二甲基甲酰胺致人肝细胞DNA的损伤效应

目的 探讨不同染毒剂量二甲基甲酰胺(DMF)在不同染毒时间下对人正常离体肝细胞DNA损伤的影响.方法 肝细胞染毒分别以PBS阴性对照组、1.56、6.25、25.00、100.00 mmol/L的DMF和100μmol/L的H2O2,染毒时间为0.5、3.0、6.0、12.0和24.0 h,用γH2AX免疫荧光法观察肝细胞DNA的损伤情况.结果 不同剂量的DMF和H2O2诱导形成γH2AX焦点的细胞数量多于PBS阴性组,差异有统计学意义(P＜0.01),并且随着DMF染毒剂量的增加,形成γH2AX焦点细胞数有增多趋势;在不同染毒时间处理后,γH2AX焦点细胞数的形成除3.0 h组和0.5 h组比较,差异无统计学意义(P＞0.05),余处理时间组与0.5 h比较,差异均有统计学意义(P＜0.01),并且形成γH2AX焦点细胞数有减少趋势.结论 不同剂量DMF可引起DNA的损伤,并且损伤程度与剂量呈正相关,与染毒时间呈负相关,γH2AX可作为检测细胞DNA损伤程度的良好指标.     

甲醛致V79细胞DNA交联作用的体外研究

目的研究甲醛对V79细胞DNA的交联作用,探讨甲醛的基因毒作用及可能的形成机制。方法中国仓鼠肺细胞(V79)分别暴露于浓度为75,150,300,600,1200μmol/L的甲醛溶液中1,2,4h,以紫外线照射作为标准断裂剂,用单细胞凝胶电泳技术对不同浓度、不同暴露时间甲醛诱导的V79细胞DNA-交联作用进行体外实验。结果在本研究所用的剂量范围内,除75μmol/L组外,其它4个浓度组3个染毒时间点甲醛均可引起显著的V79细胞DNA的交联作用,彗星尾长和彗星细胞率显著低于紫外线照射的对照组(P<0.01),随着甲醛浓度的增加,交联作用加强,彗星尾长存在明显剂量效应关系(P<0.01)。且细胞暴露在甲醛中4,2h;150,300,600μmol/L浓度组彗星尾长和彗星细胞率显著低于暴露于1h的相应浓度组(P<0.01)。结论甲醛是一种DNA交联剂,具有诱导V79细胞DNA交联的作用,并有明显的剂量、时间效应关系。     

DNA-PKcs在石英诱导的DNA双链断裂修复中的作用

目的 探讨DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)在石英致人胚肺成纤维细胞(HELF)DNA双链断裂修复中的作用.方法 脂质体转染法建立DNA-PKcs的小干扰RNA(siRNA)及其阴性对照重组质粒稳定转染HELF系(简称HELF-PKcs和HELF-NC).3种方式分组及对细胞的处理:(1)25、50、100、200、300、400μg/ml浓度的石英刺激HELF 12 h;(2)200μg/ml的石英刺激HELF 0、1、2、6、12、24 h;(3)200μg/ml的石英刺激HELF-PKcs和HELF-NC 0、12、24 h.用免疫印迹法检测DNA-PKcs表达、磷酸化H2AX(H2AX)的水平.用Image-Pro plus6.0软件对条带光强度进行半定量分析;用中性彗星实验(彗尾DNA百分含量值)判断石英诱导的DNA舣链断裂损伤强度.结果 不同浓度的石英刺激HELF 12 h,γH2AX水平及彗尾DNA百分含量随着石英浓度的增加逐渐升高.200 μg/ml的石英刺激HELF6 h时,彗尾DNA百分含量[(38.7±6.9)%]与对照组相比明显增加,并且在12h达峰值,24h相对12h时点明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05).在抑制DNA-PKcs的表达的细胞,12 h时,石英刺激的HELF-PKcs的石英诱导的γH2AX水平增加受抑制,彗尾DNA百分含量为(43.09±3.68)%,与石英刺激的HELF-NC相比,差异无统计学意义(P>0.05);24 h时,石英刺激的HELF-PKcs的石英诱导的γH2AX水平与石英刺激的HELF-NC相比无明显筹异,差异无统计学意义(P>0.05).石英刺激的HELF-PKcs的彗尾DNA百分含量(35.79±4.26)%]明显高于石英刺激的HELF-NC,差异有统计学意义(P<0.05).结论 石英可诱导DNA双链断裂损伤,DNA-PKcs是石英诱导的DNA双链断裂损伤的感受器,通过磷酸化H2AX,促进石英诱导的DNA双链断裂损伤的修复.     

