭示骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中基因表达机制提供了实验依据。     

大鼠骨髓间充质干细胞与成骨细胞共育环境下Ⅰ型胶原的表达

背景：骨髓间充质干细胞在不同条件下可以分别分化为成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞等。 目的：与成骨细胞共培养的条件下，观察大鼠骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原的表达。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2007-01/08在广州中医药大学附属骨伤科医院细胞室完成。 材料：3月龄SPF级SD大鼠6只用于骨髓间充质干细胞的分离与扩增，1 d龄以内清洁级SD乳鼠10只用于成骨细胞的分离与扩增。 方法：贴壁法分离骨髓间充质干细胞，扩增后以流式细胞仪检测其均一性及细胞表型。采用酶消化法分离培养成骨细胞，以磷酸酶染色观察细胞分泌情况。利用Transwell培养板将成骨细胞和骨髓间充质干细胞在培养液以及其中的大分子蛋白可以相互交流而细胞间不相互接触的培养板内培养，以采用普通培养板单独培养的骨髓间充质干细胞为对照。 主要观察指标：观察骨髓间充质干细胞的形态学变化及矿化能力，20 d后半定量RT-PCR方法检测骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原的表达，茜素红染色后显微镜下计数钙化结节。 结果：流式细胞仪检测结果显示细胞均一性较好，2代细胞均一性在90%以上，CD34、CD45表达为阴性，CD44表达阳性。成骨细胞原代培养20 d时出现不透光的钙化结节，生长期细胞分裂相多见，细胞突起相互连接，汇合时呈铺路石状。茜素红染色矿化结节呈现酒红色，骨碱性磷酸酶染色可见胞质内出现黑色颗粒或块状沉淀。共培养的骨髓间充质干细胞形成的钙化结节数高于对照组(P < 0.05)；与成骨细胞共培养的骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原表达量明显高于对照组(P < 0.01)。 结论：与成骨细胞共培养的骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原的表达量高，成骨能力强。     

重组碱性成纤维细胞生长因子基因转染对于骨髓源性成骨细胞的

背景：碱性成纤维细胞生长因子对来源于中胚层和神经外胚层的细胞具有明显的促进增殖作用,对骨髓间充质干细胞具有间接的成骨作用。 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染对骨髓源性成骨细胞生物学特性和血管生成的影响,与骨髓间充质干细胞作对比。 设计、时间及地点：对比分析基因转染效果实验,于2007-11-27/2008-12-01在南方医科大学珠江医院中心实验室和动物实验中心完成。 材料：2月龄新西兰大白兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨细胞诱导。5周龄Wistar大鼠用于移植实验。牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒由中山大学中山医学院免疫教研室徐霖博士惠赠。 方法：分离兔骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞,采用脂质体介导将牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒分别转染体外培养的兔骨髓间充质干细胞和诱导的骨髓源性成骨细胞,G418筛选。稳定转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓源性成骨细胞与磷酸钙胶原材料复合培养,植于Wistar大鼠后腿肌袋内,正常饲养2,4周后取出植入的复合材料,观察血管新生情况。 主要观察指标：碱性成纤维细胞生长因子转染前后骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生物学特性参数的比较以及骨髓源性成骨细胞转染碱性成纤维细胞生长因子前后新生血管数目的比较。 结果：利用RT-PCR、免疫细胞化学染色分析转染细胞的碱性成纤维细胞生长因子表达情况。从形态、增殖特性和细胞周期、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原等方面分析稳定表达碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生物学特性。重组牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒成功转染目的细胞,经G418筛选稳定表达。转染的细胞有大量目的基因mRNA转录和目的蛋白表达。转染碱性成纤维细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生长均加快,细胞周期中增殖期细胞比例明显增加,细胞形态无明显变化。转染与未转染的骨髓源性成骨细胞比较,碱性磷酸酶的分泌量无明显变化(P > 0.05),转染后骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶分泌量小于骨髓源性成骨细胞(P < 0.01)。骨髓源性成骨细胞转染与未转染碱性成纤维细胞生长因子基因组均有Ⅰ型胶原mRNA表达,但是,转染和未转染的骨髓间充质干细胞中均无Ⅰ型胶原基因mRNA转录。转染有外源性碱性成纤维细胞生长因子基因的复合材料部分被增生纤维结缔组织包绕,内有新生血管生成,随着时间的延长而增多。 结论：稳定表达碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞增殖较快,但作为组织工程骨的种子细胞,骨髓源性成骨细胞较骨髓间充质干细胞更理想。外源碱性成纤维细胞生长因子基因转染后稳定表达,对新生血管的形成具有促进作用,可以作为组织工程化人工骨种子细胞转染的目的基因。     

