RNA干扰Slug基因对HCT116细胞裸鼠移植瘤生长及转移的影响

目的：探讨通过靶向RNA干扰（RNA interference,RNAi）抑制Slug基因的表达,观测对荷瘤裸鼠结直肠癌生长及转移的影响。方法：利用结肠癌细胞株HCT116对24只5周龄裸鼠皮下种植,建立结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型,设立空白对照组、阴性对照组及实验组三组,每组8只。分别注射生理盐水、阴性对照质粒及慢病毒载体,观察肿瘤生长情况,绘制肿瘤生长曲线,观察各组间肿瘤生长及淋巴结转移的变化,应用免疫组化、qRT-PCR和Western blot检测Slug基因和蛋白表达情况。结果：Slug基因shRNA实验组与空白对照组和阴性对照组相比,瘤体生长减缓,移植瘤质量明显减小（3.08±0.31 vs 7.37±1.18,7.46±1.16,P＜0.01）,Slug蛋白表达明显降低（P＜0.05）;实验组淋巴结阳性率为36.3％（4/11）,与阴性对照组77.8％（14/18）及空白对照组68.4％（13/19）相比较（P＜0.01）。结论：靶向Slug的RNA干扰可以显著抑制结肠癌裸鼠模型的生长、淋巴结转移以及癌组织中Slug基因蛋白的表达,可能成为结肠癌基因治疗的潜在分子靶点。     

HOXB7 siRNA表达载体在裸鼠体内对人恶性黑色素瘤细胞株的影响

目的探讨转染同源盒第7基因(HOXB7)siRNA质粒表达载体对人恶性黑色素瘤细胞株A375在裸鼠体内生长的影响。方法裸鼠皮下接种人恶性黑色素瘤A375细胞,对2周后形成的瘤块进行分组干预。随机分为生理盐水对照组、阴性质粒组、HOXB7质粒组,观察转染后各组裸鼠移植瘤的生长情况;免疫组化法比较瘤体内微血管密度(MVD)。结果HOXB7质粒组的裸鼠移植瘤块生长慢、体积明显小于生理盐水对照组[(0.134±0.039)cm3比(1.006±0.235)cm3,P<0.05],而阴性质粒组瘤块体积大小与生理盐水对照组无统计学差异[(0.929±0.157)cm3比(1.006±0.235)cm3,P>0.05]。HOXB7质粒组裸鼠体内肿瘤MVD低于生理盐水对照组[(2.8±1.9)比(19.9±5.6),P<0.05],阴性质粒组与生理盐水对照组无统计学差异[(18.1±5.5)比(19.9±5.6),P>0.05]。结论针对HOXB7siRNA质粒表达载体可有效抑制A375细胞裸鼠体内肿瘤生长和瘤内血管生成。     

HOXB7 siRNA表达载体在裸鼠体内对人恶性黑色素瘤细胞株的影响

目的 探讨转染同源盒第7基因(HOXB7)siRNA质粒表达载体对人恶性黑色素瘤细胞株A375在裸鼠体内生长的影响.方法 裸鼠皮下接种人恶性黑色素瘤A375细胞,对2周后形成的瘤块进行分组干预.随机分为生理盐水对照组、阴性质粒组、HOXB7质粒组,观察转染后各组裸鼠移植瘤的生长情况;免疫组化法比较瘤体内微血管密度(MVD).结果 HOXB7质粒组的裸鼠移植瘤块生长慢、体积明显小于生理盐水对照组[(0.134±0.039)cm3比(1.006±0.235)cm3,P＜0.05],而阴性质粒组瘤块体积大小与生理盐水对照组无统计学差异[(0.929±0.157)cm3比(1.006±0.235)cm3,P＞0.05].HOXB7质粒组裸鼠体内肿瘤MVD低于生理盐水对照组[(2.8±1.9)比(19.9±5.6),P＜0.05],阴性质粒组与生理盐水对照组无统计学差异[(18.1±5.5)比(19.9±5.6),P＞0.05].结论 针对HOXB7 siRNA质粒表达载体可有效抑制A375细胞裸鼠体内肿瘤生长和瘤内血管生成.     

