抗GBM抗体特异性单链抗体scFv3原核表达载体的构建及表达

目的:构建单链抗体scFv3的原核表达载体pET28a-scFv3并诱导表达,纯化并检测表达产物的免疫抗原性。方法:用PCR扩增抗肾小球基底膜(GBM)抗体单链抗体scFv3基因,构建pGEM-scFv3重组质粒并测序。将重组基因亚克隆于原核表达载体pET28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析法纯化,用间接ELISA检测纯化的单链抗体scFv3的免疫抗原性。结果:酶切和测序证实得到的scFv3基因序列正确。间接ELISA检测表明,纯化获得的scFv3能与抗GBM抗体结合。结论:成功构建了pET28a-scFv3原核表达系统并获得纯化的scFv3蛋白。表达产物具有良好的抗原性,为进一步研究该单链抗体在抗GBM抗体病中的治疗作用奠定了基础。     

抗角蛋白Fab抗体在大肠杆菌中的表达与复性研究

目的 :用大肠杆菌分别表达抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段 ,体外复性得到Fab抗体。方法 :从已构建的质粒p3MH/Fab中 ,亚克隆抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段基因 ,并分别插入载体pET32a中 ,构建重组质粒。以重组质粒分别转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,在IPTG诱导下进行表达。SDS PAGE分析发现 ,在相对分子量 (Mr)为 2 5 0 0 0处有外源蛋白表达。轻链和Fd片段变性后等量混合于折叠液中 ,复性后形成Mr 约为4 5 0 0 0的蛋白。结果 :成功地表达抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段 ,ELISA和Westernblot证实 ,复性产物具有与角蛋白结合的能力。结论 :获得了具有活性的抗角蛋白的Fab抗体 ,为其应用研究打下了基础 ,也表明包涵体表达基因工程抗体技术是可行的。     

天然抗角蛋白单克隆抗体3B4的噬菌体呈现的scFv的构建及表达

目的:构建并表达噬菌体呈现的天然抗角蛋白单克隆抗体(mAb)3B4的单链抗体(scFv),并测定其活性。方法:分别以pMD18TmAb3B4VH和pMD18TmAb3B4VL为模板进行PCR,扩增mAb3B4的VH和VL基因,然后将其依次插入噬菌体表达载体pscMH中。经DNA序列测定正确后,转化大肠杆菌,用辅助噬菌体VCSM13超感染诱导表达scFv;用ELISA检测其与亲本mAb3B4的抗原结合活性的改变。结果:对扩增的mAb3B4的VH和VL基因进行测序,结果表明VH基因与原序列完全一致,VL基因在骨架区FR1有1个碱基发生突变。用VCSM13超感染后能检测到scFv的表达,其与亲本一样具有多反应性,但抗原结合模式不完全相同。结论:成功地构建并表达了天然抗角蛋白mAb3B4噬菌体呈现的单链抗体,表达的scFv与mAb3B4的抗原结合活性有一定的差异,为探讨天然自身抗体的抗原结合模式奠定了基础。     

抗木瓜凝乳蛋白酶单链抗体基因的构建、初步筛选和鉴定

目的 :构建抗木瓜凝乳蛋白酶全套单链抗体 (scFv)噬菌体表面展示文库。方法 :从木瓜凝乳蛋白酶免疫小鼠的淋巴细胞中提取总RNA ,反转录成cDNA后 ,用抗体V区简并引物扩增全套VH 和VL 基因。经重叠延伸反应 ,装配成scFv基因 ,并将其克隆到噬粒载体pFAB5C中 ,构建scFv噬菌体抗体库。对抗体库进行亲和筛选后 ,用ELISA法鉴定抗木瓜凝乳蛋白酶的scFv。结果 :经 4轮“亲和 吸附 洗脱”的富集过程 ,得到ELISA活性较高可与木瓜凝乳蛋白酶结合的克隆。结论 :成功地构建了抗木瓜凝乳蛋白酶的scFv噬菌体展示文库 ,并筛选到与木瓜凝乳蛋白酶具有结合能力的scFv基因     

