脑胶质瘤 p16基因的纯合性缺失、高甲基化、突变及表达

目的：研究p16基因在脑胶质瘤中的纯合性缺失、高甲基化和突变等结构变化及其与表达之间的关系。方法：应用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR)和PCR甲基化银染分析技术（PCR-methylation assay with silver staining,PCR-MASS)对50例脑胶质瘤标本进行了p16基因纯合性缺失和甲基化检测；用PCR－SSCP和DNA测序技术进行了p16基因突变分析，用免疫组化检测了p16蛋白的表达。结果：50例脑胶质瘤中23例p16蛋白表达阳性，27例表达阴性，表达缺失率54％；9例（18％）纯合性缺失、7例（14％）高甲基化、2例（4％）突变。结论：p16基因在脑胶质瘤中有多种形式的结构异常，其结构的变化使p16蛋白表达障碍。p16基因纯合性缺失和高甲基化是基因失活的重要机制，在脑胶质瘤的发生、发展中起重要作用。     

毫米波辐射对急性早幼粒白血病细胞增殖及分化的影响

目的：探讨毫米波（millimeter wave)对急性早幼粒白血病细胞增殖及分化的影响。方法：将体外培养的NB4细胞株接种于培养瓶，24小时后应用波长7．1mm，功率密度分别为1mW/cm^2和5mW/cm^2的毫米波辐射培养细胞30分钟，连续4天，每天观察细胞形态及数量改变，流式细胞术测定细胞增殖分化相关基因p53,p21,c-myc,c-fos及TGF－β1表达的改变。结果：1mW/cm^2和5mW/cm^2毫米波辐射能明显抑制NB4细胞增殖，辐射4天后的抑制率分别为35．6％和25．8％，1mW/cm^2毫米波可诱导NB4细胞向终末细胞分化，诱导分化率为45．0％，主要为中、晚幼粒细胞、流式细胞术分析发现，经1mW/cm^2毫米波辐射后，NB4细胞增殖分化相关基因p53,p21,c-fos表达增加，而c-myc和TGF－β1表达降低。结论：毫米波辐射能抑制体外培养的NB4细胞增殖并诱导其分化，作用机理可能与调控细胞增殖、分化相关基因的表达有关。     

肝癌细胞中定向表达p16基因的腺病毒载体的构建及其活性表达

目的：克隆AFP启动子和p16基因全长cDNA,构建在肝癌细胞中定向表达p16基因的腺病毒载体,研究p16基因表达对肝癌细胞的影响。方法：采用分子生物学技术手段,克隆AFP启动子和p16基因全长cDNA,将其插入腺病毒载体质粒中,并在293细胞中重组出携带p16基因的腺病毒AdAFP-p16。Western Blot检测p16基因在肝癌细胞中的特异性表达。细胞病变效应（CPE）观察p16基因表达对肝癌细胞生长的抑制作用。结果：AdAFP-p16能够介导p16基因在肝癌细胞中特异性表达,而对正常细胞中p16的表达没有影响;p16基因表达能够特异性抑制肝癌细胞的生长。结论：采用AFP启动子可以实现p16基因的肝癌细胞中定向而特异性表达,提高基因表达产物在肿瘤局部的浓度,有利于提高治疗效果。     