受翻译调节的肿瘤蛋白在PRL-3促进结肠癌转移中的作用

目的: 研究受翻译调节的肿瘤蛋白(TCTP)在肝再生磷酸酶-3(PRL-3)促进结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用。方法: 构建载体pAcGFP-C3-PRL-3及pAcGFP-C3并分别转染至结肠癌LoVo细胞中,获得稳定表达PRL-3的LoVo-PRL-3细胞及对照细胞LoVo-control。Western blotting及real-time PCR 检测2种细胞PRL-3及TCTP表达。设计并合成特异性干扰TCTP mRNA的siRNA序列(TCTP-siRNA)和阴性对照序列(control-siRNA),并将siRNA瞬时转染至LoVo-PRL-3细胞。 在转染siRNA后24 h、48 h和72 h,Western blotting及real-time PCR 检测LoVo-PRL-3细胞TCTP表达。 CCK8-8和Transwell方法检测LoVo-control、LoVo-PRL-3及转染TCTP-siRNA和转染control-siRNA的LoVo-PRL-3细胞间增殖、迁移和侵袭能力差异。结果: 转染PRL-3可以显著上调LoVo细胞TCTP mRNA和蛋白的表达(P＜0.05)。TCTP-siRNA在转染后的24 h、48 h和72 h可以有效抑制LoVo-PRL-3细胞TCTP mRNA表达(P＜0.01),同样TCTP蛋白在转染后的48 h和72 h也显著受到抑制(P＜0.01)。转染PRL-3能显著促进LoVo细胞增殖、迁移和侵袭能力(P＜0.05),然而siRNA干扰抑制上调的TCTP表达后又能显著抑制LoVo-PRL-3细胞增殖、迁移和侵袭能力(P＜0.05)。结论: PRL-3通过上调TCTP表达促进结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭。用siRNA靶向抑制TCTP表达可能是预防和治疗结肠癌转移的有效手段。     

干扰IDH-2基因对小细胞肺癌生长抑制作用的研究

 目的：研究siRNA特异干扰沉默异柠檬酸脱氢酶2（IDH-2）基因后对人小细胞肺癌细胞NCI-H446生长作用的影响。方法：用siRNA沉默NCI-H446细胞的IDH-2基因表达,用real-time PCR及Western blotting技术检测mRNA-IDH-2和蛋白的表达;CCK-8法测定细胞生长抑制,Western blotting检测MAPK p42的表达和流式细胞术检测细胞周期;用Transwell细胞迁移系统检测siRNA-IDH-2对NCI-H446细胞迁移能力的影响;将转染siRNA-IDH-2、阴性对照siRNA的细胞或未转染细胞皮下接种于BALB/c裸鼠背部,观察移植瘤的生长状况。结果：siRNA-IDH-2有效沉默NCI-H446细胞中IDH-2的表达;与对照组相比,下调IDH-2基因表达抑制NCI-H446细胞的增殖;MAPK p42蛋白表达下降且S期细胞明显增加;下调IDH-2基因显著抑制了NCI-H446细胞的迁移能力;体内实验显示siRNA-IDH-2组的肿瘤体积明显小于对照组。结论：siRNA-IDH-2能显著抑制IDH-2基因在人小细胞肺癌细胞NCI-H446中的表达,并降低细胞迁移效率,在体外和体内明显抑制NCI-H446细胞的生长。     

昆明山海棠总生物碱对人结肠癌HCT116细胞裸鼠皮下移植瘤生长的影响

目的观察昆明山海棠总生物碱(total alkaloids oftripterygium hypoglaucum hutch,THHta)对人结肠癌HCT116细胞裸鼠皮下移植瘤生长的影响。方法18只Balb/c裸鼠建立人结肠癌HCT116细胞皮下移植瘤模型,瘤体积增至约100mm3时,随机分为对照组、THHta-1(100mg/kg)和THHta-2(200mg/kg)组,实验期间观测皮下移植瘤生长情况及裸鼠体重的变化,计算肿瘤相对增殖率及瘤重抑制率;取肿瘤组织及肝、脾、肾等行病理组织学检查;免疫组化法检测增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen,PCNA)在肿瘤组织中的表达。结果THHta-1组和THHta-2组裸鼠肿瘤体积和重量显著降低,平均抑瘤率为60.4%和80.2%,治疗第21天两组相对肿瘤增殖率均<40%;THHta-1组和THHta-2组肿瘤组织中PCNA阳性细胞率显著低于对照组(P<0.01)。THHta致裸鼠体重减轻但裸鼠肝、脾、肾等组织未见明显病理学改变。结论THHta抑制人结肠癌HCT116细胞裸鼠皮下移植瘤生长,具有体内抗结肠癌活性,其作用...     

