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目的构建抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)特异性单链抗体库,从中筛选抗EGFRvⅢ特异性单链抗体。方法用pep-3偶联载体蛋白OVA,然后免疫BALB/c小鼠从脾淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增重链(VH)和轻链(VL)的可变区基因片段。将两基因片段由编码(Gly4Ser)3的linker连在一起,并克隆入噬菌体展示表达载体pCANTAB5E中,电转化至E.coliTG1,经辅助噬菌体超感染,构建噬菌体单链抗体库。以pep-3-BSA为抗原对所建抗体库进行4轮亲和筛选,用ELISA鉴定抗体与EGFRvⅢ结合的特异性。结果经琼脂糖凝胶电泳分析,RT-PCR方法扩增的抗体VH和VL基因片段大小约350和320bp,与预期理论值相符。经重组PCR得到大小约780bp的ScFv基因片段。ScFv基因片段经双酶切后成功定向克隆到噬菌粒载体,回收后构建成库容量为5.0×106的噬菌体抗体库,噬菌体滴度为3.0×104pfu/ml。通过亲和筛选使抗EGFRvⅢ噬菌体单链抗体得到富集,第4轮为第1轮的56倍。在E.coliHB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。SDS-PAGE结果显示抗体相对分子... 相似文献
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目的 构建人源性胶质瘤噬菌体抗体库 .方法 经逆转录、套式PCR从脑胶质瘤患者血淋巴细胞中扩增出抗体轻链Vκ 和重链VH 基因 .先构建Vκ 基因库 ,并使连接Vκ 和VH基因的Linker与Vκ 基因连接 ,再将VH 基因克隆入Vκ 基因库 ,即构建成约为 3.5× 10 6 的单链抗体 (ScFv)基因库 .以Loxp5 11序列替代Linker序列 ,并将ScFv克隆入pDNA5内进行重组、鉴定 ,得到新的ScFv噬菌体抗体库 .结果 表明原初级噬菌体抗体库经Cre Loxp5 11系统重组后库容量达到 8.5× 10 8,部分测序证实抗体基因与人源性抗体基因数据库同源 .结论 利用体内重组系统明显提高了所建的抗体库容量 ,为进一步筛选特异性人源性抗脑胶质瘤ScFv奠定了基础 相似文献
3.
鼠抗脂多糖单链噬菌体抗体库的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 构建一个鼠源性的抗脂多糖 (Lipopolysaccharide ,LPS)单链噬菌体抗体库 ,以供进一步生物医学应用。方法 用纯LPS免疫BALB/c小鼠 4个星期后 ,从脾细胞中提取总RNA ,用RT PCR技术扩增出小鼠抗体重链、轻链可变区基因 (VH ,VL) ,然后用Linker将VH ,VL交联形成单链抗体可变区片段 (ScFv)。经NotI、SfiI双酶切后与经同样双酶切的pCANTAB5E噬菌粒载体相连 ,转化入感受态大肠杆菌TG1,构建鼠抗LPS单链噬菌体抗体库 ,并随机抽取转化后的 4个大肠杆菌TG1菌落 ,以检测外源DNA的转入情况。结果 ELISA法检测小鼠血清中抗LPS的效价为 1∶12 80 0。提取的总RNA浓度为 12 .3 813 μg/ml ,纯度较好。扩增出的VH长约 3 4 0bp ,VL长约 3 2 0bp ,ScFv长约 80 0bp。转化入TG1后有约 1.9× 10 7个菌落 ,抽提 4个菌落后经SfiⅠ、NotⅠ双酶切的结果显示有 1个菌落的质粒转化进了外源DNA片段。结论 成功地构建出了一个有效库容量为 4.75× 10 6的鼠抗LPS单链噬菌体抗体库。 相似文献
4.
