磷酸奥司他韦对上海及周边地区不同流行性感冒病毒亚型的体外抗病毒效果

目的 了解上海及周边地区近年来流行性感冒(流感)病毒流行株对磷酸奥司他韦的敏感度及是否存在耐药株.方法 从2004-2006年上海市、江苏省无锡市和浙江省德清县流感监测和暴发病例分离到的流感病毒中,随机抽取B型、H1亚型、H3亚型的部分流感病毒,用中性红吸收法在体外检测磷酸奥司他韦的抗病毒作用,以50%抑制浓度(IC50)表示药物的抗病毒效果.方差分析检验药物对各亚型流感株IC50的差异.结果 磷酸奥司他韦对研究使用的50株不同型和亚型流感病毒皆有抑制病毒感染细胞的效果,IC50均＜25 mg/L.药物对B亚型病毒的效果较差,IC50为19.97 mg/L(15.16～22.36 mg/L),高于A/H1N1亚型的8.15 mg/L(0.02～22.36 mg/L,P＜0.05)和A/H3N2亚型的10.92 mg/L(0.08～19.72 mg/L,P＞0.05);对于不同年份分离的流感病毒,药物效果有所变化.结论 磷酸奥司他韦对上海及周边地区的流感病毒具有较好的体外抗病毒效果,需要建立监测网络来监控药物的效果和病毒的耐药情况.     

肝脏细胞的分离、培养和鉴定技术

随着现代细胞学和分子生物学的研究进展，细胞的分离。培养和鉴定技术有了长足的进步，特别是在肝脏细胞的分离。培养和鉴定等方面有了很大的发展，这为深入研究肝脏的生理及病理生理提供了重要的实验方法［１］现将其最新进展作一综述１肝脏细胞的组成肝脏细胞由上皮细胞、间质细胞和其他细胞组成上皮细胞由肝细胞（约占６０％～７０％）和肝内胆管上皮细胞（２％～３％）组成２间质细胞包括枯否细胞（ｋｕｐｆｆｅｒｃｅｌｌｓ，ＫＣ）、肝窦内皮细胞（ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ，ＳＥＣ）、肝星状细胞（ｈ…     

犬肾传代细胞分离流行性感冒病毒致细胞病变的敏感性

目的 了解犬肾传代细胞系(MDCK)细胞对甲型流行性感冒(流感)患者鼻咽拭标本培养1代、2代、3代致细胞病变的敏感性.方法 甲型流感患者鼻咽拭标本在MDCK细胞盲传3代培养,倒置显微镜观察每代细胞致细胞病变效应产生情况.结果 经胶体金快速检测为甲型流感的279份流感样患者鼻咽拭标本,MDCK培养第1代产生致细胞病变为184份,占65.9%,第2代产生致细胞病变为255份,占91.4%,第3代产生致细胞病变为269份,占96.4%.279份标本的细胞培养液经多重RT-PCR检测鉴定为甲型流感病毒的有271份.结论 MDCK分离培养甲型流感患者鼻咽拭标本经盲传3代后,基本可达到95%以上的阳性分离率.     

2009年广东省甲型流行性感冒暴发流行期间首株甲型H1N1流行性感冒病毒血凝素基因分析

目的 检测和分析2009年广东省甲型流行性感冒(流感)暴发流行期间首株甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因.方法 对2009年广东省首例确诊的甲型H1N1流感患者的咽拭子进行病毒分离,取细胞培养上清液提取病毒核酸,采用HA基因的特异性引物进行RT-PCR,PCR产物进行克隆、测序和同源性分析.结果 获得2009年广东省首株甲型H1N1流感病毒的HA基因,大小为1710 bp,命名为A/GuangzhouSB/01/2009(H1N1)HA,GenBank登录号为GQ268003.与疫情发源地近期报告的277株甲型H1N1流感病毒的HA基因比对,同源性为99.0%～99.8%;其中与美国报告的病毒株的同源性高达99.8%,与患者发病前曾到美国旅游的流行病学史一致.与25株中国季节性甲型H1N1流感病毒的HA基因比对,同源性为72.3%～85.6%.结论 2009年广东省甲型流感暴发流行期间首株甲型H1N1流感病毒与目前流行的甲型H1N1流感病毒同源性高,与中国季节性甲型H1N1流感病毒同源性较低.     

