胸腺内注射异基因骨髓细胞诱导特异性免疫耐受的实验研究

目的:探索通过胸腺内注射异基因骨髓细胞加腹腔注射环磷酰胺,以小鼠皮肤移植为模型,诱导移植免疫耐受,为免疫耐受提供理论和实验依据.方法:提取供体B6小鼠(H-2b)骨髓细胞,注入受体BALB/C(H-2d)小鼠胸腺内,48 h后腹腔注射200 mg/kg的环磷酰胺,2周后移植供体小鼠(H-2b)和无关供体C3H(H-2k)小鼠皮肤.共设空白对照组、CP对照组、BM对照组、实验组、第三方供体组5个组.观察皮肤存活时间;皮肤移植2周后对受体小鼠作单向混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)、脾细胞增值反应及迟发型超敏反应(delayed type hypersensitivity,DTH)耐受状态的检测.结果:受体小鼠获得了对供体小鼠的特异性皮肤移植耐受,实验组移植皮肤平均存活时间(MST)为(22.00±2.51)d,对照组MST为(8.75±1.04)d,耐受的受体小鼠对第三供体C3H小鼠的移植皮肤仍正常排斥,MST为(10.25±1.91)d.单向混合淋巴细胞反应和迟发型超敏反应证明耐受的BALB/C小鼠对B6小鼠的脾细胞的反应性特异性降低,而仍保持对第三方供体C3H小鼠的免疫反应.耐受的受体小鼠脾细胞对丝裂原(ConA)的增殖反应在正常范围.结论:使用胸腺内注射供体异基因骨髓细胞,结合腹腔应用环磷酰胺的方法,可在成年动物诱导出对供体移植物的特异性免疫耐受,无非特异性免疫抑制.小鼠皮肤移植模型是观察免疫耐受状态的可靠动物模型.     

同系或同种胸腺与异种胸腺混合移植诱导T细胞免疫耐受的实验研究

目的 探讨同系或同种胸腺与异种胸腺混合移植诱导移植免疫耐受而不发生自身免疫性疾病的可行性。方法 BALB／c裸小鼠的肾包膜下植入胸腺建立异种、同系与异种混合、同种与异种混合胸腺移植模型。4个月后，用流式细胞仪技术检测受者裸小鼠外周血中CD3^＋CD4^＋T细胞，用单向混合淋巴细胞培养了解受者T细胞对ConA以及同种异种淋巴细胞的反应性，异基因皮肤移植观察皮肤移植物存活期。用ELISA法检测受体血清中抗DNA自身抗体。结果 胎胸腺移植4个月后，受者裸小鼠中CD3^＋CD4^＋T细胞重建良好；T细胞对ConA以及无关的SD鼠异种淋巴细胞的反应性强，而对移植胸腺供体来源的淋巴细胞不发生增殖反应；受者对移植胸腺供体来源鼠皮肤移植物不发生排斥，而对无关的SD鼠皮肤移植物发生排斥。异种胸腺移植组发生消耗性疾病死亡高，抗DNA自身抗体明显高于混合胸腺移植组。结论 同系或同种异种胎胸腺混合移植可诱导受者T细胞对供者移植物的免疫耐受。     

SMMC/C系小鼠生物学特性研究 Ⅲ.皮肤移植试验

近交系小鼠具有相同的组织相容性基因。鉴定某一近交系小鼠的组织相容性基因是否一致,皮肤移植乃是一种简单而可靠的方法。因为只有当供体与受体的组织相容性基因一致时,移植才能被接受,反之即被排斥。为了鉴定SMMC/C系小鼠的遗传学质量,作者参考了Bjllingnam的皮肤移植方法,加以改进,结果如下。     

裸小鼠在皮肤病学和皮肤毒理学中的应用

裸小鼠由于其无毛、裸体和无胸腺等生物特点，被广泛应用于皮肤病学和皮肤毒理学等方面的研究，如皮肤移植、银屑病、经皮给药系统、皮肤老化等。简要介绍了应用裸小鼠以来建立的各种皮肤疾病动物模型及裸小鼠在皮肤毒理学上的应用，并展望了裸小鼠在皮肤病学和皮肤毒理学应用中的前景。     