p75NGFR对胰腺癌细胞株SW1990生物学行为的影响

目的通过体内和体外实验,探讨p75NGFR在胰腺癌SW1990细胞生长、分化以及侵袭中的作用。方法采用脂质体转染法将含p75NGFR的真核表达质粒转染人胰腺癌细胞株SW1990,建立稳定表达p75NGFR的细胞模型;应用MTT法、平板克隆形成实验以及流式细胞技术分别检测细胞的生长曲线、克隆形成能力以及细胞周期变化;建立胰腺癌的裸鼠皮下移植瘤和胰腺原位移植瘤模型,观察p75NGFR对SW1990细胞裸鼠成瘤能力、肿瘤组织学分化、细胞侵袭和转移的影响。结果与对照组相比较,转染p75NGFR的SW1990细胞其生长速度缓慢（P〈0.01）,克隆形成能力降低（P〈0.05）;转染细胞的细胞周期改变表现为G1期细胞明显增多和S期细胞明显减少（均为P〈0.01）。与对照组相比较,转染组裸鼠皮下以及胰腺原位的成瘤率以及肿瘤体积减小（P〈0.01）,肿瘤的生长缓慢,组织学分化差,浸润性生长趋势不明显,未见肿瘤卫星现象。结论体外实验均发现p75NGFR通过阻滞细胞周期进程而显著抑制胰腺癌细胞株的生长,体内研究发现p75NGFR可抑制裸鼠皮下及胰腺原位移植瘤的形成、分化和侵袭,提示p75NGFR与胰腺癌的生物学行为密切相关。     

shRNA沉默β-catenin基因表达对人食管癌细胞生物学特性的影响

目的 构建稳定抑制β-catenin表达的食管癌细胞克隆,观察shRNA介导的β-catenin基因沉默对人食管癌细胞生物学特性的影响,为以β-catenin为靶的食管癌基因治疗提供理论和实验依据.方法 通过细菌转化、酶切、测序鉴定和基因重组等方法构建针对β-catenin的RNA干扰质粒pGen-3-CTNNB1和阴性对照质粒pGen-3-con.利用脂质体介导转染技术转染人食管癌细胞系Eca-109,经G418筛选得到稳定抑制β-catenin表达的食管癌细胞模型(pGen-3-CTNNB1细胞);逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、细胞免疫荧光和Western blot检测RNA干扰组(pGen-3-CTNNB1)、阴性对照组(pGen-3-con)及未转染组(Eca-109)3组细胞中β-catenin的表达;建立裸鼠皮下移植瘤模型,观察抑制β-catenin表达在活体内对肿瘤细胞生长能力的影响,免疫组织化学检测移植瘤组织中β-catenin的表达水平;体外浸润实验、迁移实验检测各组细胞的侵袭转移能力.结果 成功构建了针对β-catenin基因的RNA干扰载体pGen-3-CTNNB1,建立了稳定抑制β-catenin基因表达的食管癌细胞模型;与阴性对照组[(1.18±0.13)g]和未转染组[(1.38±0.21)g]比较,RNA干扰组[(0.42±0.09)g]移植瘤重量明显减轻(P＜0.05);瘤组织中β-catenin的表达水平明显降低;抑制β-catenin基因表达后,食管癌细胞的浸润能力显著降低,阴性对照组浸润细胞数为(81±5)个/HPF、未转染组为(77±6)个/HPF、RNA干扰组为(41±4)个/HPF(P＜0.01);迁移能力也显著下降,阴性对照组迁移细胞数为(73±5)个/HPF、未转染组为(69±5)个/HPF、RNA干扰组为(38±4)个/HPF(P＜0.05).结论 在人食管癌细胞Eca-109中存在β-catenin表达异常和Wnt信号通路的异常激活,抑制β-catenin基因的表达可以在裸鼠体内显著抑制食管癌细胞的生长,并降低其侵袭转移的能力.     