胰岛β细胞的分离纯化与原代培养技术

胰岛β细胞是糖尿病研究的中心环节之一。目前体外研究胰岛β细胞的模型系统有两类，一是从胰岛β细胞瘤组织克隆产生的β细胞株，二是从活体胰岛组织分离纯化获取胰岛β细胞。国内利用细胞株作为研究模型者较多，而β细胞的体外原代培养尚未见研究报道。     

鼠肝Kupffer细胞的分离、培养和鉴定

目的:Kupffer细胞是固定于肝脏的吞噬细胞,Kupffer细胞的分离、培养对肝脏疾病发生机制中的有关细胞和分子生物学的研究具有重要意义。方法:用链霉蛋白酶和胶原酶原位灌流,Nycodenz密度梯度离心分离大鼠Ku-pffer细胞,再经贴壁培养,并应用免疫组织化学、吞噬功能试验、电镜等方法进行鉴定。结果:本法能成功地获得高纯度的Kapffer细胞,Kapffer细胞得率为3～5×10~6/肝,贴壁后呈典型的星形及多角形,免疫组化染色示溶菌酶阳性、胞浆内见吞噬的印度墨汁及乳胶珠颗粒,电镜观察细胞表面有发达的伪足、微绒毛,胞浆内含大量溶酶体及吞噬的乳胶珠颗粒。结论:本实验所用的Kupffer细胞分离培养方法简单易行、可靠、细胞纯度高,可用于进一步研究Ku-pffer细胞的生物学功能。     

应用空斑形成法检测五种不同细胞对肠道病毒71型的敏感性

目的:建立肠道病毒71型(EV71)的空班形成方法, 并比较BGM、VeroE6、MRC-5、HEp-2及A549五种细胞对EV71病毒的敏感性.方法:将不同稀释浓度的EV71病毒接种到五种细胞, 分别覆盖三种不同的培养物, 孵育一定时间后固定染色, 比较出斑效果;以新建空斑形成法测定五种细胞感染EV71 24-96 h后培养液滴度, 计算空班形成单位(pfu).结果:在五种细胞中, BGM和VeroE6覆盖琼脂糖凝胶的EV71可形成针尖样空班;覆盖1%甲基纤维素的EV71可形成直径大约1 mm圆形或类圆形空班, 形成空斑单位最多, 病毒滴度分别达2.87×109 pfu/L和1.65×109 pfu/L;覆盖1.2%艾维素的EV71在BGM细胞中可形成直径大约0.5 mm类圆形空斑, 在VeroE6细胞中形成针尖样空斑;其他细胞均形成针尖样空斑.结论:空斑形成方法可对肠道病毒进行定量检测, BGM及VeroE6细胞为EV71的敏感细胞.     

流行性感冒病毒激活Toll样受体7/核转录因子调控慢性阻塞性肺疾病急性加重气道炎症机制研究

目的探讨流行性感冒(流感)病毒激活Toll样受体7(TLR7)/核转录因子(NF)-κB调控慢性阻塞性肺疾病(COPD)急性加重气道炎症反应的分子机制。方法从手术标本中获取正常和COPD患者气管组织,分离、鉴定、培养出人原代气道上皮细胞,实验分6组,正常气道上皮细胞组(A组)、正常气道上皮细胞+A型流感病毒(IAV)组(B组)、COPD气道上皮细胞组(C组)、COPD气道上皮细胞+IAV组(D组)、正常气道上皮细胞+TLR7小干扰RNA组(E组)、COPD气道上皮细胞+TLR7小干扰RNA组(F组),分别与IAV、TLR7小干扰RNA共培养24 h后,免疫印迹(Western blot)法检测气道上皮细胞TLR7、NF-κB蛋白表达,酶联免疫吸附(ELISA)法检测细胞上清液中白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子α(TNFα)水平。结果与A组比,B组、C组和D组TLR7蛋白表达(A组0.350±0.075,B组0.950±0.075,C组0.780±0.056,D组1.280±0.031)、NF-κB蛋白表达(A组0.470±0.034,B组1.090±0.078,C组0.910±0....     