目的构建人源噬菌体抗体库,从中筛选出抗PeroxiredoxinⅠ(PrxⅠ)肺腺癌人源单链抗体。方法提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH和VL连接得到单链抗体(ScFv);将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。PCR检测TG1中ScFv基因插入率;1%琼脂糖凝胶电泳鉴定SfiI和NotI双酶切质粒的结果;以肺腺癌细胞株D549及在肺癌中高表达的抗氧化蛋白PrxI为靶抗原对抗体库进行筛选富集。将阳性克隆用IPTG诱导表达。用SDS-PAGE及Westernblotting鉴定该抗体;用ELISA法、免疫细胞化学法鉴定该抗体与人肺腺癌细胞的结合特异性。结果成功构建噬菌体单链抗体库。ScFv基因插入率为77%,双酶切鉴定检测到目的条带。在亲和筛选过程中,肺癌单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第6轮为第1轮的180倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中6个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为60%。SDS-PAGE及Westernblottin... 相似文献
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大容量人天然噬菌体单链抗体库的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库。方法:从人外周血分离淋巴细胞,提取mRNA后用RT—PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段,两者分别与Linker连接后,采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体(scFv)基因(VH—Linker—VL片段),继而连接到噬菌粒载体pCANTAB5E中,连接产物通过电转化方法转入大肠杆菌TG1,构建噬菌体scFv抗体库。结果:所有VH、VL亚类基因都得到了扩增和有效的连接.经电转化E.coli TG1和噬菌体的超感染,构建了总库容达到了6×10^8的单链抗体库。结论:成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库,可用于制备具有应用前景的人源抗体。 相似文献
6.
目的获得胃癌单抗MGd1的噬菌体呈现型抗独特型抗体(抗-Id),为研制针对MGd1的抗-Id重组胃癌瘤苗创造条件.方法分离经单抗免疫鼠脾脏的mRNA,经RT-PCR分别扩增抗体VH和VL DNA,进而连接形成ScFv DNA.将ScFv DNA与载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经M13KO7挽救后获得噬菌体呈现型ScFv文库.以MGd1对文库进行4轮筛选后,随机挑取克隆经ELISA筛选呈现抗-Id ScFv的噬菌体单克隆,进而经竞争ELISA对其所属抗-Id类型进行初步鉴定.结果VH、VL和ScFv DNA分别约为340、320和750 bp.抗体ScFv文库经4轮筛选后,在随机筛检的40个克隆中得到17个呈现抗-Id ScFv的噬菌体单克隆.在17个克隆中,有3个呈现β或γ型抗-Id ScFv.结论应用噬菌体抗体库技术成功制备了针对单抗MGd1的抗-Id ScFv,从而为筛选新的胃癌重组抗-Id瘤苗奠定了基础. 相似文献
7.
目的 构建抗肝癌人源噬菌体单链抗体库.方法 体外致敏并用EBV转化肝癌患者的PBMC.用PCR分别扩增VH和VL基因并组成ScFv基因.将ScFv基因与载体连接后,转化大肠杆菌MC1061,构建噬菌体呈现型ScFv库.结果 经EBV转化的4例肝癌患者PBMC,ELISA检测均有抗肝癌抗体产生,经多次PCK,扩增出6种vH(γ、μ)和9种VL(κ、λ)基因,经连接组成54种ScFv基因.将ScFv基因与载体连接后.导入大肠杆菌MC1 061.经四环素抗性筛选,得到库容为1.0×108的初级噬菌体抗独特型抗体库,噬菌体DNA中全长ScFv基因的插入率为80%.结论 用体外致敏法结合噬菌体抗体库技术,制备全人源抗肿瘤单链抗体(ScFv),这一策略是完全可行的. 相似文献
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目的:构建人源噬菌体单链抗体ScFv基因文库,并从中筛选出抗肺癌抗体。方法:提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH 和VL连接得到单链抗体ScFv。将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。以肺腺癌细胞株A549为抗原对抗体库进行“吸附-洗脱-扩增”筛选富集,共进行4轮筛选,鉴定抗体库性能。结果:成功构建噬菌体单链抗体库。在亲和筛选过程中,肺癌单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第4轮为第1轮的115倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中7个与肺癌细胞呈阳性反应,阳性率为70%。结论:通过噬菌体展示技术得到肺癌相关人源单链抗体,筛选后的单链抗体能与肺腺癌细胞A549特异性结合。 相似文献
9.