耐受T细胞抑制NK细胞和巨噬细胞对大鼠皮肤移植物的排斥

目的 了解NK细胞和巨噬细胞在T细胞缺乏或T细胞成功重建的情况下对异种移植物排斥的作用。方法在无胸腺裸小鼠、通过混合胸腺移植重建T细胞后裸小鼠和正常免疫健全小鼠分别进行F344大鼠皮肤移植,观察异种皮肤移植物的存活情况,并利用流式细胞仪检测各组受体动物外周血中CD4+和CD8+T细胞的百分率,利用ConA增殖实验和混合淋巴细胞培养检测其体外功能状态。结果 在没有清除受体体内NK细胞和巨噬细胞的情况下,正常无胸腺BALB/c裸小鼠上移植的F344大鼠皮肤移植物发生了排斥,平均存活时间为(20.50±2.38)d;而在裸小鼠左肾包膜下移植的F344胎大鼠胸腺组织,却能够正常发育,并有效重建了受体的T细胞免疫,而且诱导了F344大鼠皮肤移植物的长期存活。结论NK细胞和巨噬细胞在异种移植物的排斥中起十分重要的作用,不同组织对NK细胞和巨噬细胞细胞毒性的易感性可能存在一定的差异。对异种供体抗原已产生耐受的T细胞可抑制受体体内NK细胞和巨噬细胞对异种移植物的排斥。     

phVEGF165基因导入促进硬皮病小鼠模型毛发生长及再生

目的观察VEGF对硬皮病小鼠模型毛发生长的作用.方法将phVEGF165质粒导入博莱霉素诱导的硬皮病小鼠模型背部皮肤.每周测量毛发的长度,常规病理观察皮肤组织病理学改变,并用免疫组化及原位杂交方法检测VEGF的表达.结果发现VEGF有明显促毛发生长作用.phVEGF165质粒导入的小鼠皮肤毛囊数目明显增多,真皮及毛囊区VEGF及VEGF mRNA表达增强.结论 VEGF对硬皮病小鼠模型毛囊的再生有明显的促进作用.     

CTLA4-Ig联合骨髓细胞诱导小鼠心脏移植耐受

目的:探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4-immunoglobulin,CTLA4-Ig)与供体骨髓细胞联合应用诱导器官移植免疫耐受的可行性.方法:应用小鼠腹部心脏移植模型,实验组小鼠术中输注供体骨髓细胞,术后腹腔注射CTLA4-Ig.观察移植心脏存活时间,并进行病理分析,检测迟发性超敏反应(Delayed Type Hypersensitivity,DTH).后期进行供体来源的皮肤移植并观察存活时间.结果:实验组移植心脏存活时间较对照组显著延长,达(79.3±23.7)d;排斥反应减轻,并产生了供体抗原特异性的免疫低反应性;后期进行的皮肤移植实验中,供体来源的皮肤存活时间也显著延长,达(23.0±3.1)d.结论:CTLA4-Ig与骨髓细胞联合应用可以显著延长移植物存活时间,诱导实体器官移植免疫耐受.两者具有明显的协同作用.     

供体NKT细胞输注促进小鼠皮肤移植耐受及其机理的研究

目的探讨供体NKT细胞静脉输注诱导移植耐受的作用及其机制。方法C57BL/6和BALB/c小鼠分别为供体和受体,建立皮肤移植模型。对照组:术后注射生理盐水;NKT组:术前静脉注射供体鼠NKT细胞(5×106个/只),术后腹腔注射生理盐水;CsA组:术后腹腔注射环孢素(CsA)(4mg/kg);NKT CsA组:手术前1日静脉注射供体鼠NKT细胞(5×106个/只),术后腹腔注射CsA(4mg/kg)。术后逐日观察移植皮肤存活情况及小鼠一般状况;术后14天对植皮BALB/c小鼠做混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)、迟发型超敏反应(delayed type hypersensitivity,DTH)等确定耐受的状态;并通过过继转移实验及脾细胞中细胞因子mRNA表达情况,进一步探讨耐受形成的机制。结果采用此诱导方案,移植皮片存活时间明显延长,耐受可被过继转移,Th2型细胞因子IL-10、IL-4在耐受小鼠中明显升高。结论供体NKT细胞静脉输注能诱导异基因小鼠皮肤移植耐受,抑制细胞、Th1/Th2偏移在耐受中起了一定作用。     