WT1基因异构体比例转变对白血病细胞株NB4增殖的影响

背景与目的:WT1基因编码一个锌指转录因子,在白血病细胞中高表达并与预后呈负相关。WT1基因mRNA通过2个可变性的剪切位点产生4种不同的拼接异构体,4种异构体在表达WT1的不同组织中各以其相对稳定的比例表达,白血病细胞中WT1不同异构体表达的意义尚不清楚。本研究拟用WT1基因异构体WTA转导急性早幼粒细胞性白血病细胞株NB4,以探讨WT1基因异构体对NB4细胞增殖的影响及其分子机制。方法:用电穿孔的方法将携带WT1基因异构体WTA(-17AA/-KTS)全长cDNA的重组真核表达载体及其对照质粒pCB6 转导NB4细胞,建立WT1基因异构体表达比例改变的细胞株并用有限稀释法进行单克隆化。采用台盼蓝拒染法、MTT比色法、甲基纤维素集落形成实验及细胞周期动力学检测,了解WT1基因异构体表达比例改变对NB4细胞生长的影响。用半定量RT-PCR检测NB4细胞中p53、p21、CyclinE、CyclinD1、CyclinA1基因表达的改变。结果:WT1基因异构体能够通过电穿孔方法成功转染NB4细胞,外源基因在NB4细胞中稳定整合及表达,并通过有限稀释法将永久表达细胞株单克隆化。用台盼蓝拒染法绘制细胞生长曲线,提示转染WT1基因异构体的细胞NB4/WTA生长明显慢于对照组NB4/CMV细胞及未转染的NB4细胞,NB4/WTA细胞生长曲线平缓,在第3天达平台期(78.7±18.0)×104/ml,对照组NB4/CMV细胞及NB4细胞在第4天出现生长平台期达(146.0±21.0)×104/ml。MTT法检测细胞增殖活性,结果显示,NB4/WTA细胞在各个时间段的抑制率均高于对照组,P<0.005。甲基纤维素集落形成试验中NB4/WTA克隆形成率明显下降,集落形成抑制率为46.9%。在As2O3(终浓度0.2μmol·L-1)作用后集落形成抑制更加明显。细胞周期动力学检测提示,NB4/WTA组S期细胞比例升高。RT-PCR检查提示,NB4/WTA细胞p21、CyclinA1基因的表达较对照组升高。结论:增加外源性WT1基因异构体WTA的表达将WT1基因异构体表达的比例由 17AA/ KTS优势型转变为-17AA/-KTS优势型,能抑制NB4细胞的增殖,使其克隆形成能力明显下降。这可能与p21、CyclinA1基因表达上调,细胞周期阻滞于S期有关。     

食管鳞癌中p16基因启动子区甲基化及其表达

 目的探讨食管鳞癌（ESCC）p16基因甲基化的状况及其表达与食管鳞癌临床病理特征之间的关系。方法采用甲基化特异性PCR方法（MSP）分别检测75例食管癌组织、癌旁组织和切缘组织p16基因启动子区域CpG岛甲基化状态。采用Envision免疫组化法检测食管癌组织及癌旁组织的p16蛋白的表达。结果75例标本中，食管癌组织、癌旁组织和切缘细织p16基因甲基化率分别为41．3％（31／75）、13．3％（10／75）和6．67％（5／75）。癌组织和癌旁组织P16蛋白的阳性表达率分别为29．3％（22／75）和56．7％0（17／30）。31例癌组织p16基因甲基化阳性标本中有2例（6．4％）检测到P16蛋白的表达，而44例癌组织p16基因甲基化阴性标本中有20例（45．5％）检测到P16蛋白的表达。食管癌组织p16基因甲基化率显著高于癌旁组织和切缘组织（P〈0.01），P16蛋白表达与p16基因甲基化呈负相关。p16基因启动子区甲基化与食管癌的组织学分级、肿瘤部位无明显相关，与临床分期、淋巴转移密切相关。结论p16基因甲基化在食管癌发生发展中起着重要作用，食管鳞癌的分期和淋巴结转移与p16基因甲基化之间有密切关系。     

胰腺癌组织中p16基因缺失及其对p16蛋白表达的影响

目的 探讨胰腺癌组织中p16基因缺失状态及其对p16蛋白表达的影响。方法 采用聚合酶链反应技术分别检测经显微切割方法获取的p16蛋白免疫组化染色阳性和阴性的胰腺癌组织中p16基因纯合性缺失状态并将结果与p16蛋白表达之间的关系进行分析。结果 32例胰腺癌中分别有20例（62．5％）和21例（65．6％）表现为p16蛋白表达丢失和p16基因纯合性缺失，其中有5例发生于p16基因的第1外显子，12例缺失发生于第2外显子，1例发生于第3外显子，另有3例同时发生于第1和第2外显子。此外还发现无p16蛋白表达的胰腺癌组织发生p16基因纯合性缺失的比例（18／20，90．0％）高于有p16蛋白表达的胰腺癌（3／12，25．0％）；在无p16蛋白表达并伴有p16基因缺失的7例胰腺癌病人中仅有1例生存期超过5mo，而二者均无异常的3例胰腺癌的生存期均超过8mo。结论 胰腺癌组织中的p16基因纯合性缺失可以影响p16蛋白的表达，促使胰腺癌病人的预后更差。     