siRNA对VEGF蛋白表达的影响及对裸鼠移植肾癌的抑制作用

目的探讨siRNA沉默血管内皮生长因子（VEGF）基因对人肾癌裸鼠移植瘤VEGF蛋白的表达水平及生长抑制作用的影响。方法化学合成针对VEGF的siRNA序列,通过脂质体将VEGF-siRNA转染到ACHN细胞中,将转染VEGF-siRNA的ACHN细胞（A组）、转染空质粒的ACHN细胞（B组）及未转染的ACHN细胞（C组）分别接种于裸鼠背部皮下。在SPF环境中饲养裸鼠并观察各组裸鼠移植瘤的生长情况,每隔5d测定移植瘤体积大小（肿瘤的长轴L,短轴W,肿瘤体积V=1/2LW2）,绘制肿瘤生长曲线,采用免疫组化及Western blot法测定裸鼠移植瘤组织切片中VEGF蛋白的表达水平。结果 A组小鼠移植瘤成瘤及生长明显缓慢,移植瘤的体积和质量均低于B、C组,差异有统计学意义（P〈0.05）;移植瘤组织切片免疫组化及Western blot法检测结果提示：与B、C组相比,A组中VEGF蛋白表达量降低,差异有统计学意义（P〈0.05）;而B、C组间瘤体的体积重量及VEGF蛋白表达差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论 VEGF在肾癌的发生、发展中起着重要作用,化学合成的VEGF-siRNA可特异性抑制肾癌细胞中VEGF的表达,抑制肿瘤的生长增殖。     

Effect of shRNA targeted against RhoA on proliferation and migration of human colonic cancer cells

Objective: To study the effects of RhoA siRNA on the malignant phenotypes of human colorectal cancer cell line LoVo. Methods: The siRNA expression vector pGPU6/GFP/Neo-shRNA-RhoA targeting the mRNA of RhoA and vector pGPU6/GFP/Neo-NC (as a control) were constructed, and then transfected into LoVo cells. The expression of Survivin was detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction and Western blot. The malignant phenotypes of transfected LoVo cells, including invasive activities and adhesive capabilities, were analyzed. Results: RhoA mRNA and protein level were decreased after the pshRNA-RhoA transfection. The cell adhesion rates significantly decreased in the cells transfected with pshRNA-RhoA. The migrating number of LoVo cells (26.5 ± 0.9) transfected with pshRNA-RhoA was also significantly decreased as compared with the control group (53.7 ± 1.4). Conclusions: The sequence specific shRNA against RhoA constructed in the study can block the expression of RhoA in LoVo cell effectively and specifically; Blocking the expression of RhoA in LoVo cells transfected with pshRNA-RhoA can reduce their invasive and adhesive capabilities.     

siRNA特异性沉默septin 2基因抑制大肠癌LoVo细胞迁移

目的:检测新型骨架蛋白septin2在不同转移能力的人结直肠癌细胞株中的表达水平,探究其在结直肠癌细胞迁移中的作用。方法:采用实时荧光定量RT-PCR及Westernblotting检测septin2基因及其蛋白在高转移潜能细胞株LoVo和低转移潜能癌细胞株HT-29、SW480、HCT-116中的表达;用siRNA干扰方法沉默高表达的septin2基因,实时荧光定量RT-PCR检测干扰效率,免疫荧光共聚焦实验观测干扰前后septin2蛋白表达的变化,划痕实验检测干扰前后细胞的迁移能力。结果:septin2在LoVo细胞的表达水平显著高于HT-29、SW480及HCT-116细胞(P<0.05)。沉默septin2基因后,LoVo细胞septin2mRNA表达降低(P<0.05);septin2与纤维状肌动蛋白(F-actin)存在共表达;F-actin表达减弱,应力纤维减少,片状伪足细而短;细胞迁移能力减弱。结论:septin2基因在LoVo细胞高表达,干扰其表达能导致细胞骨架重构,从而降低细胞迁移能力。     

