重复磁刺激对体外培养大鼠神经干细胞分化和凋亡的影响

目的探讨重复磁刺激（rMS）对体外培养大鼠神经干细胞（NSCs）分化和凋亡作用的影响。 方法选取新生3d内的SD大鼠乳鼠双侧海马组织悬浮培养NSCs。在分化培养基下,将NSCs单细胞悬液进行贴壁诱导分化后,分为空白对照组和rMS组。空白对照组为自然分化无特殊处理,rMS组刺激参数为频率10Hz、50%最大输出强度、每日1000个脉冲、共刺激7d。rMS组最后1次干预后1h内收集2组细胞进行免疫荧光染色分析分化神经元的比例,采用免疫印迹法（Western blotting）检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、β-微管蛋白3(β-Ⅲtubulin)以及脑源性神经营养因子（BDNF）的表达量。再将分化7d、无rMS干预的NSCs诱导凋亡,分为诱导凋亡组和诱导凋亡rMS组。诱导凋亡rMS组在诱导凋亡1h后进行rMS干预,刺激参数同上,诱导4h后收集细胞,通过流式细胞仪检测早期和晚期凋亡率,采用Western blotting检测凋亡相关蛋白（Caspase-3,Bcl-2,Bax）的表达量。 结果rMS干预7d后NSCs分化为神经元的比例无显著性变化（P>0.05）,β-Ⅲtubulin、GFAP、BDNF相对表达量无显著性变化（P>0.05）。诱导凋亡rMS组的细胞凋亡率(9.14±4.72)%与诱导凋亡组的细胞凋亡率(15.38±4.55)%比较,差异有统计学意义（P<0.05）。诱导凋亡rMS组的Caspase-3、Bcl-2、Bax相对蛋白表达量与诱导凋亡组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。 结论频率10Hz、干预7d的rMS对体外培养大鼠NSCs的分化无显著影响,但能减少诱导凋亡剂下神经细胞的凋亡,对神经细胞具有保护作用。     

重复磁刺激对体外培养大鼠神经干细胞增殖作用的影响

目的探讨重复磁刺激(rMS)对体外培养大鼠神经干细胞（NSCs）增殖的作用机制。 方法取新生3天内的Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠双侧海马组织培养NSCs,通过cck-8试剂盒检测第2代NSCs的OD值绘制生长曲线图。再将第2代NSCs分为空白对照组和rMS组,rMS组刺激参数为频率10Hz,50%最大输出强度,每天200个脉冲,连续刺激3d。于rMS组最后1次干预1h后收集2组细胞,采用cck-8试剂盒检测其细胞增殖效应,同时用免疫印迹法检测c-fos蛋白和环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(p-CREB)的表达量。 结果第2代神经球经巢蛋白(nestin)免疫荧光染色证实为NSCs,生长曲线提示培养第3天时NSCs活性最佳。rMS干预后,rMS组cck-8的OD值为（0.309±0.043）,与空白对照组的（0.256±0.043）比较,差异有统计学意义(P<0.05);rMS干预后,rMS组的c-fos和p-CREB蛋白相对表达量分别与空白对照组比较,差异均有统计学意义（P<0.01）。 结论频率10Hz的rMS可促进NSCs的增殖,其作用机制可能与p-CREB和c-fos蛋白表达的增加有关。     

磁刺激对大鼠离体神经干细胞生长和分化的影响

目的 观察磁刺激对离体新生大鼠神经于细胞生长和分化的影响。方法 利用无血清培养技术，从新生大鼠脑室下区分离培养神经于细胞。将神经于细胞置于0．5Hz，刺激强度分别为0．48T(25％最大输出，B组)、0．95T(50％最大输出，c组)和1．44T(75％最大输出，D组)的条件下进行磁刺激干预，每天1次，每次30个脉冲，作用3d，同时设立对照组(A组)，用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活性(0D值)，并用流式细胞技术检测神经于细胞分化情况。结果磁刺激各组神经于细胞在于预后24～48h0D值较A组稍低(P＜0．05)，至72h后可恢复至A组水平；流式结果显示磁刺激各组神经丝蛋白(NF)阳性细胞比例均高于A组，其中D组NF阳性神经元的比例最高(P＜0．05)。结论0．5Hz磁刺激对神经于细胞增殖有一过性的轻度抑制作用，有利于神经于细胞向神经元方向的分化。     

