体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞（mMSCs）在体外定向诱导分化为肝细胞及其方法。方法：采用梯度离心法分离纯化雄性SD大鼠的mMSCs。A组原代培养；B组原代培养分别加刺激因子50ng／ml肝细胞生长因子（HGF）和50ng／ml成纤维细胞生长因子4（FGF-4），倒置显微镜连续观察细胞分化过程的形态学变化。于培养的7、14、21、28d，细胞免疫荧光法检测各组细胞甲胎蛋白（AFP）、白蛋白（ALB）、细胞角蛋白18（CK-18）、细胞角蛋白19（CK-19）的表达。采用过碘酸希夫（PAS）染色法检测各组细胞糖原染色情况。结果：分离纯化B组大鼠的mMSCs，应用HGF和FGF-4诱导10d后变为肝细胞样圆形。细胞免疫荧光测定B组显示，培养第7dAFP即出现阳性，第21d表达明显减弱；第7dCK-19染色阳性，以后增强；第14d白蛋白与CK-18染色开始阳性，以后表达逐渐加强。A组在培养过程中不表达AFP、ALB、CK-18和CK-19。糖原染色显示，B组第14d开始阳性，-直持续到第28d；A组未见阳性染色。结论：大鼠mMSCs在较高浓度的HGF及FGF-4诱导下可分化为肝细胞。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞定向肝细胞分化

目的:研究人骨髓间充质干细胞向肝细胞的诱导分化,为肝组织工程提供理想的细胞来源。方法:以肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4对种植于基底膜基质中的人骨髓间充质干细胞进行三维立体诱导培养,在培养后不同时间,分别进行形态观察、AFP、Alb的免疫组化荧光染色及靛青绿的摄取与排泌试验。结果:该条件下诱导后的人骨髓间充质干细胞生成肝细胞样细胞,阳性表达肝细胞特有表面标志AFP、Alb,并具备肝细胞特有的摄取与排泌靛青绿的活性功能。结论:肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4及基底膜基质可能在体外人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的过程中提供适宜的微环境并起重要作用,这为间充质干细胞在肝组织工程中的应用提供了理论与技术上的支持。     

肝细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞

目的人骨髓间充质干细胞（hMSC）经过腺病毒介导转染肝细胞生长因子（Ad-HGF）后进行鉴定。方法密度梯度离心法分离培养原代hMSC,取第三代hMSC转染Ad-HGF。比较转染前后的细胞形态变化,流式细胞仪鉴定hMSC/Ad-HGF的表面标志物,ELISA测定培养液上清的HGF浓度。结果 HGF基因修饰前后,均为成纤维样细胞形态;流式测定hMSC/Ad-HGF与hMSC细胞表型一致;ELISA测得hMSC/Ad-HGF的培养液上清HGF浓度显著高于hMSC（P〈0.001）。结论经HGF基因修饰的hMSC,维持了原有的细胞形态及特异性细胞表型,且高表达HGF。     

人胎儿骨髓间充质干细胞体外向类肝细胞诱导分化条件的优化

目的 :建立和优化骨髓间充质干细胞 (marrowmesen chymalstemcells,MMSCs)向类肝细胞诱导分化的条件及分化过程观察、鉴定 .方法 :采用体外分离培养的MMSCs为研究对象 ,设计不同的诱导分化条件进行体外诱导 ,观察细胞诱导分化过程中形态结构变化及细胞生物学特性 ,应用免疫组化检测肝细胞标志ALB和CK18的表达 ,建立人胎儿MMSCs向类肝细胞分化的优化条件 .结果 :未进行诱导的对照组细胞保持长梭型 ,形状因子 4 .5± 1.0 ,面积较小 ,增生较快 ,呈典型成纤维细胞的漩涡状或火焰状生长 ,培养后期可见 5～ 7个分支 ,无细胞变圆 ,双核细胞率小于 0 .1% ,逐渐老化 ,颗粒增多 .组化染色未见表达ALB和CK18.所有诱导组细胞在培养中细胞分支均减少 ,多为 1～ 3个分支 ,未用基质的细胞仍保持长梭形生长 ,给予基质的诱导细胞部分形态由长变圆 ,形状因子下降 ,给予 5 氮胞苷 (5 azacitidine,AZA)预处理可抑制细胞过度增生 ,细胞形态由长梭型逐渐变短 ,PDGF BB预处理对细胞增生无明显抑制作用 ,细胞容易出现分支 .诱导各组组化染色显示 ,第 2 1日时均有ALB和CK18阳性表达 .诱导 2组～诱导 5组的细胞转圆率、双核细胞比率及ALB ,CK18阳性细胞比例均显著高于对照组及诱导 1组 (P <0 .0 5 ) .结论 :在无血清培养条件下 ,     

肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞迁移的影响

目的研究肝细胞生长因子（HGF）对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）迁移的影响。方法采用Percoll密度梯度离心法分离BMSCs,进行表面抗原表达及分化鉴定。使用Dunn chamber装置研究BMSCs的定向迁移。并且研究PI3K抑制剂LY294002对HGF诱导BMSCs迁移的影响。结果分离培养的BMSCs呈CD29、CD90、CD106阳性表达,CD34、CD45阴性表达,BMSCs可诱导分化为成骨细胞及脂肪细胞。Dunn chamber迁移实验显示,外槽加入不同浓度的HGF,BMSCs迁移速率没有变化,迁移效率随着HGF浓度的增加而增加,50ng/ml与100ng/mlHGF均显著提高了细胞迁移效率;内外槽同时加入50ng/mlHGF,迁移速率与迁移效率均没有变化;经30μmol/LLY294002预处理1h后,HGF诱导的BMSCs的定向迁移受到抑制。结论 HGF能够趋化BMSCs的定向迁移,PI3K信号通路参与介导这一过程。     

人胎儿骨髓间充质干细胞体外分离培养及诱导分化为类肝细胞

目的建立人胎儿骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MMSCs)的体外分离、培养方法,体外诱导分化MMSCs为类肝细胞,观察MMSCs细胞生物学特性,并对类肝细胞进行分子生物学及功能鉴定。方法采用体外细胞培养技术,分离培养人胎儿MMSCs,在1%Matrigel做基质,2.5μmol/ml AZA预处理10~12h,HGF 10ng/ml FGF4 10ng/ml HGM培养基中诱导。用显微摄像和MTT研究细胞增殖及生长特征,用流式细胞仪、免疫组织化学和RT-PCR鉴定细胞表型。采用ELISA法检测培养上清中人清蛋白水平。结果24h换液后可获得约(300±80)个贴壁细胞;培养细胞在种植后1~3d为生长滞留期,第4天达到对数生长期,以后进入到平台期,细胞分裂指数曲线的趋势与生长曲线类似。连续传10代后,每个胎儿来源的MMSCs可扩增达1011~1012个细胞。MMSCs表型为CD166阳性,CD34阴性。在添加FGF4和HGF的Matrigel上诱导培养的MMSCs在21~28d时,细胞形态由长梭形变为三角形、多角形或类圆形。细胞转圆率为40%~50%,双核细胞比率5%~7%。免疫组化和RT-PCR检测显示未诱导培养的MMSCs中,有较少的细胞表达AFP及其mRNA,未见其他肝脏特有的转录因子或者胞浆蛋白标志。诱导早期可见较多细胞表达GATA4、AFP和CK19及其mRNA,至诱导后期表达下降,而ALB、CK18、GST-π和肝细胞转录因子HNF-1α表达逐渐上升。ALB、CK18阳性细胞比例达61%~65%。未诱导分化的MMSCs没有分泌ALB,诱导分化的MMSCs以时间依赖方式产生清蛋白。结论人胎儿MMSCs分离成分单纯,增生旺盛。诱导培养可获得高比例的类肝细胞。MMSCs向类肝细胞的横向分化是先分化为肝前体细胞,再分化为成熟肝细胞,在本实验诱导条件下可获得在复制及翻译各环节肝细胞标志阳性的类肝细胞。诱导后MMSCs已具备肝细胞特有的功能性特征。     

人骨髓间充质干细胞体外定向分化为心肌细胞的实验研究

目的：建立人骨髓间充质干细胞（MSCs）体外定向分化为心肌细胞的实验模型。方法：取6个月水囊引产胎儿股骨骨髓,Percoll分离液分离,取单个核细胞层在人MSCs专用MSCGM培养基中体外培养。将第3代生长状态良好的MSCs用10μmol／L 5-氮胞苷孵育诱导24h,继续向心肌细胞诱导分化。结果：用Percoll分离液（1．073g／ml）分离得到的单个核细胞48～72h呈纺锤形、梭形、多角形的多型性改变;经5-氮胞苷孵育24h,细胞逐渐向梭形心肌细胞样形态转变,胞浆中可见棕黄色颗粒。结论：MSCs在体外经5-氮胞苷孵育24h,可被定向诱导分化为心肌形态的细胞。     