1800 MHz射频电磁场对中国仓鼠肺成纤维细胞DNA损伤的影响

目的研究全球移动通讯系统(GSM)1800 MHz射频电磁场对中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)DNA损伤的影响.方法采用DNA双链断裂的早期标志性事件H2AX的磷酸化作为检测指标,将细胞间断(5 min开,10 min关)暴露于比吸收率为0或3.0 W/kg的1800 MHz射频电磁场1或24 h后,用4%多聚甲醛固定后进行γH2AX免疫荧光分析,即用鼠源抗γH2AX单克隆抗体为一抗和异硫酸酯荧光素标记的山羊来源抗鼠抗体为二抗,显示细胞核内γH2AX的形成情况.以4,6-二咪基-4-联苯基吲哚标记细胞核,采用Image Pro-Plus图像软件分析数据,以20 mg/L的DNA损伤剂二乙酰氨基芴(AAF)作用2 h作为阳性对照.各处理条件至少检测50个细胞的γH2AX 焦点数,焦点超过5个的细胞定义为γH2AX焦点阳性细胞,将该焦点阳性细胞率作为评价细胞DNA损伤程度的指标.结果γH2AX焦点阳性细胞率在1800 MHz射频暴露24 h后为(37.9±8.6)%,在阳性对照组为(50.9±9.4)%,与假辐照组的(28.0±8.4)%比较,明显增高;而射频暴露1 h后的γH2AX焦点阳性细胞率为(31.8±8.7)%,增加不明显.结论 1800 MHz 比吸收率为3.0 W/kg的射频电磁场辐照24 h对CHL细胞DNA有损伤作用.     

醋酸铅染毒致人外周血淋巴细胞遗传损伤的研究

目的研究醋酸铅染毒致人外周血淋巴细胞遗传损伤情况。方法不同浓度醋酸铅染毒人外周血淋巴细胞,CCK-8试验检测细胞活力;染色体畸变试验检测醋酸铅染毒对人外周血淋巴细胞染色体损伤作用;免疫荧光染色检测DNA双链断裂损伤生物标志物组蛋白H2AX的磷酸化(γ-H2AX)表达情况。结果醋酸铅染毒抑制人外周血淋巴细胞活力,其24 h的IC50值为168.5μmol/L;醋酸铅染毒后,人外周血淋巴细胞染色体损伤程度和γ-H2AX焦点表达水平随醋酸铅浓度的增加和染毒时间的延长而升高,呈现明显的剂量效应和时间效应。结论醋酸铅对人外周血淋巴细胞有潜在的细胞毒性和遗传毒性。     

杭州市PM2.5对BEAS-2B细胞的生物学效应研究

目的 观察杭州市不同地区PM2.5对人支气管上皮细胞（BEAS-2B）的生物学效应。方法 采集杭州市下城区和淳安县的PM2.5样品,通过超声冻干提取后将不同浓度PM2.5样品作用于BEAS-2B细胞,24 h后观察其生物学效应。用CCK-8法检测细胞活力,根据实验结果,将细胞分成空白对照组、25μg/ml浓度组和100μg/ml浓度组。采用γH2AX免疫荧光法和免疫印迹法分别检测γH2AX焦点损伤及γH2AX蛋白表达情况,免疫荧光实验采用平均焦点数和焦点阳性细胞率作为DNA损伤的评价指标;用DCFH-DA探针法观察细胞内ROS生成。结果 CCK-8实验结果显示,下城区和淳安县的PM2.5样品在25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml和400μg/ml浓度时能显著降低细胞活力（P<0.05）,而2.5μg/ml～10μg/ml低浓度作用则未对细胞造成影响。用25μg/ml和100μg/ml浓度PM2.5样品处理细胞后,细胞内γH2AX平均焦点数、焦点阳性细胞率、γH2AX蛋白以及ROS表达均有显著增加（P<0.05）。结论 PM2.5能使BEAS-2...     