不同频率磁刺激对局部脑缺血再灌注大鼠海马内源性神经干细胞激活、增殖的影响

目的:观察3种不同频率磁刺激对大鼠局部脑缺血再灌注损伤模型内源性神经干细胞(NSCs)激活、增殖的影响。方法:采用HE染色,免疫组化、Western Blot、RT-PCR技术检测大鼠海马巢蛋白(nestin)及m RNA水平,免疫组化检测Brdu阳性细胞。结果:磁刺激组神经行为评分均高于假刺激组(P<0.01);磁刺激组与假刺激组相比,nestin m RNA及蛋白表达比较差异有显著性,且10 Hz组高于1、11 m Hz组;Brdu免疫组化10 Hz组阳性平均光密度增多,1、11m Hz组与假刺激组相比差异无显著性。假手术组神经评分、nestin m RNA及蛋白表达、Brdu表达与其他组相比均有差异。结论 :3种不同频率的磁刺激均可促进脑损伤后大鼠神经功能的恢复,刺激海马区NSCs的激活;10 Hz刺激可促进NSCs增殖,但1、11m Hz作用不明显。     

磁刺激对损伤大鼠脊髓组织巢蛋白表达的影响

目的研究磁刺激对损伤脊髓组织的中间丝蛋白——巢蛋白（nestin）表达的影响。方法46只Wistar大鼠随机分为假手术组（6只）、损伤组（20只）和治疗组（20只）。治疗组与损伤组用改良的Allen重物坠落法制作大鼠脊髓损伤模型。治疗组于术后24h开始给予磁刺激，频率为0．5Hz，75％的最大输出强度（峰值强度为1．9T），每天1次，每次30个脉冲，连续7d，损伤组无特殊处理。分别于术后24h、1周、4周和8周进行BBB（Basso Beatti and Bresnahan）行为学评分，应用免疫荧光组织化学法、半定量逆转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）技术检测各时间点损伤脊髓组织中巢蛋白表达的变化。结果假手术组大鼠脊髓组织细胞中巢蛋白有微量表达，脊髓损伤后表达增加治疗组在损伤后1周、4周和8周巢蛋白表达均高于损伤组（P〈0．05）；治疗组在损伤后1周、4周和8周的行为学评分也均明显高于损伤组（P〈0．01）。结论磁刺激治疗后后损伤脊髓组织局部巢蛋白的表达增强，可促进大鼠损伤脊髓的再生修复和功能恢复。     

电针结合经颅磁刺激对脑缺血大鼠功能及神经干细胞的影响

目的研究电针（EA）结合经颅磁刺激(rTMS)对急性脑缺血大鼠神经干细胞激活、增殖以及学习、记忆能力的影响。 方法将120只雄性Wistar大鼠随机分成正常组、模型组、EA组、rTMS组和EA加rTMS组。复制急性大脑中动脉缺血模型,选取1 d作为开始治疗的时间点，分别施以EA、rTMS和EA加rTMS方法处理,大鼠在各相应时间点处死前12 h内每4 h腹腔注射溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)1次，并对大鼠行电跳台试验、神经功能评分等评测，分别在治疗后的7,14,28 d进行组织切片，采用氯化三苯基四氮唑（TTC）和Brdu免疫组化方法检测，观察鼠脑梗死面积以及鼠脑Brdu阳性细胞数。 结果EA组、rTMS组和EA加rTMS组梗死侧海马齿状回颗粒细胞层(SGZ)、室管膜下层(SVZ)周围Brdu在7,14 d表达较模型组增强(P<0.05),尤其以EA加rTMS组明显，28 d各组差异无统计学意义，EA组、rTMS组和EA加rTMS组在7,14,28 d神经功能评分、电跳台试验成绩均较模型组改善(P<0.05),尤以EA加rTMS组明显。 结论EA结合rTMS治疗能促进大鼠神经干细胞的增殖和神经功能恢复，改善大鼠学习记忆能力。     