抗T细胞受体αβ单抗和抗CD80单抗联合供体骨髓移植诱导小鼠皮肤移植耐受

目的:探讨抗T细胞受体(T cell receptor, TCR)αβ单抗和抗CD80单抗联合供体骨髓细胞输注方法在同种异基因小鼠皮肤移植耐受诱导中的作用.方法:第0天,向C57BL/6小鼠(受体)尾静脉输注2×10⁸个BALB/c小鼠(供体)来源的骨髓细胞,同时腹腔注射抗TCRαβ单抗500 μg;第2天,向C57BL/6小鼠腹腔注射抗CD80单抗500 μg.第6天进行皮肤移植.在不同的时间对C57BL/6小鼠进行迟发型超敏反应测定和混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction, MLR)分析,并进行MLR的白细胞介素-2(interleukin-2, IL-2)逆转实验、过继转移实验和嵌合体检查,探讨耐受形成的机制.结果:接受了抗TCRαβ单抗和抗CD80单抗联合供体骨髓移植的C57BL/6小鼠,供体皮肤移植物平均存活70 d;在迟发型超敏反应和混合淋巴细胞反应中均表现出显著的低反应性.IL-2逆转实验结果表明克隆不应答可能参与了移植耐受的形成.体内、体外过继转移实验均显示耐受C57BL/6小鼠脾细胞中存在抑制细胞的活性.嵌合体检查结果表明在耐受C57BL/6小鼠的胸腺和脾中均形成了混合嵌合体,嵌合体水平随时间下降.结论:抗TCRαβ单抗和抗CD80单抗联合大剂量供体骨髓细胞输注可以在组织相容性抗原完全不相同的成年小鼠间成功诱导出皮肤移植物的长期耐受.     

皮下注射骨髓细胞诱导小鼠皮肤移植后免疫耐受

目的　探讨皮下注射供体骨髓细胞加用环孢素A(CyA)短期免疫抑制的方法 ,诱导小鼠皮肤移植后免疫耐受的可行性。方法　通过尾 尾皮肤移植将 8周龄BABL/c小鼠皮肤移植到同龄C57BL/ 6小鼠上 ,后者分为 5组 ,A组长期应用CyA ,B～E组按不同时间和剂量皮下注射供体骨髓细胞并加用短期CyA腹腔注射 (7～ 1 1d) ,观察C57BL/ 6小鼠移植皮肤综合评分及平均生存时间。结果　B、C两组小鼠 (BM 1× 1 0 5,1× 1 0 6 ,0～ 1 1d隔天注射 ) ,停用CyA后短期出现排斥反应 ,移植皮肤平均存活 2 7d ;D、E两组小鼠 (BM 1× 1 0 7,0、4、8、1 1d注射和BM 1× 1 0 8,0、5、1 0d注射 ) ,停用免疫抑制剂后并未发生早期排斥反应 ,移植皮肤平均存活时间明显延长(48、55d) ,与持续使用CyA的A组 (54d)相近。 结论　在该小鼠皮肤移植模型中 ,供体骨髓细胞皮下注射加短期免疫抑制剂CyA诱导出了受体对同种皮肤移植物暂时性的耐受 ,延长了移植物平均存活时间 ;该耐受的形成与骨髓细胞注射剂量、间隔时间相关 ,大剂量间隙注射更可能诱导免疫耐受。     