胃癌单克隆抗体MG7的噬菌体呈现型抗独特型单链抗体ScFv的制备 总被引:6,自引:0,他引:6
目的 获得胃癌单克隆抗体(简称单抗)MG7的噬菌体呈现型抗独特型单链抗体ScFv(抗-Id ScFv),为研制MG7的抗-Id ScFv重组胃癌瘤苗奠定基础。方法 以MG7单抗与匙孔血蓝蛋白(KLH)的交联物免疫Balb/c小鼠,取脾分离mRNA。以逆转录聚合酶链反应技术分别扩增抗体重、轻链可变区基因(VH和VL),经linkerDNA连接ScFv基因片段。将ScFv DNA与噬粒载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1。在辅助噬菌体M13K07的作用下,获得重组噬菌体抗体ScFv。以单抗MG7对重组噬菌体抗ScFv进行四轮筛选后,随机挑取克隆,经噬菌体ELISA筛选抗-IdScFv单克隆,并对其所属抗-Id类型进行初步鉴定。结果 VH、VL和ScFvDNA分析约为340、320和750bp。经富集后,在随机筛检的60个克隆中得到24个噬菌体呈现型抗-IdScFv单克隆,阳性率为40%。在24个克隆中,有5个为β或γ型抗-IdScFv。结论 用噬菌体抗体技术能够成功地获得单抗MG7的抗-IdScFv,为开展用抗-IdScFv防治胃癌的研究创造了条件。 相似文献
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目的:构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库。方法:从人外周血分离淋巴细胞,提取mRNA后用RT-PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段,两者分别与Linker连接后,采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体(scFv)基因(VH-Linker-VL片段),继而连接到噬菌粒载体pCANTAB5E中,连接产物通过电转化方法转入大肠杆菌TG1,构建噬菌体scFv抗体库。结果:所有VH、VL亚类基因都得到了扩增和有效的连接,经电转化E.coliTG1和噬菌体的超感染,构建了总库容达到了6×10^8的单链抗体库。结论:成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库,可用于制备具有应用前景的人源抗体。 相似文献
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目的:应用噬菌体抗体展示技术,构建大容量天然人源甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma,MTC)噬菌体单链抗体库。方法:提取MTC病人癌周淋巴结总RNA,通过RT-PCR方法获得抗体可变区基因VH和VL基因片断,以它们为模板分别扩增VH-Linker和VL-Linker,再用剪切重叠延伸PCR技术将之拼接组装成单链抗体可变区基因片段(single chain fragment variable,scFv)后引入酶切位点SfiⅠ和NotⅠ。将scFv基因克隆入噬菌粒栽体pCANTAB-5E后经电转入大肠杆菌Ecoli TG1,之后经辅助噬菌体M13K07超感染,构建人源MTC噬菌体单链抗体库。PCR鉴定scFv片段阳性插入率,1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆双酶切产物。结果:MTC周围淋巴结总RNA的琼脂糖电泳结果可见清晰的28 S、18 S条带;VH基因的大小约为370 bp,VL基因为350 bp,组装后的scFv基因约为750 bp。用pUC19标准质粒测定转化效率达到108 cfu/μg,scFv的阳性插入率为87.5%(21/24)。结论:成功地构建了人源MTC噬菌体展示文库,为进一步筛选具有MTC细胞特异性的人源噬菌体单链抗体奠定了实验基础。 相似文献
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大库容量人源性天然单链抗体库的构建 总被引:3,自引:0,他引:3
目的:构建一个大库容量(>10^8)的人类天然单链抗体库。方法:从正常人400mL外周血分离林巴细胞,提取mRNA后反转录出cDNA第一链, 行半套式PCR扩增VH和VL基因片段,依次插入含Loxp和Loxp511序列的pDNA5,电转化TG1大肠杆菌,构建初级库进一步用初级库感染BS1365使其VH,VL发生重组从而获得次级库。结果:所有VH,VL亚类基因都得到了扩增,scFv克隆效率为99.9%,重组效率为每个单克隆BS1365中含至少8种不同的scFv基因。初级库容量为10^7,次级库容量至少为10^11。结论:我们采用细胞内重组的方法构建了10^11的人类天然抗体库。 相似文献