体外诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮干细胞

目的：探讨体外诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮干细胞的可行性。方法：直接抽取成年健康志愿者骨髓，采用直接贴壁法培养获得较纯的人骨髓间充质干细胞；用免疫组织化学方法进行表面标志的检测、鉴定及培养扩增后，以HaCaT细胞培养上清液联合表皮生长因子（EGF）诱导分化，透射电镜下观察细胞形态的变化；并运用免疫组织化学方法检测K10，K19及β1整合素的表达。结果：诱导BMSCs1周后可见大量扁平的多角形细胞紧密连接成片，呈铺路石状排列生长，胞浆内可见丰富的角蛋白丝；大量细胞K19和β1整合素双染阳性，个别细胞K10染色阳性。结论：BMSCs在HaCaT细胞培养上清液联合EGF的体外培养条件下可诱导分化为表皮干细胞。     

脐血间充质干细胞向肝细胞分化的研究进展

随着对脐血干细胞的不断认识，研究者们发现脐血中含有丰富的造血干细胞。自1988年Gluckman等首次报道脐血移植治疗范科尼病以来，脐血移植已成为治疗恶性及非恶性血液系统疾病的重要方法之一。脐血干细胞的研究得到了人们的重视，世界各地已经建立了许多脐血库。2000年Erices等通过研究发现脐血中还存在有在细胞形态、免疫表型及功能特点方面与骨髓间充质干细胞相似的一类同质细胞群。自此脐血间充质干细胞（umbilical cord blood-mesenchyrmal stem cell，UCB-MSC）引起广泛关注。同时关于UBC-MSC分化能力的研究也逐步展开，现对脐血间充质干细胞及其向肝细胞的分化作一综述。     

骨髓间充质干细胞诱导分化为肝细胞的研究进展

骨髓间充质干细胞(BMSCs)是骨髓内的非造血干细胞,具有多向分化、低免疫源性等优势.肝移植是目前终末期肝病的有效治疗方法,但因肝源短缺及免疫排斥等缺陷,其临床运用严重受限.BMSCs经过不同的诱导方法可以在体外分化为肝细胞,应用于晚期肝病的治疗,是目前治疗肝损伤的一种新兴治疗手段.本文主要将近年来BMSCs的分离培养...     

骨髓间充质干细胞体外可定向诱导为内皮细胞

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力。方法:利用淋巴细胞分离液分离出MSCs,体外扩增,激光共聚焦显微镜检测表面抗原表达,以含VEGF、bFGF的诱导分化培养液定向诱导传代使细胞向血管内皮细胞分化,免疫荧光及免疫组化检测内皮细胞特异性标志物鉴定。结果:MSCs在体外传代扩增后激光共聚焦显微镜检测结果显示CD44、CD90表达阳性,CD31、CD45为阴性,分化后的细胞具有内皮细胞的形态学特征可表达CD31及Ⅷ因子。结论:骨髓间充质干细胞可在体外诱导向内皮细胞方向分化。     

小鼠骨髓基质干细胞体外分化为前体心肌细胞的初步实验

目的 研究体外诱导小鼠骨髓基质干细胞(MSCs)向心肌细胞分化的可能性。方法 MSCs通过细胞传代培养,并通过流式细胞仪进行鉴定。MSCs经过5-杂氮胞苷诱导后,通过RT-PCR、半定量RT-PCR、Western-blotting和透射电镜检测诱导后的MSCs。结果 培养的MSCs为形态均一的梭形细胞,有时可见细胞融合。流式细胞仪显示诱导后的MSCsCD29、CD44表达阳性,而CD34、CD45表达阴性。经过5-杂氮胞苷诱导后的MSCs表达Nkx2-5/Csx、GATA4、β-MHC基因和α-sarcomericactin和desmin蛋白,透射电镜显示诱导后的MSCs有肌丝形成。诱导后的MSCsDNA甲基化转移酶表达降低。结论 小鼠MSCs能够向前体心肌细胞分化。     

体外诱导人骨髓间质干细胞分化为肝细胞样细胞

目的:探讨人骨髓间质干细胞(MSCs)在体外特定条件下是否可以转化为肝细胞样细胞.方法:分离培养人骨髓间质干细胞,采用肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)及CCl4损伤的小鼠肝脏共培养等诱导方式,在不同时间点分别用RT-PCR和荧光定量PCR检测肝细胞特异性基因的表达,免疫组织化学染色检测肝细胞标志. 结果: 在HGF和bFGF诱导第7天时甲胎蛋白(alpha fetal protein,AFP)、细胞角蛋白18(cytokeratin-18, CK18)和色氨酸2,3-双加氧酶(tryptophan 2,3-dioxygenase,TDO)基因表达阳性,CK18和TDO的表达随诱导时间延长增高;第7天诱导细胞组织化学染色AFP、白蛋白(ALB)、肝细胞核因子(hepatocyte nuclear factor,HNF)、肝细胞特异性抗原(HSA)和CK18表达阳性.与损伤小鼠肝组织共培养21 d后细胞表达AFP和TDO.结论:HGF和bFGF联合诱导以及与CCl4损伤肝组织共培养的方法可体外促进人MSCs分化为肝细胞样细胞,可为肝脏疾病或肝损伤的干细胞治疗提供细胞来源.     