人脑胶质瘤干细胞移植于表达绿色荧光蛋白裸小鼠的研究

目的 培育表达绿色荧光蛋白(GFP)的裸小鼠,并探讨将其用于人胶质瘤干细胞(HGSC)移植实验研究.方法 将C57BL/6J-GFP转基因小鼠与NC系裸小鼠进行交配,在继代时严格挑选都表达GFP的无毛雄鼠与有毛母鼠交配,通过肉眼、免疫组织化学和荧光显微镜等方法观察GFP在裸小鼠皮肤和脏器中的表达情况,继将HGSC原位移植于表达GFP的裸小鼠,以观察移植瘤的生长情况.结果 传至8代的裸小鼠,包括脑在内的全身主要器官和细胞都表达GFP.对用于HGSC原位移植的脑,能清晰辨认出不发光的瘤细胞和发光的宿主细胞.而瘤细胞经人特异白细胞抗体(HLA)连接红色荧光剂(PE)的免疫组织化学染色后,在共聚焦显微镜下可清晰显示与宿主脑细胞的组织学关系.结论 用免疫功能健全、表达GFP的转基因鼠与免疫功能缺陷的裸小鼠杂交,可获得脑等组织器官表达GFP的裸小鼠.对其进行HGSC原位移植,因可清晰辨认移植瘤与宿主组织的关系而有望用于肿瘤组织重构的研究.     

β-咔啉类衍生物对BALB/c裸小鼠肝癌皮下移植瘤生长的影响

目的 观察β-咔啉类衍生物(HMD)对人肝癌裸小鼠皮下移植瘤生长的影响.方法 雄性BALB/c裸小鼠每只以2×107个活细胞/ml(0.2 ml)建立人肝癌的裸小鼠模型,随机分为HMD低剂量组(0.22 mg/kg); HMD中剂量组(0.44 mg/kg); HMD高剂量组(0.87 mg/kg);5-氟尿嘧啶注射液组(5-Fu)和生理盐水对照组.各组连续给药15d.观察HMD对裸小鼠人肝癌移植瘤生长的影响及对裸小鼠主要脏器的毒性.结果 HMD低、中、高剂量组及阳性组对裸小鼠人肝癌移植瘤体重的影响与阴性对照组比较均有极显著性差异(P＜0.01).HMD中、高剂量组及阳性组对裸小鼠体质量增加影响与阴性对照组比较有极显著性差异(P＜0.01).对肝脏重量及肝脏系数的影响,HMD低、中、高剂量组及阳性组与阴性对照组比较有显著性差异(P＜0.05),肾脏及肾脏系数各组间差异不显著(P＞0.05).结论 HMD对人肝癌HepG2裸小鼠皮下移植瘤生长有明显的抑制作用,未见有异常毒性症状出现.     

复方ANBP对小鼠皮肤移植创面愈合的疗效观察

目的观察复方ANBP[由仙鹤草(Agrimonia eupatoria, A),藕节(Nelumbo nucifera Gaertn, N),乳香(Boswellia carteri, B)和蒲黄(Pollen Typhae, P)组成]对皮肤移植创面愈合的促进作用。方法选用40只雌性C57BL/6小鼠,制成背部直径1.2 cm圆形全层皮肤缺损小鼠模型,后进行自体原位皮肤移植术,随机分为对照组和实验组,实验组给予复方ANBP粉末敷于皮肤移植区,对照组不予处理。通过肉眼、HE染色观察比较两组皮肤移植区14 d及21 d时皮肤愈合情况,计算创面愈合率并进行统计学分析。结果 (1)皮肤移植14 d、21 d后,实验组小鼠创面愈合率高于对照组(P<0.05)。(2)HE染色结果:皮肤移植14 d,实验组较对照组皮肤移植交界处平坦、表皮嵴浅且连接紧密;皮肤移植区表皮层变薄、新生毛囊数量较多且发育良好。皮肤移植21 d,实验组较对照组皮肤移植交界处皮下组织紧密呈更强的收缩感;皮肤移植区毛囊更成熟、发育趋于完善,出现了明显的毛干、皮脂腺等皮肤附属器。结论复方ANBP能够加快皮肤移植区与周围皮肤衔接,加速皮肤移植愈合,促进皮肤附属器发育及皮肤塑形,提高愈合质量。     