抗人肝癌单克隆抗体HAb18 Fab基因的克隆和表达

目的：克隆抗人肝癌单抗(mAb)HAb18的Fab基因，并在大肠杆菌中表达。方法：采用RT-PCR法，利用设计的引物扩增mAb Fd和κ链全长基因，并分别克隆到T载体中进行序列分析。然后，亚克隆到原核表达载体pComb3中，转化感受态大肠杆菌后以IPTG诱导表达。采用ELISA和免疫荧光法检测表达产物的特异性。结果：克隆了mAb HAb18的Fab基因，并在大肠杆菌中获得表达。竞争性ELISA和免疫荧光检测证实，表达产物具有与相应抗原特异结合的活性。结论：成功地构建了抗人肝癌小分子Fab抗体，为其进一步在肝癌诊断与治疗中的应用奠定了基础。     

嵌合抗CD20抗体Fab片段在大肠杆菌中表达及活性鉴定

目的 :构建抗CD2 0 嵌合抗体Fab片段表达载体 ,并在大肠杆菌中进行高效可溶性分泌表达。方法 :利用PCR方法从抗CD2 0 单链抗体 (ScFv)表达载体上扩增抗CD2 0 抗体轻链可变区基因 (VL)、重链可变区基因 (VH) ,然后将VH、VL 基因重组到Fab表达载体pYZF中 ,构建抗CD2 0 Fab表达载体pYZF1cd2 0 ,并在 2 7C7菌中高效表这。结果 :经Fab表达载体转化的 2 7C7菌株 ,进行表达培养 ,经分离纯化获得具有CD2 0 特异结合活性的Fab片段 ,竞争性免疫荧光抑制实验表明 ,表达产物Fab片段能竞争性抑制鼠源性抗CD2 0 抗体HI47和CD2 0 表达细胞Raji细胞结合。结论 :在大肠杆菌中高效可溶性分泌表达有活性的抗CD2 0 嵌合抗体Fab片段。     

抗p185单抗5E12Fab段基因的克隆及表达

目的：克隆抗p185单抗5E12的Fab段基因并在原核细胞进行表达。方法：用逆转录．聚合酶链反应技术（RT-PER），以可变区第一骨架区的通用引物从分泌抗p185单抗的杂交瘤细胞系5E12中克隆Fd段和K链的基因，重组到Fab表达载体中，在大肠杆菌中表达噬菌体抗体和可溶性Fab；根据前导肽序列设计引物，通过PER介导的定点突变将V区基因氨基端序列恢复为5E12的原始序列；以NIH3T3／erbB-2细胞ELISA法、免疫组化法等进行特异性鉴定。结果：以第一骨架区的通用引物从小鼠杂交瘤细胞5E12中克隆到Fd段和k链的基因，在大肠杆菌中表达出Fab段抗体但无特异性抗原结合活性，分别将Fd段和k链V区基因的氨基端序列矫正为亲本单抗的原始序列后，恢复了Fab段的抗原结合活性。单独恢复Fd段可变区氨基端序列可恢复抗原结合活性。但同时恢复k链后活性却有所下降。结论：成功构建了抗p185小分子抗体Fab并进行功能性表达，为进一步构建抗p185鼠单抗其他小分子抗体及其人源化改造打下基础；进一步证实抗体氨基端序列对抗体活性的重要性，为今后以PER方法构建小分子抗体的工作提供了有益的借鉴。     