肠道病毒71型感染UT-SCC-60A对细胞周期阻滞和细胞凋亡发生的研究

目的研究肠道病毒71型感染人扁桃体上皮细胞UT-SCC-60A后对细胞周期阻滞和细胞凋亡发生情况。方法以人扁桃体上皮细胞UT-SCC-60A为细胞模型,CCK8试剂盒和流式细胞仪检测Ev71感染UT-SCC-60A后细胞增殖抑制率、凋亡发生和细胞周期阻滞情况。结果EV71对UT-SCC-60A呈现感染时间依赖性抑制,感染48h后抑制率达92.6%;不同剂量的EV71感染均能够显著抑制UT-SCC-60A增殖。EV71感染使UT-SCC-60A以剂量依赖性发生以早期凋亡为主的细胞凋亡,EV71以感染复数为0.5和1感染12h后,早期凋亡细胞比例分别为21.4%和27.1%。EV71感染UT-SCC-60A后使细胞周期阻滞在S期且G0/G1比例下降,EV71以感染复数为1感染12h后,S期比例由对照组的19.0%上升至31.1%,G0/G1期比例由59.8%下降至45.9%。结论Ev71通过使UT-SCC-60A发生S期阻滞来抑制细胞增殖且诱导以早期凋亡为主的细胞凋亡。     

Mixed cells in shell vials for detection of influenza viruses and enteroviruses from clinical specimens

Objective To evaluate shell vials of MHV,a combination of Madin-Darby canine kidney cells(MDCK),human epidermoid cancer cells(Hep-2) and African green monkey kidney cells(Vero), and conventional cell culture in detecting influenza viruses and enterovirus from     

骨髓间充质干细胞心肌样分化的微环境因素

目的:探讨促使骨髓间充质干细胞(MSCs)心肌样分化的微环境因素。方法:分离大鼠MSCs并传至第6代,随机分为混合培养组、条件组及对照组,分别将MSCs与大鼠心肌细胞共同培养(混合培养组),或将心肌细胞培养上清液加入MSCs培养体系(条件组)。1周后,检测MSCs的心肌特异性蛋白titin、Cx43及MHC表达情况。结果:MSCs能在心肌细胞培养上清液及与心肌细胞共同培养中正常生长;条件组MSCs表达titin、Cx43显著增加,但未观察到肌小节样结构;混合培养组MSCs可表达上述蛋白,且部分细胞中可观察到肌小节样结构,与心肌细胞交界面上有Cx43的聚集。3组MSCs均未检测到MHC表达。结论:心肌细胞自身、源于心肌的体液因素及MSCs分化过程中形成的感应器是MSCs心肌样分化的必要条件。     

大鼠脑组织上清液诱导脂肪来源干细胞分化为神经细胞的实验研究

目的 观察正常大脑、脑梗死对侧及梗死侧大脑脑组织上清液对脂肪来源干细胞(ADSCs)向神经元样细胞分化的影响.方法 取SD大鼠腹膜后脂肪组织进行ADSCs分离培养;用正常脑组织上清液、脑组织梗死侧及对侧脑组织上清液对ADSCs进行诱导,免疫荧光法检测神经细胞标志物的表达,荧光显微镜下观察细胞阳性率.结果 (1)脑梗死侧组诱导组神经元特异性烯醇酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达率均高于其他组(P＜0.05).(2)脑梗死对侧组及正常对照组诱导组NSE、MAP-2、GFAP表达率均高于未干预组(P＜0.05).结论 脑梗死侧及脑梗死对侧组织上清液均能诱导大鼠ADSCs分化为神经元样细胞,表达神经细胞标志物,但前者作用更为明显.     

The receptor preference of influenza viruses

Please cite this paper as: Meng et al. (2010) The receptor preference of influenza viruses. Influenza and Other Respiratory Viruses 4(3), 147–153. Objectives  The cell surface receptor used by an influenza virus to infect that cell is an N‐acetyl neuraminic acid (NANA) residue terminally linked by an alpha2,3 or alpha2,6 bond to a carbohydrate moiety of a glycoprotein or glycolipid. Our aim was to determine a quick and technically simple method to determine cell receptor usage by whole influenza A virus particles. Methods  We employed surface plasmon resonance to detect the binding of viruses to fetuin, a naturally occurring glycoprotein that has both alpha2,3‐ and alpha2,6‐linked NANA, and free 3′‐sialyllactose or 6′‐sialyllactose to compete virus binding. All virus stocks were produced in embryonated chicken’s eggs. Results  The influenza viruses tested bound preferentially to NANAalpha2,3Gal or to NANAalpha2,6Gal, or showed no preference. Two PR8 viruses had different binding preferences. Binding preferences of viruses correlated well with their known biological properties. Conclusions  Our data suggest that it is not easy to predict receptor usage by influenza viruses. However, direct experimental determination as described here can inform experiments concerned with viral pathogenesis, biology and structure. In principle, the methodology can be used for any virus that binds to a terminal NANA residue.     