活体磁共振示踪磁标记大鼠神经干细胞

背景:要将神经干细胞替代治疗神经系统疾病应用于临床,必须解决一个重要问题,就是植入人脑内神经干细胞的存活、迁移、识别和动态监测.目的:拟建立菲立磁体外标记胎鼠神经干细胞的方法及检测于段,观察标记细胞移植后在活体上磁共振信号的改变.设计、时间及地点:MRI动态评估,体内实验,于2005-01/08在武警医学院附属医院完成.材料:孕13～18 d SD胚胎大鼠10只用于分离、培养大鼠胚胎源性神经干细胞,健康成年清洁级SD大鼠32只,用于制作局灶性脑缺血再灌注模型.方法:分离培养大鼠胚胎源性神经干细胞,使用菲立磁一多聚赖氨酸复合物标记神经干细胞.制作局灶性脑缺血再灌注模型,将菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记的神经干细胞分别移植入模型大鼠左侧脑内,右侧移植未标记的神经干细胞.主要观察指标:对标记细胞进行普鲁士蓝染色、电镜观察.细胞活体移植后1,5,14 d体内磁共振示踪.结果:菲立磁可以高效率地标记神经干细胞,普鲁上蓝染色显示菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记神经干细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒,电镜结果显示非立磁-多聚赖氮酸复合物标记的神经干细胞胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡.磁共振成像检查发现脑内移植的标记细胞在磁共振上呈明显的低信号改变,移植第5天低信号物质沿胼胝体腹侧迁移.在移植第14天,对称平行的两个针道已经基本看不见,病灶侧侧脑室部位低信号物质向对侧迁移,左侧侧脑室部位低信号物质基本看不见.结论:菲立磁经多聚左旋赖氨酸转染后可体外标记神经干细胞,标记后体内移植的神经干细胞可以在磁共振上产生明显的低信号改变.     

磁刺激对脊髓内源性神经干细胞增殖分化影响

目的 探讨磁刺激对脊髓内源性神经干细胞（NSCs）增殖分化的作用。 方法 将46只Wistar大鼠分为正常组、对照组和治疗组,对照组和治疗组采用改良的Allen重物坠落法造成大鼠脊髓损伤（SCI）模型,治疗组于SCI后24 h开始,每天给予脉冲磁刺激,频率为0.5 Hz,强度为1.44 T,每次30个脉冲,每天1次,连续7 d。应用BBB运动功能评分评价磁刺激治疗后大鼠运动功能的改善,采用免疫组织荧光化学技术检测脊髓神经上皮干细胞巢蛋白的表达,采用免疫荧光三标技术结合激光共聚焦显微镜检测微管相关蛋2（MAP2）/巢蛋白/4,6 二乙酰基 2 苯基吲哚（DAPI）的表达。 结果SCI后,治疗组大鼠运动功能改善明显,治疗组脊髓中央管室管膜、室管膜下区、损伤病灶周围和血管周围巢蛋白阳性细胞数较对照组多（P<0.05）,且尽管总体细胞数量有限,在上述部位的MAP2/巢蛋白双标阳性细胞数多于对照组。 结论磁刺激可以促进脊髓内源性NSCs的激活,并有可能诱导其向神经元细胞分化,该诱导分化作用是否在神经再生方面具有实质性意义值得进一步深入研究。     