人源化抗肾小球基底膜抗体的单链抗体scFv3的原核表达及鉴定

目的:在原核细胞中构建并表达抗肾小球基底膜(GBM)抗体单链抗体scFv3,并鉴定其活性。方法:用PCR扩增抗GBM抗体单链抗体scFv3基因,将scFv3 DNA与pGEM-T Easy质粒连接,构建克隆载体pGEM-scFv3。用酶切后电泳鉴定构建载体的正确性;测序检测质粒重组后序列有无改变。再将scFv3亚克隆入表达载体pQE-80L,构建pQE80L-scFv3重组质粒,转化大肠杆菌Rosetta2,酶切鉴定。IPTG诱导表达蛋白后,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物的抗体活性。结果:PCR扩增scFv3 DNA片段约为750 bp,与预期结果相同;克隆载体pGEM-scFv3酶切后显示scFv3成功的克隆入pGEM-T Easy质粒;测序验证插入片段全序列无改变;表达载体pQE80L-scFv3酶切图谱与预期相同;SDS-PAGE显示,在分子量约为27 kD处可见目的蛋白带,Western blot证实scFv3能与抗GBM抗体结合。结论:成功构建并表达了抗GBM抗体的单链抗体scFv3蛋白,为进一步研究scFv3的生物学特性和基因工程抗体的制备奠定了基础。     

抗AIF单链抗体在大肠杆菌中的可溶性表达和鉴定

目的:获得具有生物活性的抗酸性同功铁蛋白(AIF)单链抗体(scFv)。方法:将AIF4c9scFv基因亚克隆于原核表达载体pPOW3,构建重组表达质粒pPOW4c9,电转化大肠杆菌DH5α,以温度诱导重组抗AIFscFv表达,经镍螯合层析柱纯化后,用ELISA和Westernblot检测表达蛋白与AIF的结合特性。结果:抗AIFscFv抗体在大肠杆菌中获得可溶性表达,亲和力常数KD为3.18×10-8mol/L;纯化后的可溶性AIFscFv含量约为1.6mg/L。重组蛋白能特异识别AIF,并且具有良好的抗体生物学活性。结论:在大肠杆菌中表达并纯化了特异性可溶性抗AIFscFv抗体。     

抗人肝细胞生长因子受体单链抗体慢病毒载体的构建和应用

目的构建可表达抗人肝细胞生长因子受体(HGFR)单链抗体(scFv)的慢病毒表达载体,将其感染HEK293细胞,检测该抗体的表达及与抗原结合活性。方法采用反转录PCR(RT-PCR)从分泌小鼠抗人HGFR抗体的杂交瘤细胞株(8E8)中扩增VH和VL基因,用重叠延伸PCR法将VH和VL进行拼接,得到含有信号肽SP-VH-linker-VL的单链抗体基因(HGFR-scFv),将其插入克隆载体pCR-Blunt中。用内切酶将HGFR-scFv基因从pCR-Blunt上切下,插入慢病毒载体pRRL-CMV中,经相应酶切和测序鉴定,正确构建慢病毒表达载体pRRL HGFR-scFv。磷酸钙法转染HEK293T细胞,48 h后通过荧光显微镜检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,将获得病毒颗粒进一步感染HEK293细胞,RT-PCR和ELISA检测scFv的表达情况。结果抗人HGFRscFv的慢病毒表达载体构建成功,病毒颗粒感染HEK293细胞后,得到了可以稳定表达抗人HGFR-scFv的细胞系;ELISA结果表明,scFv能与人HGFR特异性结合。结论成功克隆了小鼠抗人HGFR抗体的scFv基因,并构建其慢病毒表达系统。     

抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体单链抗体ScFv的构建和表达

目的：克隆抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体ScFv。方法：从分泌抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株（2F4）中提取总RNA，利用RT-PCR技术，克隆该抗体重链可变区基因（VH）和轻链可变区基因（VL），通过基因重组构建VH-VL的表达载体pTAT-ALI，转化大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达。结果：VH基因序列全长369碱基对，编码123个氨基酸，VL基因序列全长339碱基对，编码113个氨基酸，二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征，含有4个框架区（FRs）、3个抗原互补决定区（CDRs）及抗体特征性的两个半胱氨酸残基。ELISA测定显示基因工程抗体ScFv与原代抗体一样，具有较高的抗原亲和力。结论：成功构建了抗溶藻弧菌独特型抗体ScFv基因并表达于细菌壁膜间隙和包涵体中，为溶藻弧菌独特型抗体单链抗体ScFv成为新一代基因工程疫苗奠定了初步基础。     