应用Taq Man荧光定量RT-PCR快速检测肠道病毒的研究

目的建立一种快速、灵敏、特异的荧光定量RT-PCR检测肠道病毒的方法。方法根据GenBank中肠道病毒5′UTR序列,应用生物软件在保守区设计与筛选特异引物和TaqMan探针,对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性、敏感性和重复性。并通过对急性临床样本的检测,评价该方法的实际应用价值。结果该方法对肠道病毒包括脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型及柯萨奇病毒和埃可病毒等的检测有高度特异性,甲肝病毒、乙脑病毒、登革病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、诺如病毒等均呈阴性。该方法的检测下限达10-1TCID50/100μl。12份急性结膜炎病例结膜拭子标本中7份肠道病毒核酸阳性,普通RT-PCR方法5份阳性。结论TaqMan荧光定量RT-PCR方法快速、敏感、特异,适于肠道病毒的快速检测。     

人外周血内皮祖细胞的分离培养及鉴定

目的:从人外周血中分离培养内皮祖细胞(EPCs),并探讨其体外诱导培养的条件。方法:密度梯度离心法分离正常人外周血单个核细胞,置于鼠尾胶原包被的培养瓶中进行体外培养,流式细胞术和免疫荧光法检测分化细胞表面特异性抗原标记物的表达。结果:人外周血单个核细胞在鼠尾胶原包被的培养瓶中培养后呈梭形,并表达内皮细胞的特异性抗原CD34和KDR,和干/祖细胞抗原CD133。提示这些培养细胞既具有内皮细胞的表面标志和功能,又具有祖细胞特性。结论:成功从外周血中培养出EPCs。鼠尾胶原可取代EPCs培养中常用的纤维连接蛋白,是体外分离培养外周血EPCs的更节省的一种方法。     

培养人胎肝细胞的形态与功能研究

目的探讨人胎肝细胞分离与培养的简易方法．方法采用体外两步灌流法分离人胎肝细胞，选择条件培养液加以培养，并进行形态学和蛋白分泌功能的动态观察．结果用该法分离的肝细胞经台盼蓝拒染试验证实存活率在９５％以上，培养时间可达２周，并保持正常形态和良好的蛋白合成分泌功能．结论用酶灌流分离和条件培养的胎肝细胞性能良好，可用作肝细胞移植的供体．     

p75NTR蛋白体外通过TrkANGFR/p75NTR异源二聚体信号途径促进L02细胞增殖

目的 观察神经生长因子(NGF)及受体(TrkANGFR、P75NTR)在肝细胞中的表达,探讨外源性p75NTR蛋白对肝细胞的生物学作用.方法 体外培养L02肝细胞,免疫细胞化学和荧光定量PCR法分别检测NGF、TrkANGFR、P75NTR在L02细胞中的表达.XTT法检测外源性P75NTR、NGF、NGF－ P75NTR、抗TrkANGFR、抗p75NTR对L02细胞增殖的作用.流式细胞术(膜联蛋白V/碘化丙啶)检测外源性P75NTR对L02细胞凋亡的作用.流式细胞术(碘化丙啶)检测外源性p75NTR对L02细胞周期的影响.结果 P75NTR促进L02细胞增殖,呈剂量依赖性.NGF和NGF+ P75NTR组吸光度值(A)值分别为0.4916±0.0565和0.5839±0.0733,与阴性对照组比较差异有统计学意义(0.3601±0.0310,P＜0.05);抗TrkANGFRA值为0.2689±0.0229,与阴性对照组比较差异有统计学意义(P=0.003);抗P75 NTRA值为0.3524±0.0312,与阴性对照组比较差异无统计学意义(P=1.000).外源性P75NTR对L02细胞有抗凋亡趋势,加入100 ng/ml P75NTR抗凋亡作用最强,表达量为3.70±0.26,但与对照组比较差异无统计学意义(4.10±0.62,P=1.000).P75NTR作用于L02细胞周期的S期,呈剂量依赖性,呈倒置的U形曲线,浓度为100 ng/ml时作用最强(25.60±0.40),与对照组比较差异有统计学意义(20.10±1.00,P=0.000).外源性NGF、P75NTR、NGF+ P75NTR上调了L02细胞NGFmRNA、TrkANGFR mRNA、P75NTRmRNA的基因表达,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);抗TrkANGFR、抗P75 NTR对NGFmRNA、TrkANGFR mRNA、P75NTR mRNA的基因表达无明显影响,与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 L02细胞表达NGF及受体TrkANGFR、p75NTR,合适剂量的外源性P75NTR可能通过TrkANGFR/P75NTR异源二聚体信号途径促进L02细胞增殖.