低渗结合自然沉降法分离兔骨髓间充质干细胞及其鉴定

背景：骨髓间充质干细胞数量极少,10万个骨髓有核细胞中才有1个骨髓间充质干细胞,如何成功分离并鉴定骨髓间充质干细胞是研究中的关键工作。 目的：建立完善的骨髓间充质干细胞体外分离培养体系,从细胞的形态、表型和功能方面鉴定骨髓间充质干细胞。 方法：低渗原理去除杂细胞,结合自然沉降分离骨髓间充质细胞,并对其形态学特征进行光镜观察。对骨髓间充质细胞的表型进行流式细胞仪检测。并将骨髓间充质细胞向成骨细胞和脂肪细胞进行诱导分化,行形态学观察和碱性磷酸酶、Von kossa、Ⅰ型胶原、油红O染色检测。 结果与结论：实验分离获取的骨髓间充质细胞经表型鉴定为：CD29(+),CD45(-);向成骨细胞诱导后,碱性磷酸酶、矿化结节染色及Ⅰ型胶原检测均为阳性;向脂肪细胞诱导后,油红O染色阳性。结果表明实验分离的骨髓间充质细胞为类成纤维细胞样非造血类干细胞,此类细胞具有向成骨细胞和脂肪细胞分化的功能。     

骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的超微结构改变*

背景：目前尚缺乏骨髓间充质干细胞及其诱导分化后成骨细胞超微结构特点的观察。 目的：采用全骨髓培养-贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,诱导其向成骨细胞方向分化,利用光镜和电镜观察诱导和未诱导分化细胞的细微和超微结构特点。 设计、时间及地点：观察实验,于2007-03/2008-04在河北医科大学人体解剖教研室和白求恩国际和平医院骨科完成。 材料：成年新西兰大白兔由白求恩国际和平医院实验动物中心提供。Hitachi S-3500N型扫描电镜和Hitachi-7500型透射电镜。 方法：从新西兰大白兔髂后上嵴处抽取骨髓。经原代及传代培养后,取部分第3代细胞加入诱导剂,诱导剂为10 mmol/L β-甘油磷酸钠,10-8 mmol/L地塞米松,50 mg/L维生素C。培养2周后,诱导和未加诱导的骨髓间充质干细胞进行碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白和钙化结节检测。 主要观察指标：光镜观察骨髓间充质干细胞及其诱导分化后成骨细胞的一般形态学特征;电镜观察骨髓间充质干细胞和成骨细胞的超微结构特点。 结果：培养的第3代骨髓间充质干细胞,其碱性磷酸酶染色呈强阳性反应;钙化结节染色和骨形态发生蛋白免疫组织化学检测,均呈现阴性结果。经向成骨细胞诱导分化后,其碱性磷酸酶染色,钙化结节染色和骨形态发生蛋白免疫组织化学检测,均呈现阳性反应。光镜和扫描电镜观察显示,骨髓间充质干细胞大部分呈长梭形,少量呈星形;经向成骨细胞诱导分化后,细胞体积增大,更加饱满,似鱼群样排列。透射电镜观察显示,骨髓间充质干细胞的细胞器较丰富,向成骨细胞诱导分化后,其线粒体明显增多,出现较多的基质小泡、髓样体和空泡状结构。 结论：骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后细胞的超微结构表现为胞浆中出现增多的基质小泡、髓样体和空泡状结构。     