氢醌致V79细胞DNA损伤的体外实验研究

目的研究苯的主要代谢产物氢醌(HQ)对V79细胞DNA的损伤作用。方法分别用0.15,0.30,0.60,1.20,2.40mmol/L的HQ染毒V79细胞2h,用单细胞凝胶电泳方法检测DNA损伤情况。结果在本研究所用剂量范围内,HQ可引起V79细胞DNA的明显损伤,低剂量组(0.15mmol/L)彗星细胞率为69%,彗星尾长(42.20±3.18)μm,高剂量组(2.40mmol/L)彗星细胞率为91%,彗星尾长(49.05±4.31)μm,但无明显的剂量-效应关系。结论HQ可致V79细胞DNA损伤,产生遗传毒性作用。     

氯化镉所致DNA损伤及锌的拮抗效应的研究

目的通过体外实验,了解氯化镉(CdCl2)对中国仓鼠肺成纤维细胞(V79细胞)的直接DNA损伤作用及锌的拮抗作用,初步探讨镉的遗传毒性机制及预防措施。方法采用甲基四唑法(MTT法)了解CdCl2对于V79细胞的毒性,通过碱性单细胞凝胶电泳常用的几个评价指标,研究CdCl2体外对于V79细胞DNA的断裂损伤,并采用生理浓度ZnCl2(10μmol/L)加以拮抗。结果MTT试验中,CdCl2对于V79细胞的毒性随染毒剂量增加而增高,呈线性关系,线性方程为:y=-0.009 4x 94.472;在碱性单细胞凝胶电泳中,CdCl2单独染毒,随着染毒剂量增加,DNA损伤加重,而锌具有明显的拮抗作用。结论本实验条件下,CdCl2能造成V79细胞DNA损伤,生理浓度的锌可以拮抗镉的DNA损伤效应。     

甲醛对小鼠源性巨噬细胞DNA损伤作用

目的 探讨甲醛对小鼠源性巨噬细胞(RAW264.7细胞)DNA的损伤作用.方法 用0,20,40,80,160,320 μmol/L甲醛处理RAW264.7细胞1 h.采用单细胞凝胶电泳技术检测甲醛对RAW264.7细胞DNA的损伤作用.结果 甲醛剂量为20,40,80,160 μmol/L时,RAW264.7细胞DNA的迁移率和尾长分别为33.0%,49.7%,82.3%,38.3%和11.2,22.6,30.1,18.9μm,与空白对照组4.3%和9.7μm比较,差异有统计学意义(P＜0.05);当甲醛浓度达320 μmol/L时,细胞DNA的迁移率和尾长分别为6.3%和9.3 μm,与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 低浓度甲醛可造成RAW264.7细胞DNA的损伤.     

氯化镉对DNA修复的影响及机制的体外研究

目的通过体外实验，了解氯化镉（CACl2）对过氧化氢（H2O2）引起的V79细胞DNA损伤后修复过程的影响及其相关机制。方法采用MTT法了解CdCl2对于V79细胞的毒性；以单细胞凝胶电泳实验分析软件中的几个评价指标，同时观察无细胞毒性浓度的CdCl2对H2O2所引起的V79细胞DNA损伤后修复所产生的影响；以生理浓度的氯化锌（ZnCl2）作为拮抗剂，与CdCl2同时作用后，观察对DNA修复影响的变化。结果MTT实验中，CdCl2对V79细胞的毒性随染毒浓度增加而增强，呈线性关系；在碱性单细胞凝胶电泳实验中，无细胞毒性浓度的CdCl2未明显增强H2O2V79细胞DNA的损伤，却明显地抑制了由H2O2所致的V79细胞DNA损伤后的修复过程，并以0．1μmol／LCdCl2浓度最为明显；生理浓度的锌可有效拮抗CdCl2的DNA修复抑制作用。结论在本实验条件下，无细胞毒性浓度的CdCl2对H2O2的DNA损伤效应无协同作用，却明显抑制DNA损伤后的修复过程；锌在一定程度上可以拮抗CdCl2的DNA修复抑制效应。     