抗人乙酰胆碱受体scFv-人血清白蛋白融合蛋白的构建及在大肠杆菌中的表达

目的:制备抗人乙酰胆碱受体单链抗体637(scFv637)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白,提高scFv637的稳定性。方法:用PCR扩增人HSA基因,并克隆到含有抗人乙酰胆碱受体scFv637基因的载体pHEN2中构建重组载体pHEN2-scFv637-HSA。以重组载体转化E.coliHB2151,表达产物用斑点杂交试验检测,并以SDS-PAGE和Westernblot鉴定其融合蛋白的相对分子质量(Mr)。结果:琼脂糖凝胶电泳显示,扩增的人HSA基因和融合基因的大小分别为1770bp和7054bp。构建的scFv637-HSA经测序证实核苷酸序列正确,并且正确克隆至载体的开放读码框架内。表达产物仅存在于pHEN2-scFv637-HSA转化的E.coliHB2151外周质裂解液中。表达的融合蛋白的Mr约为95900。结论:在E.coli中成功地表达scFv637-HSA融合蛋白,为进一步对其进行功能研究和应用奠定了基础。     

人源抗狂犬病毒单链抗体库的构建及体外亲和筛选

目的 :构建人源噬菌体展示单链抗体 (scFv)库 ,筛选抗狂犬病毒特异性、高亲和力的scFv。方法 :应用重组噬菌体抗体技术 ,从经狂犬病毒WISTARPM株疫苗免疫者的外周血淋巴细胞中 ,分离并构建scFv基因。将其克隆入噬粒载体pCANTAB 5E中 ,转化于大肠杆菌TG1,通过辅助噬菌体M13K0 7援救构建噬菌体单链抗体库。采用狂犬病毒Vero疫苗亲和富集法 ,淘选阳性重组噬菌体 ,经鉴定后对其进行序列分析。用竞争ELISA ,初步检测重组scFv的特异性抗原结合活性。结果 :成功地构建了库容量约为 7× 10 8抗狂犬病毒噬菌体scFv库 ,筛选到 1株新的抗狂犬病毒的scFv S12。结论 :噬菌体展示scFv库的成功构建及人源抗狂犬病毒特异性scFv的获得 ,为进一步研制抗狂犬病毒的高特异性、高亲和力的基因工程抗体奠定了基础     

人源化抗人肺癌单域抗体基因的构建、表达及活性分析

目的： 构建人源化的抗人肺癌单域抗体hu3D3VH基因, 在大肠杆菌中表达, 对其蛋白活性进行分析.方法： 采用CDR移植技术对mAb3D3的重链可变区进行人源化, 通过重叠PCR获得hu3D3VH的基因.构建pET22（b＋）/hu3D3VH表达载体, 并转化大肠杆菌BL21（DE3）, 在IPTG诱导下表达.表达产物通过Ni亲和层析柱纯化.采用间接ELISA和竞争抑制ELISA法进行活性分析.结果： 通过重叠PCR获得序列正确的目的基因.目的蛋白以包涵体的形式表达, 表达量占菌体总蛋白的30%以上.纯化后, 目的蛋白的纯度达95%以上.hu3D3VH具有与亲本抗体相同的抗原反应性, 并能抑制mAb3D3与L342细胞的结合.结论： 获得的人源化单域抗体hu3D3VH, 保留了与mAb3D3相同的反应性和特异性, 为进一步临床应用奠定了基础.     