Ca2+在电磁场刺激骨髓间充质干细胞增殖与分化过程中的内流变化

背景：已证实电磁场可通过cAMP-蛋白激酶A信号转导系统调控骨髓间充质干细胞的增殖与分化，但同样作为第二信使的Ca2+相关作用报道较少。 目的：观察钙拮抗剂维拉帕米对电磁场刺激骨髓间充质干细胞增殖与分化的影响，以推断Ca2+在此过程中的内流变化。 设计、时间及地点：电刺激细胞学体外观察，于2005-04/06在同济医院矫形外科实验室完成。 材料：清洁级4~5周龄SD大鼠6只，维拉帕米为Sigma公司产品，Helmholtz线圈式磁场发生器由海军工程大学电机系设计制造。 方法：贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，胰蛋白酶消化传代。取生长良好的第4代细胞，调节密度至1×107 L-1，将其分种于4块96孔板内，200μL/孔。正常对照组不进行任何干预；暴磁组接种第2天将细胞放于置有Helmholtz线圈式磁场发生器的37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度细胞培养箱中进行暴磁，磁场强度0.8 mT，频率50 Hz，每次暴磁30 min，间隔12 h，共6次；维拉帕米组加入20 μmol/L维拉帕米；联合组加入20 μmol/L维拉帕米后进行暴磁。 主要观察指标：MTT法检测细胞增殖活性，向成骨细胞分化碱性磷酸酶的含量，改良Gomori氏钙钴法染色定性观察。 结果：暴磁3 d后，与正常对照组比较，暴磁组细胞增殖活性明显升高（P < 0.01），加入维拉帕米进行药物干预后这种促细胞增殖效应消失。未经暴磁的正常对照组、维拉帕米组细胞碱性磷酸酶含量基本相似，均明显高于其余2组（P < 0.01）；联合组细胞碱性磷酸酶含量高于暴磁组（P < 0.01）。碱性磷酸酶染色定性分析结果与上述数据基本一致。 结论：在50 Hz、0.8 mT电磁场作用下，骨髓间充质干细胞Ca2+内流发生变化，且该变化在骨髓间充质干细胞向成骨方向分化过程中产生部分抑制作用，在促其增殖过程中起主导作用。     

地塞米松诱导联合骨形成蛋白２基因修饰兔骨髓间质干细胞的成骨转化★

背景：骨髓间质干细胞在地塞米松等骨诱导剂的作用下能够向成骨细胞分化；同时骨形成蛋白2在骨修复过程中促进细胞增殖分化和基质分泌，在体内外均可诱导骨形成，以上二者联合应用可能会产生一定的协同效应。 目的：分析体外经地塞米松诱导是否能增强骨形成蛋白2基因修饰的骨髓间质干细胞的成骨转化能力。 设计：随机化配对设计。 单位：解放军第四军医大学西京医院。 材料：实验于2004-02/2004-08在解放军第四军医大学全军骨肿瘤研究所完成。选用2月龄新西兰白兔20只，由解放军第四军医大学实验动物中心提供（许可证号：军动管字第2005C00117号）。室温、常湿，正常喂食。双侧取材，左侧肢体来源骨髓间质干细胞为地塞米松诱导组，右侧为对照组（未经诱导）。 方法：将地塞米松诱导组和对照组兔骨髓间质干细胞分别转导含有人骨形成蛋白2基因的复制缺陷重组腺病毒Ad-BMP-2后，以反转录-聚合酶链反应和免疫组化方法检测细胞中骨形成蛋白2的表达情况。观察骨髓间质干细胞的生长情况，并应用碱性磷酸酶检测试剂盒及骨钙素放免试剂盒测定Ad-BMP-2转导5 d后两组骨髓间质干细胞的碱性磷酸酶活性和骨钙素含量。 主要观察指标：①骨髓间质干细胞中骨形成蛋白2的表达情况。②骨髓间质干细胞的形态学变化。③骨髓间质干细胞中碱性磷酸酶活性和骨钙素含量。 结果：①转导后骨形成蛋白2基因在地塞米松诱导组和对照组兔骨髓间质干细胞中均有表达。②骨髓间质干细胞经地塞米松成骨诱导后形态较不规则，呈三角形、多角形改变，较基础培养基培养细胞生长缓慢。基因转导后细胞形态无明显改变。③转基因5 d后，地塞米松诱导组骨髓间质干细胞培养上清中碱性磷酸酶活性高于对照组[(134.36±8.84，104.02±7.83) nkat/L(t =3.350 6，P < 0.01，n =20)]；地塞米松诱导组骨髓间质干细胞骨钙素分泌量高于对照组[(14.68±0.73，6.52±1.21) μg/L(t =3.568 2，P < 0.01，n =20)]。 结论：转基因前的地塞米松诱导能够促进骨形成蛋白2基因修饰的骨髓间质干细胞增殖和成骨转化。     