姜黄素对丙烯酰胺致HepG2细胞DNA损伤的保护作用

目的体外研究姜黄素对丙烯酰胺(AA)所致人肝癌HepG2细胞DNA损伤的保护作用。方法AA(0、2.5、5.0、10.0和20.0mmol/L)与HepG2细胞温育1h,单细胞凝胶电泳检测DNA损伤;姜黄素(0.63、1.25和2.50μg/ml)37℃预处理HepG2细胞1h后,再与不同浓度的AA(0、10和20mmol/L)温育1h,单细胞凝胶电泳检测DNA损伤,2',7'-二氢二氯荧光比色法测定细胞内活性氧水平。结果2.5、5.0、10.0和20.0mmol/LAA组的彗尾DNA含量、彗星尾长及彗星尾矩均显著高于对照组(P<0.05),姜黄素保护组的彗尾DNA含量、彗星尾长及彗星尾矩均比相同浓度AA处理组降低,2.50μg/ml姜黄素保护组的差异有显著性(P<0.05);AA(10和20mmol/L)作用于HepG2细胞1h后,细胞内ROS水平显著升高(P<0.01),2.50μg/ml姜黄素预处理组ROS水平显著低于单独AA处理组(P<0.01)。结论姜黄素对AA所致HepG2细胞DNA损伤具有保护作用。     

彗星试验检测甲醛对V79细胞的DNA交联作用

目的研究甲醛对V79细胞DNA的交联作用,探讨甲醛的遗传毒性及机制.方法以紫外线照射作为标准断裂剂,用彗星试验检测不同浓度、不同暴露时间甲醛诱导的V79细胞DNA的交联作用.结果除75 μmol/L组外,在其它4个浓度组、3个染毒时间点,甲醛均可引起显著的DNA交联作用,彗星尾长和彗星细胞率显著低于仅紫外线照射的对照组(P<0.01),且彗星尾长具有明显剂量-反应关系(P<0.01).细胞暴露在甲醛中2、4 h,150、300、600 μmol/L浓度组彗星尾长和彗星细胞率显著低于暴露在1 h的(P<0.01).结论甲醛是一种DNA交联剂,具有诱导V79细胞DNA交联的作用,DNA交联的作用可作为甲醛致机体影响的生物标志物.     

60Coγ-射线诱导人膀胱癌EJ细胞中磷酸化组蛋白H2AX焦点形成

目的探讨^60Coγ-射线是否可在人膀胱癌EJ细胞中诱导磷酸化组蛋白H2AX焦点形成以及形成的焦点数量与照射剂量及照射后时间的关系。方法免疫印迹法和流式细胞分析法用于检测不同剂量^60Coγ-射线照射后脚细胞中γH2AX蛋白表达的变化；免疫荧光法检测不同剂量照射后以及2Gy照射后不同时间日细胞中γH2AX焦点的数量。结果γ-射线照射后γH2AX蛋白表达明显增加，但量效关系不明显；免疫荧光法可检测γH2AX焦点形成的数量和大小，并且存在剂量-效应关系及有时间依赖性，随着照射剂量的增加，γH2AX焦点数目及大小均明显增加，照射的剂量范围从0．1～4．0Gy均可检测，照射后24h仍可检测到γH2AX焦点，但焦点数随时间延长而减少、减弱。结论免疫荧光法检测照射后γH2AX焦点数目可敏感、直观地反映DNA损伤及修复情况，有望成为辐射检测及辐射致癌的好的生物指标。     