甲状腺肿瘤中p16基因甲基化及p16蛋白的表达

目的探讨甲状腺肿瘤细胞中p16基因异常甲基化及p16蛋白的表达。方法采用甲基化敏感的限制性内切酶SmaI消化DNA，PCR扩增p16基因外显子1，分析60例甲状腺肿瘤中p16基因外显子15′CpG岛异常甲基化，采用免疫组化Envision法检测60例甲状腺肿瘤标本细胞中p16蛋白的表达。结果60例甲状腺肿瘤中p16基因外显子。5′CpG岛异常甲基化率为15．0％（9／60）。30例甲状腺癌中为30．0％（9／30）；30例腺瘤中无异常甲基化，组间比较差异有显著性（P〈0．001）。60例甲状腺肿瘤中p16蛋白阳性表达率为46．7％／60）。30例腺瘤中p16蛋白阳性表达率为60．0％（18／30）；30例甲状腺癌中为33．3％（10／30），组间较差异有显著性（P〈0．05）。结论p16基因外显子t5′CpG岛异常甲基化与甲状腺癌的发生、发展有关，其主要机制可能与甲状腺恶性肿瘤中p16基因失活导致P16蛋白表达缺失有关。     

野生型p16基因对胃癌细胞生长的抑制作用

目的 探讨p16基因对胃癌细胞生长的抑制作用。为胃癌发生的分子基础和基因治疗提供理论依据。方法 采用亚克隆技术将p16克隆入真核表达载体pCI中，用Lipofectamine，将p16基因转染入胃癌细胞株，观察p16基因的表达对胃癌细胞株生长的影响。结果 p16基因克隆入真核表达载体。转染胃癌细胞后，可抑制胃癌细胞的生长。经Dot blot和Westernblot杂交证实。在mRNA和蛋白质水平均有外源性p16基因的表达。结论 野生型p16基因导入p16基因功能缺失的细胞，能恢复其抑制癌细胞生长的功能。     

c-myc和p16在口腔鳞癌中的协同作用

背景与目的：口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)中c—myc和p16的蛋白表达已有一些报道,其基因扩增和mRNA表达研究很少,未见有从多个水平探讨OSCC中c-myc和p16协同作用的研究。本研究旨在探讨OSCC中c-myc和p16基因在基因扩增、mRNA表达和蛋白质表达三个水平上的协同作用。方法：用原位杂交和免疫组化技术与图像分析相结合的方法,对30例OSCC组织中c-myc和p16两种基因的扩增、mRNA表达和蛋白表达状况进行定性、定位、定量研究。结果：OSCC中c-myc的扩增阳性率为63．30%,p16基因未见扩增。c-myc和p16在OSCC中的mRNA表达率分别是83．3％和93．3％,蛋白表达率分别是60．00%和86．7％。相关性分析表明,p16与c-myc在mRNA表达(r=0．6765,P=4．055 6E-05)和蛋白表达(r=0．5642,P=0．00l2)都呈显著性相关。结论：c-myc基因扩增和高表达在OSCC发生、发展中具有重要作用。在OSCC中c-myc和p16的表达具有一定的内在联系。     

肺癌MTS1/p16和p53表达与细胞增殖

（目的〕研究肺癌中MTS1／p16和p53基因产物的表达与细胞增殖的关系。〔方法〕应用SP免疫组织化学方法研究62例肺癌组织中p16蛋白和p53蛋白的表达情况，并进行增殖细胞核抗原检测，计算细胞增殖指数（PI）。(结果)62例肺癌组织中p16蛋白和p53蛋白阳性率分别为58．1％和59、7％。晚癌p16蛋白的阳性率明显高于小细胞癌（p＜0.05）；淋巴结转移阳性组p16蛋白的表达显著低于阴性组（P＜0．05）；PI分级为巨级的p16蛋白表达显著高于Ⅳ级（p＜0.05）。不同组织类型肺癌中p53蛋白的表达未见明显差异，淋巴结转移阳性组p53蛋白的表达高于阴性组（p＜0.01〕；不同PI分级中p53蛋白的表达，N级明显高于1级和Ⅱ级（P＜0．05），三级明显高于1级（p＜0．05）和Ⅱ级（P＜0.01）。p16蛋白低表达和p53蛋白过度表达之间未见明显相关性。（结论〕提示p16蛋白低表达和p53蛋白过度表达均有促进肺癌细胞增殖的作用，p16蛋白的表达与肺癌的细胞分化有关，p53蛋白过度表达对肺癌细胞的转移起重要作用。抑癌基因p53对MTS1／p16基因无明显调控作用。检测p53蛋白表达可作为肺癌诊断的一项新指标。     