ST6Gal I 基因特异性siRNA对SW480细胞黏附和侵袭力的影响

目的:探讨人α-2,6-唾液酸转移酶(ST6GalI)小分子干扰RNA(siRNA)对ST6GalI高表达的结肠癌SW480细胞株的黏附和侵袭力的影响。方法:设计并合成ST6GalI靶向的siRNA,用脂质体Lipofectamine2000包裹后转染SW480细胞。实验设空白对照组、脂质体对照组、非特异性siRNA组和ST6GalIsiRNA组,采用RT-PCR测定细胞中ST6GalImRNA表达水平,流式细胞术检测细胞表面α-2,6-唾液酸含量,并分别用CytoMatrixTM细胞黏附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒,检测细胞对细胞外基质(ECM)黏附与侵袭力。结果:与空白对照组、脂质体对照组、非特异性siRNA组相比,转染48h后,ST6GalIsiRNA组细胞中ST6GalImRNA表达明显下调;转染72h后,ST6GalIsiRNA组细胞表面α-2,6-唾液酸的含量及细胞对ECM的黏附和侵袭力均明显低于其他3个对照组(P<0.05)。结论:化学合成的靶向ST6GalI的siRNA能够下调SW480细胞中ST6GalI基因的表达,降低细胞对ECM的黏附和侵袭力。本实验为进一步研究应用RNA干扰技术抗肿瘤治疗奠定基础。     

RNA干扰对宫颈癌细胞中E6AP基因的影响及其意义

目的 探讨RNA干扰(RNAi)对宫颈癌细胞系HeLa细胞E6AP基因表达及细胞增殖和凋亡的影响.方法 实验分为3组:空白对照组(未经转染的HeLa细胞)、转染阴性对照的小干扰RNA(siRNA)组及转染特异性E6AP siRNA组.采用半定量RT-PCR技术、Western blot方法 检测E6AP mRNA、蛋白表达水平,用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法检测细胞增殖状况,用流式细胞术检测细胞凋亡.结果 转染E6AP siRNA 24、48、72 h后,E6AP siRNA组E6AP mRNA表达水平与对照siRNA组比较下降33%、72%、70%.Western blot结果 显示,在转染48及72 h,E6AP蛋白表达下降38%、59%.MTT法检测显示,转染HeLa细胞24、48、72、96 h后细胞生长速度明显降低,E6AP siRNA组与空白对照组(F=101.38,P＜0.05)、对照siRNA组(F=38.64,P＜0.05)比较,差异均有统计学意义.E6AP siRNA作用24、48、72 h后E6AP siRNA组凋亡率明显高于对照siRNA组(F=41.48,P＜0.05)和空白对照组(F=86.36,P＜0.05),差异有统计学意义.结论 体外合成的siRNA能有效封闭宫颈癌细胞中E6AP基因的表达,抑制细胞增殖,促进细胞的凋亡,为宫颈癌的基因治疗提供理论依据.     

RNAi 结肠癌HOXB7 基因表达对癌细胞增殖及凋亡的机制研究

目的:探讨抑制HOXB7 基因表达对结肠癌细胞增殖凋亡的影响。方法:通LipofectamineTM2000 脂质体介导法将合成的阴性对照siRNA(阴性对照组)及HOXB7-siRNA(HOXB7 转染组)转染人结肠癌SW480 细胞,未经特殊处理的细胞为空白组。收集转染48 h 的细胞,RT-PCR 及Western blot 分别检测细胞中HOXB7 的mRNA 及蛋白表达;分别于转染后的24、48、72、96 h,CCK8 法检测细胞增殖;流式细胞仪检测转染后48 h 细胞的凋亡情况;Western blot 检测凋亡相关蛋白B 细胞淋巴瘤/ 白血病-2(Bc-2)、Bcl-2 相关X 蛋白(Bax)及Notch1 信号通路Notch1、Hes1 的蛋白表达。结果:HOXB7 转染组HOXB7 的mRNA 及蛋白表达均显著低于空白组(P<0.05);转染24 h 后三组细胞的OD 值间差异无统计学意义(P>0.05),48、72、96 h 后,与空白组比较,HOXB7 转染组OD 值均显著降低(P<0.05);与空白组比较,HOXB7 转染组细胞凋亡率显著升高,Bcl-2、Notch1、Hes1 蛋白显著下调表达,Bax 蛋白显著上调表达(P<0.05)。结论:RNAi 结肠癌HOXB7 基因表达可通过抑制Notch1 信号通路降低癌细胞的增殖,并诱导细胞凋亡。     