NC系裸小鼠的饲育及其在人脑胶质瘤研究中的应用

目的总结本实验室SPF级环境中NC系裸小鼠繁殖和应用情况。方法用♀Nu/＋与♂Nu/Nu交配法繁殖仔鼠后随机观察10窝裸小鼠的繁殖情况,然后用人脑胶质瘤组织或细胞悬液在裸小鼠体内建立原位和异位移植瘤模型,并分析模型生物学特性及实验治疗效果。结果 NC系裸小鼠每胎平均产仔9.1只,Nu/Nu占1/2,总离乳率为94.5%,年存活率达100%,未检测到病菌和寄生虫等。原位移植瘤能够复制其原发人脑胶质瘤侵袭性的生长特性,治疗后可以明显看到移植瘤缩小及血管生成抑制。结论 SPF级环境中用♀Nu/＋与♂Nu/Nu交配法能稳定繁殖裸小鼠;裸小鼠为人脑恶性肿瘤模型的建立及实验治疗提供了理想的载体。     

人源性前列腺癌动物模型的初步建立

目的 建立中国人同一起源肿瘤不同恶性潜能前列腺癌动物模型,为研究前列腺癌转移进展机制及激素抵抗的发生机制提供理想的动物模型.方法 采用组织块外科原位移植法将人前列腺癌组织分别移植到虚拟去势组及去势组雄性裸小鼠前列腺部,成瘤后进行鼠间传代移植,选取虚拟去势组原位移植瘤、移植淋巴结转移瘤、去势组第4代淋巴结转移瘤体外培养建立细胞系,应用Boyden Chamber细胞运动实验检测细胞迁徙转移能力,描绘细胞生长曲线分析细胞增殖及激素依赖性,裸小鼠皮下异种移植瘤模型检测成瘤率、肿瘤湿重及浸润范围验证不同代移植瘤细胞在裸小鼠异种移植的生长状态.结果 第1代虚拟去势组成瘤率30％,无淋巴结转移,取移植瘤反复原位传代移植第3代成瘤率50％,盆腔淋巴结转移率40％.去势组原代移植以及来自虚拟去势组的原位移植瘤反复原位移植均未见移植瘤,源自虚拟去势组淋巴结转移瘤组织反复原位传代移植至第4代,成瘤率33％,其中一只可见盆腔淋巴结转移.三种细胞系细胞生长、迁徙以及体外裸小鼠成瘤率均有显著差别（P＜0.05）.结论 裸小鼠前列腺癌原位移植反复传代可增强肿瘤成瘤率、转移力等恶性指标.以裸小鼠淋巴结转移瘤接种去势裸小鼠可筛选出激素非依赖性异种移植瘤及转移瘤.     

小鼠对大鼠异种皮肤移植耐受的诱导

目的探索更为温和的适合临床应用的诱导异种移植耐受的方案。方法给小剂量照射（ 300 rad）的 C57BL/6 (B6)小鼠静脉注射抗小鼠 CD4单抗 0.5 ml后输注 Lewis大鼠骨髓细胞 ,并联合应用腹腔注射环磷酰胺诱导耐受。于耐受诱导后 30 d对受体小鼠作耐受状态的检查,包括供体特异性皮肤移植、混合淋巴细胞反应（ MLR）及迟发型超敏反应（ DTH）。并通过过继转移实验、外源 IL- 2对耐受小鼠供体特异性 MLR的影响等进一步探讨耐受形成的机制。结果 Lewis大鼠的皮肤移植物在耐受 B6小鼠中存活期特异性延长, MLR及 DTH检查证明 B6小鼠对 Lewis大鼠的脾细胞产生特异性耐受,对无关第三者 DA大鼠及 BALB/c小鼠的脾细胞仍表现出强烈的免疫应答。体内外过继转移实验表明 ,耐受不能被转移 ,未发现抑制细胞的存在。耐受小鼠供体特异的 MLR可以被外源 IL- 2逆转 ,说明耐受主要不是克隆排除,而与克隆不应答有关。结论应用低剂量照射、骨髓移植、环磷酰胺及抗 CD4单抗等方法法可以有效诱导出小鼠对大鼠的移植耐受。     