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目的:制备人源抗肺腺癌单链抗体(Single-chain variable fragment,scFv)基因文库.方法:利用肺腺癌患者癌旁淋巴组织提取总RNA,通过RT-PCR分别扩增VH和VL基因片断,再将经纯化的VH和VL基因片断通过"剪切重叠延伸PCR"(Splicingover-lapping extend PCR,SOE-PCR)而形成scFv基因片断.将scFv基因克隆入噬菌粒栽体pCANTAB-5E电转入Ecoli TG1.PCR法鉴定抗体基因插入率,1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆酶切产物.结果:肺腺癌周围淋巴结的提取总RNA琼脂糖电泳结果中可见清晰的28 S、18 S条带;VH基因的大小约为370 bp,VL基因为350 bp,组装后的scFv基因约为750 bp.PCR连接产物的转化效率为2.2×107 CFU/μg,scFv的阳性插入率为83.3%(20/24).结论:成功地构建了人源抗肺腺癌scFv基因片断,为进一步筛选人源抗肺腺癌scFv库提供了试验基础. 入噬菌粒栽体pCANTAB-5E电转AEcoh TG1.PCR法鉴定抗体基因插入率,1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆酶切产物. 果:肺腺癌周围淋巴结的提取总RNA琼脂糖电泳结果中可见清晰的28 S、18 S条带;VH基因的大小约为370 bp,VL基因为350 bp,组装后的scFv基因约为750 bp.PCR连接产物的转化效率为2.2×107 CFU/μg,scFv的阳性插入率为83.3%(20/24).结论:成功地构建了人源 相似文献
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目的:构建具有良好多样性的人尘肺病噬菌体单链抗体( ScFv)库.方法:收集25例尘肺病患者外周血标本共50 mL,密度梯度离心法分离淋巴细胞,Trizol法提取总RNA,逆转录后参考文献设计并合成半巢式PCR引物,扩增抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,Linker连接VH和VL,继而连接到噬菌体载体pCANT... 相似文献
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目的 构建A型流感病毒核蛋白全套单链抗体库。 方法 利用全套噬菌体抗体表面展示技术 ,从A型流感病毒核蛋白免疫的BALB/c小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA ,利用抗体可变区PCR混合引物进行全套抗体重、轻链基因的扩增。经重叠延伸反应 ,在体外随机装配成单链抗体。将其克隆到噬菌粒载体PCANTAB5E中 ,电转化TG1细菌 ,以辅助噬菌体M13 K0 7超感染噬菌体文库 ,构建全套ScFv抗体库。 结果 成功利用噬菌体表面展示技术 ,构建了A型流感病毒核蛋白全套单链抗体库 ,库容量达到 8 2× 10 7。 结论 构建全套A型流感病毒核蛋白全套单链抗体库 ,为利用亲和富集筛选技术 ,获得具有A型流感病毒核蛋白结合活性的完整重组噬菌体克隆奠定了基础。 相似文献
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目的:利用噬菌体展示技术,构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,筛选特异性的抗狂犬病毒糖蛋白人源单链抗体(scFv)并对其进行初步鉴定。方法:从接种狂犬疫苗的志愿者外周血中提取总RNA,RT-PCR扩增VH和VL基因,并利用重叠扩增PCR将VH和VL拼接为scFv。将纯化后的scFv克隆至噬菌体载体pComb3XSS构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,以狂犬病毒糖蛋白(RABVG)为抗原,从抗体库中筛选抗RABVG的scFv。通过phage-ELISA验证噬菌体单链抗体的结合特异性,将阳性克隆转化E.coliTOP10F′进行表达。结果:构建了人源抗狂犬病毒抗体库,抗体库的库容为3.29×109。经过5轮筛选,获得43株与RABVG特异结合的噬菌体单链抗体,其中15个A450值较高的克隆序列分析结果显示,有3个正确的单链抗体基因。单链抗体基因转化TOP10F′构建工程菌,表达纯化后的单链抗体,经ELISA检测能够与RABVG特异性结合。结论:从构建的人源免疫型抗狂犬病毒单链抗体库筛选出的能与RABVG特异性结合的scFv,为进一步制备抗RABVG的治疗性人源化抗体奠定了基础。 相似文献