骶神经磁刺激对逼尿肌无力的影响

目的 探讨骶神经磁刺激（SMS）对逼尿肌无力型神经源性膀胱的影响。 方法 选取30例脊髓损伤合并神经源性膀胱患者采用随机分组方法分为刺激组和假刺激组,每组15例。实验一,刺激组第1天在膀胱容量为100 ml时给予1次SMS,第2天在膀胱容量为200 ml时给予1次SMS,第3天在膀胱容量为300 ml时给予1次SMS。SMS参数：刺激频率为15 Hz,刺激时间10 s,间歇时间30 s,共1500次脉冲。假刺激组SMS参数与刺激组相同,但将磁刺激线圈旋转90°;2组患者在100、200和300 ml膀胱容量下,在每次SMS刺激前和刺激后即刻检测最大逼尿肌压力（MDP）。实验二,从第4天开始,刺激组接受SMS治疗,假刺激组接受假刺激,均为每日治疗2次,每周治疗5 d,共治疗4周;分别于治疗前和治疗4周后,检测2组患者膀胱容量为0、100、200和300 ml时的MDP。 结果 实验一,SMS刺激后即刻,刺激组在膀胱容量为200和300 ml时的MDP均较刺激前明显增加（P＜0.05）,且均较同时间点假刺激组明显增加（P＜0.05）,而在膀胱容量为100 ml时,刺激前与刺激后即刻MDP未见明显变化（P＞0.05）。实验二,治疗4周后刺激组患者在膀胱容量为100、200和300 ml时的MDP均较治疗前明显增高（P＜0.05）,且明显优于同时间点假刺激组（P＜0.05）。 结论 SMS治疗对逼尿肌无力有效,但有效性可能与膀胱容量有关。     

当归对宫内缺氧新生大鼠神经干细胞增殖、分化的影响

背景:实验小组前期研究发现孕鼠宫内缺氧可刺激胎鼠神经干细胞的增殖,缺氧6 h时增殖达高峰,在9 h也表现增殖,但能力开始下降.而缺氧达12 h时即表现为坏死或凋亡,但随缺氧天数的延长及时段的不同,对神经干细胞的影响又如何?目的:进一步探讨宫内缺氧对新生大鼠神经干细胞增殖、分化的影响及当归注射液的保护作用.方法:孕SD大鼠随机分为对照组、缺氧组和当归治疗组.孕14 d开始将当归组与缺氧组孕鼠置于三气培养箱中,制作缺氧性脑损伤新生鼠模型,此前1 h分别给于当归注射液和生理盐水尾静脉注射,对照组不缺氧,余同缺氧组.孕鼠分娩后立即取新生鼠大脑组织,经胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学染色后行图像分析.结果与结论:①缺氧组新生鼠海马胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学阳性细胞的表达较相应对照组增加;而神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学阳性细胞的表达较对照组减小.②当归治疗组新生鼠海马胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学阳性细胞的表达较相应缺氧组减少;而神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学阳性细胞的表达较对照组增大.结果表明,一定程度的缺氧可刺激神经干细胞增殖,并可刺激神经干细胞向神经胶质细胞分化,以及导致神经元的减少;当归注射液可减弱由于缺氧导致的神经干细胞的增殖和向胶质细胞分化的能力,并可缓解神经元的减少,提示当归可能对缺氧大鼠神经系统有一定的保护作用.     

骨形成蛋白-2对室管膜前下区神经干细胞DLX5表达的影响

目的 探讨骨形成蛋白-2（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）对室管膜前下区（anterior subventricular zone,SVZa）神经干细胞DLX5表达的影响。方法体外培养SVZa神经干细胞,用BMP-2及其拮抗剂Noggin诱导SVZa神经干细胞,分别用免疫荧光染色和逆转录一聚合酶链反应（RT-PCR）检测DLX5表达变化。结果BMP-2组SVZa神经干细胞DLX5蛋白表达和DLX5mRNA表达水平明显高于对照组（P〈0．05）,且该效应能被其拮抗剂Noggin特异性地抑制。结论BMP-2是DLX5上游调节基因,可促进SVZa神经干细胞DLX5的表达。     