人肝癌细胞HepG2接种于BALB/C裸小鼠移植瘤的性别差异

目的 研究性别对人肝癌细胞HepG2接种于BALB/C裸小鼠成瘤及移植瘤生长趋势的影响.方法 18只4~6周龄BALB/C裸小鼠雌雄各半,按照性别分成雌雄两组,每组9只,将全部裸小鼠肩胛部接种处于对数生长期且浓度为1.0×107/mL的HepG2细胞0.2 mL,10 d后观察两组的成瘤情况并测量肿瘤体积.结果 雌性组成瘤模型4只,成瘤率为44.44%;雄性组成瘤模型9只,成瘤率为100.00%,差异有统计学意义(P=0.029);造模成功的移植瘤体积走势图显示移植瘤生长速度雄性组大于雌性组.结论 人肝癌细胞HepG2接种于BALB/C裸小鼠成瘤率及移植瘤生长速度有明显的性别差异.     

成年鼠被毛毛乳头细胞分离方法的建立与评价

目的 寻求一种简单高效的分离培养小鼠被毛毛乳头细胞的方法.方法 取5周龄C57小鼠背部皮肤,刮去毛发后予0.2％Ⅰ型胶原酶37℃消化2h,刮下毛球部,经过2次Ficoll密度梯度离心后,得到纯净的毛乳头进行培养.检测毛乳头贴壁率、毛乳头细胞特异性标记表达及其体内毛囊重建能力.结果 该分离方法能显著降低工作强度,减少污染机会,获得的毛乳头贴壁快、细胞迁出快.qRT-PCR、细胞免疫荧光实验结果均证实体外培养的小鼠被毛毛乳头细胞可表达与毛囊诱导能力相关的特异性标记物ALP、β-catenin及Versican,且与触须毛乳头细胞相比差异无统计学意义(P＞0.05).体外培养的小鼠被毛毛乳头细胞具有诱导毛囊再生的能力.结论 胶原酶消化结合Ficoll梯度离心是一种简单、有效地分离获取小鼠背部毛乳头的方法.     

裸小鼠肝癌原位移植模型的建立

【摘要】 目的 建立一种操作更加简便、高效、重现性好的BALB/c裸小鼠肝癌原位移植模型。方法 采用异氟烷气化对实验动物进行全身麻醉,取仰卧位,安尔碘擦拭消毒腹部和胸部皮肤,在剑突下方约5 mm,用组织剪逐层剪开皮肤约1 cm,暴露出肝脏,分别用 “包埋法”和“夹心法”建立BALB/c裸小鼠肝癌原位移植瘤模型,比较其各自的优缺点。手术后用小动物活体成像系统对肿瘤组织的生长情况进行检测,4周后对肝脏及肿瘤组织进行组织病理学检查。结果 采用夹心法建立的肝癌原位移植BALB/c裸小鼠模型,操作时间短,操作难度低,成瘤率为100%,肿瘤组织生长良好,在腹腔内未出现肿瘤广泛种植现象,组织病理学检查无异常。结论 与包埋法相比,夹心法具有操作简单、手术时间短动物死亡率低等特点,为快速制备大批量小鼠肝癌原位移植模型节约大量时间,为肝癌原位药效学、及其它生物学研究提供更便利的平台。     

异基因脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞小鼠移植后嵌合体形成及免疫耐受检测

目的:探讨器官移植中脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞诱导免疫耐受的可能性.方法:20只C57BL/6小鼠经致死量射线照射后随机等分为2组,实验组移植C57BL/6小鼠骨髓细胞和BALB/c小鼠脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞,对照组仅移植C57BL/6小鼠骨髓细胞,以CM-DiI荧光染料示踪脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞的体内分布情况,并以PCR方法检测Y染色体的存在以进一步鉴定.以皮肤移植实验观察脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞移植小鼠对供体来源组织器官移植物的反应性,以未移植Flk1 CD31-CD34-细胞小鼠为对照.结果:脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞可进入并较长期(30 d)存在于异基因小鼠免疫器官内;在细胞移植组小鼠脾脏组织中可检测到供体来源T细胞占受体脾细胞的6.68%;脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞移植组小鼠供体来源皮肤移植物存活＞90 d,未处理组为8～9 d.结论:异基因脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞移植后可形成稳定嵌和体,并诱导特异性免疫耐受的产生.