p16基因CpG岛甲基化与胃癌及癌前病变

表观遗传学研究发现,p16基因CpG岛甲基化可以抑制其表达,进而与胃癌的发生发展密切相关.进一步的研究显示不同类型胃癌中p16基因CpG岛甲基化阳性率不尽相同.在肠型胃癌中,p16基因甲基化阳性率随着癌前病变程度逐渐加重而升高.但是尚需开展大规模的人群前瞻性研究,以验证p16基因CpG岛甲基化能否成为胃癌筛查、诊断及治疗的分子标志物.     

共表达p53、p16基因真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达

[目的]构建p53、p16基因真核表达载体,观察其在K562细胞中的表达。[方法]设计并构建包含野生型p53cDNA、p16cDNA的真核双表达载体pBudCE4．1-53—16,脂质体法转染K562白血病细胞,用间接免疫细胞化学法、Western blot等方法鉴定外源性p53及p16的表达情况。[结果]构建成功p53、p16基因双表达真核载体,体外成功转染入K562细胞,检测到K562细胞外源性p53、p16蛋白的表达。[结论]重组质粒pBudCE4．1-53-16体外转染K562细胞后．目的基因能够在细胞中同时表达,为进一步研究两种基因用于肿瘤治疗奠定基础。     

涎腺黏液表皮样癌中p16、p15的表达及相关性研究

[目的]研究p16、p15在正常涎腺组织和黏液表皮样癌中的表达,探讨其在黏液表皮样癌发生、发展中的作用及临床意义.[方法]应用免疫组化S-P法检测10例正常涎腺组织、45例黏液表皮样癌中p16、p15蛋白的表达.[结果]黏液表皮样癌中p16、p15的阳性表达率分别为62.2%、73.3%,显著低于其在正常涎腺组织中的表达(100%)(P＜0.05),且随肿瘤分化程度的降低而递减并具有显著性差异,其中p16的阳性率与淋巴结转移有关.p16、p15两基因在黏液表皮样癌的表达中呈显著相关性(P＜0.05).[结论]p16、p15的失表达与黏液表皮样癌的发生和发展关系密切,p16基因的异常可能是更为直接的因素.     

EGR-1与p53，p16，Cyclin D1在鼻咽癌中的表达及意义

 目的 探讨早期生长反应基因（EGR-1）与p53，p16，Cyclin D1在鼻咽癌中的表达及其意义。方法 应用免疫组化SABC法检测29例鼻咽黏膜慢性炎组织、45例鼻咽癌组织、24例鼻咽癌颈部淋巴结转移灶中EGR-1与p53，p16，Cyclin D1表达。结果 鼻咽癌原发灶及其颈部淋巴结转移灶中EGR-1表达较鼻咽黏膜慢性炎降低，p53，Cyclin D1表达则增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；p16在三种病变中的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 EGR-1的表达降低与p53，Cyclin D1的高表达可能与鼻咽癌的发生、发展有关；p16可能在鼻咽癌的发生、发展中不起作用。     

p16基因和增生细胞核抗原在胃癌组织中的表达及其相互关系

 目的 观察胃癌组织中p16基因的表达和增生细胞核抗原（PCNA）染色强度指数间的关系及临床意义。方法 采用LSAB免疫组织化学法。结果 在34例原发性胃癌组织中，p16基因阳性表达率47.06 %（16／34），PCNA染色指数平均为（59.28±3.48），p16基因阳性率和PCNA染色指数在组织学分级Ⅰ级中明显低于组织学分级Ⅲ级（均P＜0.01）；在无淋巴结转移者中明显低于有淋巴结转移者（分别为P＜0.01，P＜0.05）。结论 胃癌组织中p16基因的表达和PCNA染色指数与胃癌的发生、发展密切相关，可以客观反映胃癌的组织分化状态、肿瘤进展及转移潜力。     