盐酸二甲双胍对海马神经干细胞增殖的影响

目的:观察盐酸二甲双胍(Met)对海马神经干细胞(NSCs)增殖的影响。方法:采用体外悬浮培养法获得海马NSCs,加入不同浓度Met进行培养,通过巢蛋白(Nestin)免疫荧光法鉴定细胞、观察细胞增殖;CCK-8测定NSCs增殖。结果:体外培养NSCs高表达Nestin。Nestin与CCK-8检测结果显示,随着Met浓度从5μmol/L增加至10μmol/L,NSCs数量逐渐增加。当Met浓度为5μmol/L时,细胞增殖数目最多且细胞活力最好。随着Met浓度进一步增至20μmol/L,NSCs增殖能力逐渐下降。结论:在一定浓度范围内,Met能促进海马NSCs增殖。     

异丙酚对体外培养大鼠神经干细胞增殖的影响

目的：研究静脉麻醉药异丙酚对大鼠神经干细胞的体外增殖的影响。方法：从孕14.5d的胎鼠前脑分离培养神经干细胞;采用逆转录-聚合酶联反应（RT-PCR）检测GABAA受体亚基的表达情况;用不同浓度（0~0.05mM）的异丙酚处理大鼠神经干细胞,BrdU标记及非放射性细胞增殖（MTS）法检测细胞增殖能力变化,原位末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡情况,蛋白印迹技术检测凋亡执行蛋白多聚ADP核糖聚合酶（PARP）的活化切割情况与细胞周期调控激酶Chk1与Chk2的磷酸化情况。结果：大鼠神经干细胞也表达部分GABAA受体亚基;异丙酚处理抑制大鼠神经干细胞增殖,但不影响细胞凋亡;异丙酚增强Chk1在317位丝氨酸的磷酸化,不影响345丝氨酸磷酸化,也不影响Chk2在68位苏氨酸的磷酸化。结论：异丙酚抑制体外培养的大鼠神经干细胞增殖,可能部分通过激活Chk1在317位丝氨酸磷酸化发挥作用。     

PPARγ在神经干细胞的表达

[目的]探讨神经干细胞(NSCs)增殖和分化过程中过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)的表达情况及意义.[方法]体外分离培养神经干细胞,诱导其分化,先用免疫荧光法查看PPARγ在NSCs中的定位,然后分别取未分化的及诱导分化后d1、d5、d9的NSCs,应用RT-PCR和Western Blot法检测各相应时间点NSCs内PPARγ的mRNA及蛋白表达.[结果]成功培养大量未分化呈巢状悬浮生长的神经干细胞团,并诱导其分化为神经元和神经胶质细胞.PPARγ蛋白存在于NSCs细胞核内,并在NSCs未分化阶段高水平表达,NSCs诱导分化后则表达量随时间延长而逐渐下降.[结论]在NSCs的增殖阶段,PPARγ的表达较高,而在分化过程中,表达量逐渐减少,提示PPARγ可能对NSCs的增殖和分化起重要作用.     

胎鼠端脑神经干细胞原代单层化贴壁培养

目的介绍利用胶原酶消化特点,简单而快速地实现神经干细胞原代单层化贴壁培养的方法。方法孕14d的SD大鼠无菌条件下取胎鼠端脑,剪碎后用含EDTA的Ⅰ型胶原酶消化,无血清培养基培养细胞,种植于涂有多聚赖氨酸的培养板;Nestin免疫荧光鉴定细胞性质;计算细胞纯度。结果细胞Nestin免疫荧光阳性;获取的神经干细胞纯度>99%。结论本方法可以简单而快速地获得原代单层化贴壁生长的神经干细胞。     

不同类型星形胶质细胞对神经干细胞定向分化的影响

目的观察不同类型星形胶质细胞作为饲养层细胞对神经干细胞定向分化为神经元的影响。方法通过无血清培养的方法,将原代培养所获得的神经干细胞克隆;经纯化和标记后,分别接种在以原浆型和纤维型星形胶质细胞作为饲养细胞的培养皿中并加入NeuralBasal培养基,10d后行NF-200免疫荧光染色,在显微镜下随机选取20个视野,记数神经元和标记神经干细胞的比例,并对分化的神经元细胞进行胆碱酯酶染色和Fura-3探针标记。结果在原浆型和纤维型星形胶质细胞培养条件下,神经干细胞分化为神经元的比例分别为72%与43%,分化细胞胆碱酯酶染色阳性。分化神经元在药物刺激下,细胞内可发生钙离子活动的变化。结论原浆型星形胶质细胞具有较好地促进神经干细胞向神经元,特别是向有生物学活性的运动神经元分化,可作为神经组织工程中研究中一种新的种子细胞。     