苯并（a）芘致人支气管上皮细胞DNA损伤及与组蛋白H2A单泛素化水平的关系

[目的]通过体外细胞培养途径,探讨苯并（a）芘（benzo[a]pyrene,B[a]P）作用下人支气管上皮细胞（16HBE）DNA损伤与组蛋白H2A单泛素化表达水平的关系。[方法]取对数生长期16HBE细胞,采用2μmol/L B[a]P染毒不同时间（0、1、2、4、8、12、24、48h）进行实验,用碱性单细胞凝胶电泳实验检测细胞DNA损伤水平,并以Olive尾矩值（olivetail moments,OTM）评价DNA损伤程度;用Western-blot法检测组蛋白H2A单泛素化水平。[结果]单细胞凝胶电泳结果显示：2μmol/L B[a]P染毒不同时间时,随着染毒时间的延长,各染毒组细胞DNA损伤程度均明显增高,与对照组相比,差异均有统计学意义（P〈0.01）;Western-blot结果显示：2μmol/L B[a]P染毒不同时间时,与对照组相比,组蛋白H2A的单泛素化水平增高,且在染毒2h后,差异有统计学意义（P〈0.01）;回归分析显示,单泛素化H2A的表达水平与DNA损伤程度存在高度相关,决定系数（R2）为0.910,P〈0.01。[结论]B[a]P染毒致16HBE细胞DNA损伤与组蛋白H2A单泛素化水平之间存在密切关系。     

辐射对沉默ATRX的H460细胞增殖以及DNA损伤修复的影响

目的 探讨辐射对沉默ATRX的肺癌H460细胞增殖和DNA损伤修复的影响及二者的关系。方法 靶向ATRX的3个慢病毒载体转染293T细胞后,慢病毒感染H460细胞,获得ATRX低/无表达的细胞株shATRX1-H460、shATRX2-H460和shATRX3-H460,并以shControl-H460作为对照,利用Western blot检测沉默效率。分别以克隆形成实验检测细胞增殖,免疫荧光技术检测γH2AX和Rad51焦点数,同时以Western blot检测PARP1、γH2AX和Rad51蛋白的表达。结果 shControl-H460细胞中可见ATRX表达,而shATRX1-H460、shATRX2-H460和shATRX3-H460细胞中ATRX表达均出现不同程度的降低。克隆形成实验显示,shATRX2-H460和shATRX3-H460细胞的存活分数（survival fraction,SF）均较shControl-H460细胞降低。shControl-H460和shATRX3-H460细胞经4 Gy照射后1 h,γH2AX焦点最多,而3 h时Rad51焦点最多,而后均降低,与shControl-H460细胞比较,在1和6 h时shATRX3-H460细胞γH2AX焦点,以及1、3和6 h时Rad51焦点显著增加（P<0.05,P<0.001）。而且shATRX3-H460细胞中PARP1、γH2AX和Rad51蛋白在3和6 h时均较shControl-H460细胞表达增加。结论 成功地获得靶向沉默ATRX的细胞模型,辐射后细胞增殖能力降低,可能与DNA损伤修复能力降低有关。     

甲醛致V79细胞氧化损伤研究

为探讨甲醛的氧化应激损伤效应,采用V79细胞株作为实验材料,以0、50、100、200、400、800、1600 μmol/L的液态甲醛对细胞染毒,1 h后按照试剂盒说明书检测细胞总超氧化物歧化酶(SOD)活力、总一氧化氮合酶(NOS)活力以及丙二醛(MDA)含量.实验表明,液态甲醛可以使V79细胞的总SOD活力和总NOS活力呈现下降趋势,200μmol/L及以上浓度组与对照组相比下降更为显著(P＜0.05),而MDA含量则呈上升趋势,400μmol/L及以上浓度组与对照组相比升高更加明显(P＜0.05).本实验条件下,较高浓度的甲醛可以导致细胞的氧化应激损伤.     

甲醛对V79细胞DNA损伤的实验研究

目的探讨甲醛（FA）的DNA损伤机制。方法应用单细胞凝胶电泳技术研究不同浓度FA对V79细胞（中国仓鼠肺成纤维细胞）的DNA损伤程度,以及剂量依赖关系。结果单细胞凝胶电泳结果显示,在不同浓度FA（100～1 600μmol/L）彗星细胞拖尾率、尾长及头/尾比随着浓度的增加而减少,且差异具有统计学意义（P〈0.01）;特别是在1 600μmol/L时在图片中未见有彗星细胞出现,其显示的DNA损伤类型是DNA-蛋白质交联;但是FA的浓度与拖尾细胞率、尾长及头/尾比之间不存在线性关系。结论该研究结果认为,在体外培养条件下,一定浓度的FA能够引起细胞DNA损伤,主要表现为DNA-蛋白质交联。     