脐带间充质干细胞向成骨细胞分化的潜能

背景：人脐带间充质干细胞含量丰富,较为原始,分化能力强,免疫原性低,是细胞治疗的理想靶细胞。 目的：体外分离培养脐带间充质干细胞并将其定向诱导为成骨细胞。 方法：无菌条件下培养脐带间充质干细胞,分为诱导组和对照组,诱导组用成骨诱导液处理、对照组为干细胞培养液处理。倒置光显微镜观察细胞形态,MTT法测细胞增殖,荧光双染法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞周期与细胞表面标记。诱导后：检测碱性磷酸酶,Von Kossa染色分析钙盐沉积,RT-PCR检测骨桥蛋白基因、碱性磷酸酶、骨唾液蛋白mRNA的表达。 结果与结论：传代细胞形态稳定、活力好,高标达CD44。诱导后von Kossa染色表现为阳性。碱性磷酸酶活性诱导组比对照组高(P < 0.05),不同时间点比较21 d最高(P < 0.05)。RT-PCR显示：诱导组21,28d 碱性磷酸酶mRNA表达均较与对照组增强(P < 0.05)。诱导组有骨唾液蛋白和骨桥蛋白基因mRNA表达。提示,人脐带间充质干细胞能够定向分化为成骨细胞。     

海藻酸钠-明胶共混体系凝胶修复颅骨极限缺损过程中血清无机盐及碱性磷酸酶的变化**

背景：将各种凝胶系统作为支架材料进行骨缺损的修复日益受到重视，同时在骨修复过程中需要选择相对准确又方便的检测方式，以明确体内成骨过程。 目的：观察血清钙、磷和碱性磷酸酶浓度在可注射组织工程骨修复过程中的变化并对其作用进行初步探索。 设计、时间及地点：观察性实验，于2007-10/2008-03在北京世纪坛医院、北京大学医学部组织胚胎学教研室进行。 材料：分离培养兔成骨细胞，并引入海藻酸钠-明胶凝胶中构建细胞/支架材料复合体。 方法：36只新西兰纯种大白兔随机分为实验组、对照组和空白组3组，所有动物颅骨制备直径1.5 cm的极限缺损。1周后实验组在缺损处植入自体细胞/支架材料复合体，对照组植入单纯海藻酸钠-明胶凝胶，空白组不予材料修复。 主要观察指标：苏木精-伊红染色和Mallory三色染色观察观察骨组织的形成修复情况；于不同时间点抽取各组兔静脉血，统一条件下使用生化仪检测血清中钙、磷及碱性磷酸酶水平并做配对比较。 结果：实验组的血清碱性磷酸酶高峰出现得比其他2组早，且其高峰值高于对照组和空白组(P < 0.05)，并维持在一个较高的水平，随着修复的完成逐渐降低，到骨缺损后10周时接近正常值。术后2周，各组血钙均有不同程度升高，而血磷有所降低，但组间无显著性差异；术后4，8周，实验组血钙降低，血磷升高，较其他2组钙、磷沉积高峰提前出现(P < 0.05)。组织学结果也证实了以上各时间段骨愈合情况。 结论：在利用凝胶可注射组织工程骨修复兔颅骨极限骨缺损的过程中，血清钙、磷及碱性磷酸酶活性在不同的阶段有所差异, 可以反映体内成骨过程，并且可能在骨缺损的修复与成骨这一过程中参与调节作用。     

葛根异黄酮联合维生素D防治骨质疏松的协同效应*

背景: 葛根异黄酮具有类雌二醇结构特征,对去卵巢大鼠的骨质丢失和骨量的减少有一定的抑制作用。但也有报道其对去卵巢大鼠骨质疏松的防治效果较弱且单独使用效果不明显。 目的：观察葛根异黄酮与维生素D联合对去卵巢大鼠骨质疏松的作用。 方法：将81只3月龄雌性SD大鼠随机分为9组: 除假手术组外其他各组均行双侧卵巢摘除造模。低、中、高剂量TIP组,VitD组,低、中、高剂量联合组在去卵巢基础上分别灌胃给予相应剂量的葛根异黄酮和（或）维生素D;模型组和假手术组不给予药物治疗。给药3个月,计算大鼠子宫系数;测定大鼠血清碱性磷酸酶、血钙、血磷、骨钙素及血清雌二醇水平;检测大鼠股骨骨密度。 结果与结论：与模型组比较,中、高剂量TIP组,低、中、高剂量联合组大鼠子宫系数、雌二醇水平明显增高(P < 0.05),血清碱性磷酸酶、骨钙素水平明显降低(P < 0.05),股骨中心及远心骨密度均明显增加(P < 0.05),均以高剂量联合组作用效果最明显。且在子宫系数,雌二醇、血清碱性磷酸酶、骨钙素水平及股骨远心端骨密度方面,葛根异黄酮和维生素D均表现为协同作用。在血钙、血磷方面,葛根异黄酮和(或)维生素D的作用不明显。说明葛根异黄酮和维生素D联合使用对去卵巢大鼠骨质疏松的防治有协同效应。     