脑微血管内皮细胞对神经干细胞分化的影响

目的:观察脑微血管内皮细胞(CMECs)对神经干细胞(NSCs)增殖分化的影响。方法:实验组原代培养CMECs和NSCs,鼠胚成纤维细胞(MEF)与NSCs共培养作为对照组,使用transwell体系共培养两种细胞7 d,观察NSCs的生长状况。移除CMECs,将NSCs置于分化培养基中4 d,观察其分化比例。结果:共培养期间,实验组较对照组NSCs数量更多,直径更大(P<0.001)(n=12);分化4 d后,实验组NSCs的神经元分化比例高于对照组(P<0.001)(n=6)。结论:CMECs能够促进NSCs的存活和增殖,且有助于提高NSCs的神经元分化潜能。     

重复经颅磁刺激对抑郁症患者外周血PDLIM5 mRNA转录水平的影响

目的:探讨重复经颅磁刺激(r TMS)对抑郁症患者的疗效及对患者外周血PDLIM5基因转录水平的影响。方法:正常健康者24例纳入正常组,抑郁症患者27例纳入抑郁组。抑郁组患者接受r TMS治疗2周。于治疗前、后,行汉密尔顿抑郁量表(HAMD)评分,并检测外周血中PDLIM5 m RNA转录水平。结果:抑郁组HAMD总分明显高于对照组(P0.05)。r TMS治疗后,抑郁组"有效"13例(48.1%),"明显缓解"8例(29.6%);HAMD总分较治疗前明显下降(P0.01),但仍高于对照组(P0.05)。治疗前抑郁组外周血PDLIM5 m RNA转录水平明显低于对照组(P0.05),治疗后抑郁者组外周血PDLIM5 m RNA表达水平与治疗前差异无统计学意义(P0.05)。治疗前后,抑郁组HAMD总分与外周血PDLIM5 m RNA转录水平无明显相关性(P0.05)。结论:r TMS治疗抑郁症有效,对外周血PDLIM5转录水平无影响。     

Effects of Electroacupuncture Combined with Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation on the Expression of Nestin in Neural Stem Cell after Focal Cerebral Ischemia in Adult Rats*

Objective: To investigate the influence of electroacupuncture (EA) combined with repetitive transcranial magnetic stimulation(rTMS) on the temporal profile of nestin expression after induction of focal cerebral ischemia in adult rats and to explore the mechanism of EA combined with rTMS in treating ischemic brain injury. Method: The model of transient focal ischemia was produced by occlusion of middle cerebral artery. Seventy-five Wistar rats were randomly divided into normal group, model group, EA group, rTMS group and EA+rTMS group. The neurologic impairment rating and ability of learning and memory were observed at the 7th、14th and 28th d after infarction respectively. Meanwhile, Western blotting was used to observe the number of nestin expression positive cells. Result: Nestin-positive cells were found in cortex, subgranular zone(SGZ), subventricular zone (SVZ) of the ipsilateral side at different time points after cerebral ischemia. The number of nestin-positive cells peaked at the 7th d, began to decrease at the 14th d and was significantly higher in EA+rTMS group than that in model group(P<0.05), then almost reached normal at the 28th d. The improvement of neural motor function deficits as well as the indexes of learning and memory were more obvious in EA+rTMS group compared with model group(P<0.01, P<0.05). These effects were most obvious in EA+rTMS group compared with the EA and rTMS group(P<0.05). Conclusion: EA and rTMS possess the potency of building up and can increase the number of nestin-positive cells in some brain regions after focal cerebral ischemia, which might be one of the important mechanisms of EA combined with rTMS in treating ischemia brain injury.