液态甲醛对HepG_2细胞增殖影响及DNA损伤效应

为探讨液态甲醛致HepG2细胞增殖的抑制情况和DNA损伤效应,以HepG2细胞作为试验材料,甲醛染毒浓度分别为0(对照)、200、400、800、1600μmol/L。采用MTT试验检测甲醛暴露24h对HepG2细胞的抑制率,并计算半数致死浓度(IC50)。采用彗星试验检测甲醛暴露12h对HepG2细胞的DNA损伤效应。结果显示,200、400、800、1600μmol/L甲醛染毒组细胞抑制率分别为38.03%,46.01%,50.28%,73.65%,具剂量依赖性,IC50为484.59μmol/L。彗星试验结果显示,与对照组比较,200、400、800μmol/L甲醛染毒组彗星细胞率和彗星细胞尾长均较高,差异有统计学意义(P0.05或P0.01)。随着甲醛染毒剂量的增高,彗星细胞率及彗星细胞尾长均先升高后降低,且在400μmol/L甲醛染毒组达到峰值。此外,1600μmol/L甲醛染毒组彗星细胞率和尾长与对照组比较,差异无统计学意义(P0.05)。表明甲醛暴露对HepG2细胞的抑制具浓度依赖性。低浓度甲醛主要引起细胞DNA分子断裂,高浓度甲醛主要引起细胞DNA发生交联。     

铅致人淋巴细胞DNA双链断裂作用的人群调查和体外试验

目的 用γH2AX识别抗体流式细胞术研究铅暴露致人体外周血淋巴细胞DNA双链断裂(DSBs)作用.方法 选取某蓄电池厂工人36人为铅接触组,其中高浓度组15人,低浓度组21人;同时选择厂外无职业性铅接触70人为对照组,取外周静脉血提取淋巴细胞,利用流式细胞术检测γH2AX,分析淋巴细胞中DNA DSBs水平;不同剂量、时间下醋酸铅染毒健康人外周血淋巴细胞,利用流式细胞术检测γH2AX,分析淋巴细胞中DNA DSBs水平.结果 高浓度铅接触组DNA损伤率和平均荧光强度分别为41.76％±28.57％、9.90±3.35,低浓度铅接触组分别为33.18％±30.64％、9.39±4.83,均高于对照组(分别为0.28％±0.28％、6.95±2.93),差异均有统计学意义(P＜0.05).体外试验结果显示,染毒1和2h时,除62.5 μmol/L外,125.0、250.0、500.0 μmol/L醋酸铅染毒组DNA损伤率与阴性对照组的差异均有统计学意义(P＜0.01).随着染毒剂量的增高,DNA损伤率呈现先增高后降低的趋势.结论 铅可致人淋巴细胞DNA DSBs,流式细胞术检测γH2AX是一种值得运用于检测大样本DNA DSBs水平的方法.     

低浓度氢醌的细胞毒性及DNA损伤作用

目的了解氢醌(HQ)细胞毒性及DNA损伤作用,探讨HQ遗传毒作用的机制。方法用噻唑蓝(MTT)法检测低浓度HQ对中国仓鼠肺成纤维细胞(V79细胞)作用2 h后,细胞的增殖抑制作用;用单细胞凝胶电泳技术(SCGE)检测不同浓度HQ处理V79细胞2 h后DNA的损伤情况,并观察修复2 h和4 h后彗星图像的变化。结果HQ对V79细胞生长产生明显抑制作用,并呈剂量反应关系。单细胞凝胶电泳结果显示,在设置的5个浓度范围内,彗星细胞拖尾率随着浓度的增加而增加,且有统计学意义(P<0.01);在0.405 mmol/L浓度组,尾长、Olive尾矩、彗星矩和尾/头长4个彗星损伤形态学指标随着修复时间的延长而逐渐降低,其差异有统计学意义(P<0.01)。结论在体外培养条件下,低浓度HQ能明显抑制V79细胞的增殖并呈浓度依赖关系,并能引起DNA损伤,主要是单链断裂,这种损伤部分可自身修复。