Cardiac differentiation and electrophysiology characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells

Objective  To review the progress of cardiac differentiation and electrophysiological characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells.

Data sources  The databases of PubMed, Springer Link, Science Direct and CNKI were retrieved for papers published from January 2000 to January 2012 with the key words of “bone marrow mesenchymal stem cells, cardiac or heart, electrophysiology or electrophysiological characteristics”.

Study selection  The articles concerned cardiac differentiation and electrophysiological characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells were collected. After excluding papers that study purposes are not coincident with this review or contents duplicated, 56 papers were internalized at last.

Results  For the treatment of myocardial infarction and myocardiac disease, the therapeutic effects of transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells which have the ability to develop into functional myocardial cells by lots of methods have been proved by many researches. But the arrhythmogenic effect on ventricles after transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells derived myocardial cells is still controversial in animal models. Certainly, the low differentiation efficiency and heterogeneous development of electricial function could be the most important risk for proarrhythmia.

Conclusion  Many studies of cardiac differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells have paid attention to improve the cardiac differentiation rate, and the electrophysiology characteristics of the differentiated cells should be concerned for the risk for proarrhythmia as well.

     

兔骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞的研究

目的 探讨兔骨髓间充质干细胞﹙bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs﹚体外分离培养、诱导分化为成骨细胞的方法,并研究其生物学特性.方法 采用体外细胞培养技术自兔股骨、胫骨及肱骨中分离BMSCs进行纯化、培养.用地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C定向诱导BMSCs分化为成骨细胞,改良MTT法测定其生长曲线,NBT/BCIP染色法、P-对硝基苯基质法及茜素红染色法检测BMSCs的成骨能力.结果 成骨诱导1～5 d,培养的细胞增殖旺盛,3～5 d即可融合成单层,随着诱导时间的延长,细胞增殖速度减慢,出现细胞聚集的现象,培养细胞逐渐汇合呈铺路石状,细胞形态变为胞体较小的立方形,继续诱导,可出现多角形成骨样细胞,胞外基质分泌逐渐增多,胶原堆积、钙盐沉积,10～12 d形成不透光矿化结节,ALP活性增高,茜素红染色阳性,表示BMSCs向成骨细胞分化.结论 兔BMSCs经体外分离、诱导培养,可以定向分化为成骨细胞.     

骨髓间质干细胞分离培养及向心肌细胞的转化

目的:探讨骨髓间质干细胞(MsCs)诱导分化为心肌细胞的可能性,为干细胞移植治疗心肌梗死寻求理想的细胞材料.方法:体外分离培养大鼠骨髓MSCs,5-氮胞苷(5-aza)诱导24 h后继续培养,免疫细胞化学染色和RT-PCR检测心肌细胞特异性蛋白的表达.结果:MSCs经5-aza诱导后3周心肌肌钙蛋白T和连接蛋白43免疫细胞化学染色阳性表达;RT-PCR显示诱导3周细胞有心肌肌钙蛋白I、α心肌肌动蛋白表达.结论:MsCs可在体外经5-aza诱导定向分化为心肌细胞.     

人骨髓基质干细胞克隆的培养及其向神经元样细胞的定向诱导分化

目的探讨人骨髓基质干细胞克隆的体外长期培养方法及其生物学特性。方法贴壁生长的基质干细胞以套环法消化分离,扩增培养,待细胞融合,传代培养。检测细胞的生长曲线、表面标记、克隆形成能力和向神经元定向诱导分化的潜能。结果克隆培养的骨髓基质干细胞能传代20代以上,表达CD13、CD29、CD59,不表达CD11、CD14、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、HLA-DR;传代17代时能诱导分化为神经元样细胞。结论该培养条件能有效扩增骨髓基质干细胞,并保持分化潜能;克隆来源的骨髓基质细胞有相同的生物学特性。     

骨髓干细胞诱导分化为肝系细胞的研究进展

骨髓干细胞（bone marrow stem cells,BMSC）因其具有自我更新能力和发育的多能性,成为当前医学研究的热点。BMSC是目前研究较多的一类成体干细胞,主要有造血干细胞和间充质干细胞两大类．BMSC不但可以自发分化,而且在诱导因素作用下可以分化为多种组织细胞,如神经细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肝系细胞等。因此,BMSC在细胞移植学、疾病治疗学等领域有着广阔的应用前景。本文主要对BMSC诱导分化为肝系细胞的研究进行综述。