抗人整合素αυβ3单链抗体的构建和表达

目的：利用基因工程抗体技术构建抗人整合素αυβ3单链抗体(scFv)。方法：从分泌抗人整合素αυβ3单抗(mAb)的杂交瘤细胞E10总RNA中，用RT-PCR扩增VH和VL基因，对其核苷酸序列分析后，通过PCR在VH和VL基因间插入柔性连接子(Gly4Ser)3 组装成scFv基因，并克隆至原核表达载体pTIG—TRX中。以重组子转化大肠杆菌B121(DE3)诱导目的基因表达。结果：转化菌可表达相对分子质量(Mr)为31000的scFv。Western blot证实，具有His6标签蛋白的表达。经低剂量的IPTG诱导和较低温度培养，scFv获得了可溶性形式表达。表达产物经Ni—NTA琼脂糖层析纯化后纯度达91％以上。ELISA鉴定证实，scFv具有良好的抗原结合活性。结论：成功地构建并表达抗人整合素αυβ3的scFv，为进一步临床研究奠定了基础。     

抗重组人bFGF单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达

目的：从分泌抗重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）单克隆抗体（mAb）杂交瘤细胞株B2F3中克隆抗体可变区（V）基因，构建bFGF单链抗体（scFv），并进行可溶性表达。方法：从分泌bFGF mAb杂交瘤细胞株B2F3提取总RNA，用RT-PCR方法扩增抗体重链可变区基因（VH）和轻链的可变区基因（VL）；再通过重叠延伸拼接（SOE）PCR方法，在VH和VL基因之间引入linker（Gly4Ser）3，构建bFGF scFv。将测序正确的scFv基因克隆到表达载体pCANTAB 5E中，选择非抑制型菌株E.coli HB2151进行可溶性表达；经SDS—PAGE检测抗体表达水平，ELISA鉴定其抗原结合活性。结果：测序分析结果显示，VH基因序列全长375碱基对，编码125个氨基酸，VL基因序列全长399碱基对，编码133个氨基酸，二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征，含有4个框架区（FR）、3个抗原互补决定区（CDR）及抗体特征性的2个半胱氨酸残基；构建的scFv全长789碱基对，编码263个氨基酸，连接结构为VH-linker-VL。SDS-PAGE分析表明scFv基因在大肠杆菌为可溶性表达，表达产物主要位于周质腔中，表达产物的Mr为27000，与理论预期值相符；间接ELISA检测结果显示原核表达的scFv具有与bFGF特异性结合的活性。结论：成功地克隆bFGF mAb可变区基因，并构建表达bFGF scFv，为下一步研究bFGF抗体人源化改造奠定实验基础。     

抗人CD33单链抗体的基因构建、表达及其生物活性检测

目的：构建及表达抗人CD33单链抗体（抗CD33-scFv）基因，并检测其生物活性。方法：采用RT—PCR方法从分泌抗人类白细胞表面分化抗原CD33单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞中克隆出VL和VH可变区基因，再通过重叠延伸拼接（splice—overlap extension）PCR方法在VH和VL可变区基因之间引入柔性连接肽（Gly4Ser）3，体外构建抗人CD33-scFv基因。将其克隆至原核表达载体PET-28a（＋）并在大肠杆菌Rosetta（DE3）中表达。结果：SDS-PAGE和Western blot分析结果表明，抗CD33-scFv在Rosetta（DE3）菌中获得高效表达，重组蛋白的相对分子质量（Mr）为30000，表达产物以不溶性包涵体形式存在，经过溶解包涵体，镍柱亲和层析纯化和体外复性过程，获得了高纯度的scFv片段。流式细胞术（FCM）分析结果证实抗CD33-scFv可与人类白细胞表面的分化抗原CD33结合，保留了鼠源性mAb的与CD33结合的活性。结论：重组抗人CD33-scFv基因构建与表达成功，并且通过复性得到有生物活性的scFv，为下一步针对髓系恶性肿瘤的靶向治疗奠定了基础。