p16和bcl—2基因在膀胱癌中的表达及意义

目的：探讨p16抑癌基因和 bcl-2凋亡抑制基因与膀胱癌生物学行为的关系。方法：采用免疫组化和核酸原位杂交等方法检测67例膀胱癌中p16和bcl-2基因的表达。结果：67例膀胱癌p16蛋白表达阳性率52．23％（35／67），失表达率47．76（32／67），其中Ⅰ，级，Ⅱ级，Ⅲ级的肿瘤p16蛋白失表达率各为14．55％，60．53％，71．43％（P＜0．05），p 16 mRNA失表达率分别为20％，40％，80％，40％，60％，100％（P＜0．05），免疫组化和原位杂交结果一致（P＞0．05），结论：p16基因表达与细胞分化呈负相关，bcl-2基因表达与细胞分化呈正相关，提示p16基因的缺失，突变和高甲基化，bcl-2基因的异常表达在膀胱癌的发生和发展中起重要的推动作用。两者均可作为判断膀胱癌生物学行为的参考指标。     

携带p16基因重组腺病毒的构建

目的 构建携带p16基因的重组腺病毒并对目的基因的表达进行研究。方法 lipofectamine介导质粒共转染293细胞构建重组腺病毒，病毒DNA提取及电泳，免疫组化检测p16蛋白表达。结果 构建的携带目的基因的重组体腺病毒，经扩增，纯化后，病毒滴度均达到了10^10 pfu/ml 以上。用Ad-LacZ为代表进行重组体腺病毒转导效率的检测，发现当MOI为625以上的感染强度时，就可使100％的体外培养的肿瘤细胞被转导。重组体腺病毒能介导p16外源基因在脑胶质瘤细胞系TJ899和TJ905细胞中表达。结论 腺病毒载体能携带p16基因在转导细胞中表达，并有很高的转导效率。     

p16基因在乳腺癌中的表达及临床意义

目的：研究p16基因在乳腺癌中的表达及临床意义。方法：应用免疫组织化学方法（SABC法），检测了92例乳腺癌组织p16基因蛋白的表达。结果：发现p16基因表达阳性率为45．7％（42／92），p16基因表达与腋淋巴结转移无关，但p16阳性者远隔转移率14．3％（6／42）低于p16阴性组34％（17／50，P＜0．05）。本组p16基因表达与疾病缓解期无关。结论：提示p16基因在乳腺癌病程中起重要作用，对筛选乳腺癌术后高危转移患者，加强随访诊治有一定参考意义。     

涎腺肿瘤p16基因mRNA表达的研究

目的 :探讨p16基因mRNA在涎腺肿瘤中的表达及其临床病理意义。方法 :利用原位杂交方法检测了 5例正常涎腺和 64例涎腺肿瘤 (良性 2 3例 ,恶性 41例 )标本中 p16基因mRNA的表达 ,并分析了p16基因mRNA表达和患者临床病理参数的关系。结果 :5例正常涎腺 p16基因mRNA表达均为阳性 ,p16基因mR NA在良性和恶性涎腺肿瘤中的阳性表达率分别为 82 .6% (19/2 3 )和 48.8% (2 0 /4 1) ,良、恶性之间p16基因mRNA表达差异有统计学意义 ,P <0 0 1;p16基因mR NA表达与肿瘤大小、部位无相关性 ,但与恶性涎腺肿瘤细胞的分化程度及颈淋巴结是否转移密切相关 ,P <0 0 5。结论 :p16基因在mRNA水平的表达下降在涎腺肿瘤发生发展中可能起重要作用     

甲状腺癌组织端粒酶激活与p16基因失活的研究

目的：探讨甲状腺癌细胞增殖、分化与端粒酶激活及抑癌基因p16失活（缺失突变）之间可能存在的联系。方法：应用TRAP、多重PCR、免疫组化法检测42例甲状腺癌与16例癌旁组织端粒酶活性、p16基因外显子2缺失、p16蛋白表达。结果：甲状腺癌组端粒酶活性90．48％，高于癌旁组织（P（0．01）；甲状腺癌p16基因外显子2纯合缺失率28．57％。相应癌旁组未检出（P〈0．01）；甲状腺癌p16蛋白表达缺失率40．48％，高于癌旁组（P〈0．05）；甲状腺癌p16蛋白表达缺失率高于p16基因外显子2缺失率。结论：端粒酶激活与p16基因失活以及p16蛋白表达下调可能是甲状腺癌变过程中的重要分子事件．甲状腺癌中p16基因失活可能是端粒酶激活的一种途径。