高糖条件下大鼠下颌骨成骨细胞的活性

背景：临床研究证实,糖尿病是引起牙周病变及牙槽骨丧失的危险因素,而糖尿病所致的高血糖对颌骨改变的影响机制目前仍未完全阐明。 目的：观察高糖对体外培养的下颌骨成骨细胞增殖、分化、矿化的影响。 方法：分离培养大鼠下颌骨成骨细胞,分别在生理糖浓度(5.5 mmol/L;对照组)和高糖条件下(16.5 mmol/L;高糖组)培养,采用MTT法、PNPP法、生化法、放射免疫法及茜素红S钙染法检测各组细胞的增殖能力、碱性磷酸酶活性、钙吸收、骨钙素分泌水平及矿化能力。 结果与结论：高浓度的葡萄糖能显著促进成骨细胞的增殖(P < 0.05),降低成骨细胞骨钙素的分泌(P < 0.01),增加钙结节的数量及面积(P < 0.01)。与对照组比较,高糖组成骨细胞碱性磷酸酶活性在21 d时显著增高(P < 0.01),钙吸收在14~21 d时显著降低,而在21~28 d时显著增高(P < 0.01)。说明高糖能促进体外培养的大鼠下颌骨成骨细胞的增殖,延迟其分化和矿化。     

猪骨蛋白对骨质疏松模型大鼠血清磷水平与骨密度的影响

背景: 有报道显示美国处于高风险的骨质疏松妇女中磷水平较高,这是否意味着降低血磷水平的物质将会为防治骨质疏松提供新的有效手段？ 目的：观察猪骨蛋白对骨质疏松大鼠骨密度和血清中钙及磷水平的影响。 方法：以肌肉注射地塞米松建立Wistar大鼠骨质疏松模型。造模后以数字表法随机分为生理盐水组、接骨七哩片组、50,100, 200 mg/kg猪骨蛋白组,不作任何处置大鼠作为正常对照。治疗12周后,分离血清并用生物化学方法测定血清磷和血钙水平,同时收集大鼠胫骨制作成骨切片,以QDR-4000双能X射线吸收仪测定各组大鼠胫骨吸光度值;苏木精-伊红染色观察胫骨骨髓腔变化。 结果与结论：各组之间血清钙浓度比较差异无显著性意义(P > 0.05)。与生理盐水组比较,50,100,200 mg/kg猪骨蛋白组大鼠血清磷浓度下降(P < 0.05)。50,100,200 mg/kg猪骨蛋白组、接骨七哩片组骨密度值高于生理盐水组(P < 0.05)。正常对照组大鼠胫骨的骨髓腔是小的,生理盐水组大鼠胫骨的骨髓腔特别大,50,100,200 mg/kg猪骨蛋白组、接骨七哩片组大鼠胫骨骨髓腔比生理盐水组大鼠胫骨骨髓腔小。结果提示猪骨蛋白不改变骨质疏松大鼠血清钙的水平,但它能降低骨质疏松大鼠血清磷的浓度,增加骨密度。不过,在该实验浓度范围内,没有显示剂量效应关系;猪骨蛋白也能缩小骨质疏松大鼠胫骨骨髓腔。     

Dorsal root ganglion neurons promote proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

Preliminary animal experiments have confirmed that sensory nerve fibers promote osteoblast differentiation, but motor nerve fibers have no promotion effect. Whether sensory neurons promote the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells remains unclear. No results at the cellular level have been reported. In this study, dorsal root ganglion neurons(sensory neurons) from Sprague-Dawley fetal rats were co-cultured with bone marrow mesenchymal stem cells transfected with green fluorescent protein 3 weeks after osteogenic differentiation in vitro, while osteoblasts derived from bone marrow mesenchymal stem cells served as the control group. The rat dorsal root ganglion neurons promoted the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cell-derived osteoblasts at 3 and 5 days of co-culture, as observed by fluorescence microscopy. The levels of m RNAs for osteogenic differentiation-related factors(including alkaline phosphatase, osteocalcin, osteopontin and bone morphogenetic protein 2) in the co-culture group were higher than those in the control group, as detected by real-time quantitative PCR. Our findings indicate that dorsal root ganglion neurons promote the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, which provides a theoretical basis for in vitro experiments aimed at constructing tissue-engineered bone.     