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目的构建库容量大、多样性好的核糖体展示单链抗体(ScFv)库,为进一步筛选ScFv奠定基础。方法从健康自愿者的外周血淋巴细胞提取mRNA,经RT-PCR分别扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)DNA,进而连接形成ScFvDNA。将其连接T-Vector转化E.coliJM109大肠埃希菌,经蓝白筛选,挑取9个阳性克隆测序以鉴定ScFv组装。通过体外转录和翻译对抗体文库进行初步鉴定。结果VH、VL和ScFvDNA分别约为350、650和1100bp。本试验成功构建ScFv核糖体展示模板。结论成功构建天然的大容量核糖体展示人源性ScFv文库,为下一步利用亲和富集筛选技术获得各类ScFv奠定基础。 相似文献
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利用噬菌体抗体库技术 ,构建了多药耐药性肿瘤细胞相关噬菌体抗体库。以多药耐药性肿瘤细胞 KB- A1为免疫原免疫 Bal B/c小鼠 ,从其脾脏提取总 RNA,并分离出 m RNA。RT- PCR扩增出 VH 和 VL 基因 ,经重叠延伸反应组装成单链抗体 ( Sc Fv)。将其克隆入噬菌粒载体p CANTAB 5 E中 ,电转化 E. coli TG1 ,成功构建了库容为 0 .8× 1 0 6的噬菌体抗体库 ,为获得多药耐药性相关分子及肿瘤细胞特异的噬菌体抗体奠定了基础 相似文献
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抗肿瘤侵袭与转移单链抗体scFV-M97基因克隆及分泌性表达 总被引:6,自引:0,他引:6
目的研制抗肿瘤侵袭和转移的单链抗体.方法应用重组噬菌体抗体技术,从小鼠抗Ⅳ型胶原酶杂交瘤C2H5细胞中提取mRNA,构建单链抗体基因并克隆到噬粒pCANTAB5E中,转化大肠杆菌TG1,经M13KO7援救后,得到滴度为5×109pfu/ml单链抗体库.对抗体库进行一轮抗原固相化亲和富集与ELISA筛选鉴定,得到30株阳性噬菌体.结果 DNA序列分析表明,抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv-M97基因全长732 bp.其中VH 351 bp,编码117个氨基酸;VL 336 bp,编码112个氨基酸,两者以连接肽(Gly4Ser)3相连.阳性噬菌体转染HB2151细胞,经1 mmol/L IPTG诱导培养20 h,培养液上清中有2 μg/ml可溶性单链抗体.免疫印迹证实所表达产物保留了原亲本抗体的特异性和亲合力.结论单链抗体scFv-M97可分泌性表达,为以Ⅳ型胶原酶为靶点的抗肿瘤侵袭与转移的治疗及新型导向药物的研制奠定了基础. 相似文献
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抗人AFP单链抗体基因的构建和在大肠杆菌中的表达 总被引:3,自引:0,他引:3
目的 构建抗人 AFP单链抗体 (Sc Fv)的基因并转入大肠杆菌 BL - 2 1(DE3)中诱导表达。分离纯化Sc Fv并鉴定其生物活性。方法 用 RT- PCR方法从能分泌特异性抗人 AFP单克隆抗体的杂交瘤细胞中分离纯化抗体 VH和 VL基因。用重叠延伸 PCR方法将 VH和 VL拼接在一起 ,构建抗人 AFP单链抗体的基因。将 Sc Fv基因克隆至 p GEM- T载体构建 ,用限制性内切酶切以及测序鉴定。将 Sc Fv基因连接到 p ET32 (a )质粒 ,转化 BL - 2 1(DE3)细菌。抗性生长的克隆用异丙基硫代 -β- D-半乳糖苷 (IPTG)诱导 4 h。溶解细菌并纯化 Sc Fv,通过 SDS-PAGE电泳及竞争抑制 EL ISA实验检测其活性。结果 获得的 VH含 339bp,来自小鼠 Ig Gγ链 ,VL含 312 bp,来自小鼠κ链。 VH和 VL通过编码 (G4 S) 3连接肽的 4 5 bp序列连接在一起构成含 6 96 bp的 Sc Fv基因。 BL - 2 1(DE3)中表达的 Sc Fv抗体与融合蛋白 (Trx A)融合在一起并以包涵体的形式存在。 Trx A- Sc Fv相对分子质量约 4 0× 10 3,Sc Fv相对分子质量约 2 4× 10 3。竞争 EL ISA实验显示 :Trx A - Sc Fv可抑制 4 1%的 Mc Ab与抗原结合 ,而Sc Fv抗体则可抑制 5 3%的 Mc Ab与抗原结合。结论 我们成功构建了由 6 96个碱基组成的抗人 AFP单链抗体的基因 ,并在大肠杆菌获得了 相似文献