慢病毒介导的RNA干扰沉默Slug基因对结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默Slug基因,观察对结肠癌HCT116细胞增殖和周期的影响。方法:构建Slug基因特异性siRNA慢病毒载体,感染结肠癌HCT116细胞,设立空白对照组、阴性对照组及SlugsiRNA三组,应用Real-time PCR和Western blot方法分别从基因和蛋白质水平检测各组干扰质粒对Slug基因的干扰效果,MTT法检测Slug基因在siRNA作用下的细胞增殖率,流式细胞仪检测细胞凋亡周期变化情况。结果:转染Slug siRNA后,结肠癌HCT116细胞中Slug基因mRNA和蛋白表达明显受到抑制(P<0.05);MTT检测,干扰组细胞增殖水平明显低于阴性对照组;流式细胞仪检测细胞G1期细胞百分比(52.3±0.6)高于阴性对照组(45.1±0.3,P<0.05)。结论:Slug siRNA能明显下调靶基因Slug的表达,在体外可抑制结肠癌HCT116细胞的生长并促进其凋亡。     

KDR为靶的siRNA抑制乳腺癌细胞增殖的体内外研究

目的:采用化学修饰的小干扰RNA(siRNA)在体内外抑制含激酶插入区受体(KDR)基因表达,探讨化学修饰的siRNA介导的RNA干扰(RNAi)技术在乳腺癌基因治疗的可行性和特异性.方法:采用阳离子脂质体Lipofectamine2000TM作为转染试剂将针对人KDR基因的siRNA转染人类乳腺细胞株MCF-7,诱导RNAi,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法,RT-PCR,Western blot试验等检测KDR基因和蛋白表达及细胞增殖变化.采用阳离子聚合物纳米粒In vivo jetPEITM为转染试剂将siRNA直接注射进裸鼠移植瘤,监测肿瘤生长变化,RT-PCR,免疫组化方法等监测KDR基因和蛋白表达变化.结果:靶向KDR基因siRNA转染MCF-7后,细胞增殖被抑制,KDRmRNA和蛋白的表达明显降低;裸鼠体内实验显示siRNA治疗组瘤组织的增长受到明显抑制;RT-PCR,免疫组化结果同时表明治疗组KDR表达下调.各对照组指标无明显变化.结论:化学修饰的siRNA介导的RNAi在体内外均能成功抑制靶基因的表达和MCF-7细胞增殖,是潜在的肿瘤治疗新方法,而KDR亦可作为肿瘤治疗的新靶点.     

siRNA沉默fas基因减轻大鼠肝移植供肝冷保存和缺血再灌注损伤

目的：探讨针对fas的siRNA对大鼠原位肝移植供肝冷保存和缺血再灌注损伤的拮抗作用及机制。方法:（1）化学合成针对大鼠fas基因的3对siRNA，转染大鼠正常肝细胞(BRL细胞)，筛选抑制效果最高的siRNA序列。（2）对SD大鼠用水压注射法转染fas siRNA，48 h 后取肝，供肝冷保存2、4、6 h 后行细胞凋亡指数及fas表达检测。（3）对照组、fas siRNA组各25对SD雄性大鼠，供肝冷保存 3 h 后行原位肝移植,再灌注后1、3、6、12和 24 h 每组各处死5只大鼠，查血谷丙转氨酶(ALT)；取供肝查fas mRNA表达、Fas蛋白水平和细胞凋亡计数。结果:315位点的siRNA抑制BRL细胞fas基因效率最高。供肝冷保存实验中，fas　siRNA组冷保存2、4、6 h 的肝脏fas表达与细胞凋亡指数低于对照组（P<0.01）。大鼠肝移植复流后，fas siRNA组各检测点的fas基因表达、蛋白水平均明显低于、凋亡细胞少于、血清ALT低于对照组。结论:针对fas的siRNA对大鼠肝移植中的供肝冷保存和缺血再灌注损伤有一定的拮抗作用。