脱细胞天然骨基质与诱导性成骨细胞的体外相容性

摘要 背景：前期工作表明TritonX-100处理的脱细胞骨基质已满足组织学和免疫学方面的修复要求。如果细胞能在材料表面很好地生长,将利于进一步进行体内动物实验。 目的：采用细胞培养法在体外评估脱细胞骨基质与诱导后成骨细胞的生物相容性。 方法：第3代骨髓基质干细胞经成骨诱导分化培养液诱导分化为成骨细胞,接种于TritonX-100处理的脱细胞骨基质及羟基磷灰石表面,检测成骨细胞的碱性磷酸酶表达并用扫描电镜观察材料表面的细胞生长情况。 结果与结论：碱性磷酸酶活性分析均表明,TritonX-100处理的脱细胞骨基质在培养48 h之后比羟基磷灰石更利于诱导成骨细胞生长;扫描电镜下可见,成骨细胞在脱细胞骨基质表面呈现立体生长方式,细胞呈球形,并且聚集成簇。体外实验结果显示成骨细胞与脱细胞天然骨基质有较好的生物相容性。 关键词：天然脱细胞骨基质;骨髓基质干细胞;成骨细胞;体外培养;生物相容性 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.12.013     

大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构变化

背景：目前对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构观察的报道甚少。 目的：采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,成骨诱导并染色鉴定,利用电镜观察诱导前后细胞超微结构变化特点。 方法：全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,成骨染色鉴定向成骨方向诱导分化,扫描电镜及透射电镜观察成骨诱导前后细胞超微结构变化。 结果与结论：培养的第3代骨髓间充质干细胞纯度高、活力强,成骨诱导后的碱性磷酸酶活性染色、钙化结节染色均呈阳性。扫描电镜及透射电镜观察显示,经向成骨细胞诱导分化后,细胞形态铺展,不规则,其线粒体、粗面内质网、空泡明显增多,表明细胞功能活跃。     

电针诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

背景：目前经报道的成骨诱导方法很多,为骨髓间充质干细胞的成骨诱导提出很多新的思路及方法。但是电针是否能诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化尚不清楚。 目的：尝试应用电针治疗仪诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,评价其作为骨组织工程种子细胞的可行性。 方法：从患者髂后上棘抽取骨髓,分离培养鉴定为骨髓间充质干细胞后,取第3代细胞进行培养。当细胞铺满培养瓶底90%以上时进行胰酶消化,分别以3.0×103/cm2的浓度接种于6孔培养板中。实验随机分为3组：空白对照组：加入2 mL体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM/F12培养液;化学诱导组：每孔内加2 mL含10%胎牛血清的L-DMEM培养液,当细胞贴壁生长达到60%~70%汇合时,加入骨诱导剂;电针刺激组：加入2 mL体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM/F12培养液,电针刺激,采取连续波输出,基波脉冲频率为50 Hz,基波脉冲宽度0.5 ms,持续作用30 min,共电针刺激28 d。相差倒置显微镜观察细胞形态变化;茜素红染色结果;细胞诱导14,28 d后碱性磷酸酶活性;RT-PCR测定细胞中骨钙素mRNA的表达;Western Blot测定细胞中骨钙素蛋白表达。 结果与结论：①在28 d的诱导过程中,化学诱导组5~7 d细胞汇合成单层,细胞突起互相连接,并可重叠生长而不发生细胞间的接触抑制现象;电针刺激组9 d或10 d发现细胞体积大,呈三角形、多角形或鳞形;空白对照组细胞形态仍然是纺锤状。②化学诱导组和电针刺激组28 d在倒置相差显微镜下均观察到有矿化结节出现,进行茜素红均呈阳性反应,而空白对照组呈阴性反应。③骨髓间充质干细胞在体外进行诱导时化学诱导组和电针刺激组碱性磷酸酶水平在14,28 d高于空白对照组(P < 0.05);且化学诱导组碱性磷酸酶14 d时高于电针刺激组(P < 0.05),但28 d时差异无显著性意义(P > 0.05)。④空白对照组骨钙素mRNA及蛋白含量均低于化学诱导组和电针刺激组(P < 0.05)。提示电针可定向诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。