旋毛虫Ts43基因克隆和序列分析

目的：构建编码旋毛虫相对分子质量43000蛋白基因(Ts43)的原核表达载体,并对其序列进行分析。方法：应用RT—PCR方法从河南省南阳猪源旋毛虫获得旋毛虫基因Ts43,克隆人pGEMEX-1载体中构建重组质粒pGEMEX—Ts43,进行测序、同源性比较及抗原性预测分析。结果：所获基因的核苷酸序列与GenBank所登录的旋毛虫Ts43蛋白基因序列的同源性为99％。抗原性预测分析结果显示,河南省南阳猪源旋毛虫相对分子质量43000的蛋白分子上存在有4个明显抗原活性的结构域,分别位于距翻译起点第26～28、101～105、185～193、275～295个氨基酸残基的肽链上。结论：成功构建了旋毛虫相对分子质量43000蛋白抗原基因的原核表达载体。     

旋毛虫相对分子质量53 000抗原蛋白基因克隆载体的构建

目的:构建编码旋毛虫相对分子质量53 000 抗原蛋白基因(Ts53)的克隆载体并进行序列分析.方法:应用RT-PCR方法从河南省猪源旋毛虫肌幼虫总RNA中扩增目的基因Ts53,将PCR产物克隆入pUC18载体中构建重组质粒pUC18-Ts53,进行测序及同源性分析.结果:克隆了旋毛虫肌幼虫的Ts53基因,所获基因的核苷酸序列与GenBank所登录的旋毛虫Ts53蛋白基因序列的同源性为99.06%.应用Kyte-Doolittle方法进行氨基酸的亲水性分析表明,53 000蛋白抗原性最强的部位可能位于220～230氨基酸残基处.结论:成功构建了旋毛虫相对分子质量53 000蛋白抗原基因的克隆载体pUC18-Ts53,为Ts53基因的表达奠定了基础.     

旋毛虫抗原基因Ts87在毕赤酵母系统中优化表达的研究

目的优化旋毛虫抗原基因Ts87在毕赤酵母系统中的表达,提高其表达量。方法选择去除自身信号肽序列的Ts87基因构建天然N末端的重组质粒,电击转化经锂盐处理过的酵母细胞X-33,摸索诱导起始细胞浓度、甲醇诱导浓度及其添加的时间间隔、pH值及诱导时间等条件对重组菌株表达的影响,并对表达产物进行Western blotting鉴定。结果采用锂盐处理毕赤酵母细胞的感受态制备方法可以极大的提高电击转化效率,并确定pPICZαA-Ts87nature/X-33株最佳表达条件为:OD600 nm=1.0,1.0%/24 h体积比添加甲醇,pH值7.0或8.0,诱导表达72 h。将此条件下的培养物上清液30μL直接上样,表达产物可被感染旋毛虫的兔血清所识别。结论本研究优化了Ts87在毕赤酵母系统中的表达条件,为后续研究工作打下基础。     

旋毛虫肌肉期幼虫膜抗原的制备及应用价值的初步探讨

用非离子去垢剂ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４分离制备旋毛虫肌肉期幼虫膜抗原，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、铵银染色后显示１４种组分，分子量在９９～２８ｋｄ之间，主带分子量为９４、９０、４７、３２及２８ｋｄ。间接ＥＬＩＳＡ表明该抗原与血吸虫、犬弓首线虫、肝吸虫及斯氏肺吸虫感染兔血清不发生交叉反应。经４８小时培养获得的旋毛虫肌肉期幼虫的排泄分泌抗原和用溴化十六烷基三甲胺剥脱的旋毛虫肌肉期幼虫表面抗原与血吸虫和肝吸虫感染兔血清均发生交叉反应。     

一株抗旋毛虫单抗的鉴定及其靶抗原的分析

作者筛选到抗旋毛虫的单克隆抗体2G_8B_(10)H_3和1B_7E_6E_9F_(12)株,抗体效价均达1:1.6×10~7。经间接ELISA鉴定,前者(2G_8)特异性强,仅与旋毛虫幼虫抗原反应,不与成虫、新生蚴抗原以及人钩虫幼虫、猪蛔虫、犬弓首线虫幼虫、日本血吸虫、卫氏肺吸虫、姜片虫其他6种蠕虫的抗原反应。用转移电泳分析2G_8的靶抗原分子量,显示其能识别幼虫排泄分泌抗原的46、53     

旋毛虫排泄-分泌抗原重组的研究

获取旋毛虫肌幼虫排泄分泌（ＥＳ）抗原的部分结构基因并进行了克隆、鉴定和表达。首先采用ＲＴＰＣＲ技术从旋毛虫肌幼虫总ＲＮＡ中获取目的基因，经酶切分析后与融合表达载体ｐＥＸ３１Ｃ、ｐＥＸ３１Ｂ及非融合表达载体ｐＢＶ２２０连接，并将其转入大肠杆菌进行表达。结果：重组质粒在大肠杆菌中表达出相应的相对分子质量的重组蛋白，经纯化后的重组蛋白可与旋毛虫病猪阳性血清发生反应。提示：重组抗原可作为ＥＳ抗原的候选替代抗原     

旋毛虫排泄—分泌抗原重组的研究

获取旋毛虫肌幼虫排泄－分泌（ＥＳ）抗原的部分结构基因并进行了克隆、鉴定和表达。首先采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从旋毛虫肌幼虫总ＲＮＡ中获取目的基因，经酶切分析后与金融表达载体ｐＥＸ３１Ｃ、ｐＥＸ３１Ｂ及非融合表达载体ｐＢＶ２２０连接，并将其转入大肠杆菌进行表达。结果：重组质粒在大肠杆菌中表达出相应的相对分子质量的重组蛋白，经纯化后的重组蛋白可与旋毛虫病猪阳性血清发生反应。提示：重组抗原可作为ＥＳ抗原的候选     

旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白对非小细胞肺癌A549增殖的影响

目的:观察旋毛虫(T.spiralis)肌幼虫(ML)排泄分泌蛋白(ESPs)对非小细胞肺癌A549增殖的影响。方法:将A549细胞进行分组,旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白为实验组,顺铂(DDP)为阳性对照组和不加处理的细胞为阴性对照组,通过MTT比色法检测ESPs和DDP对A549细胞增殖活性的影响。结果:MTT检测结果显示,随着ESPs浓度的增加及作用于A549细胞时间的延长,A549细胞的增殖活力逐渐减弱,ESPs对A549细胞具有明显的抑制作用,呈剂量—时间效应。结论:旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白对A549细胞的增殖具有抑制作用。     

SDS—PAGE分析斯氏肺吸虫幼虫和成虫排泄分泌抗原

目的：分析斯氏肺吸虫幼虫和成虫排泄分泌抗原（ES-Ag)的分子生物学特性,有利于提高免疫诊断方法的敏感性和特异性。方法：采用SDS-PAGE分析斯氏肺吸虫幼虫和成虫排泄分泌抗原。结果：斯氏肺吸虫幼虫排泄分泌抗原在24-60KD之间可见4条显色带,其中24KD为主带,成虫排泄分泌抗原在20-60KD之间可见5条显色带,其中20KD和32KD为主带。结论：斯氏肺吸虫幼虫和成虫排泄分泌抗原共有的主要区带为20KD。     

热疗联合旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白对小细胞肺癌H446增殖的影响

目的:观察热疗联合旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白(ESPs)对小细胞肺癌H446细胞增殖有无抑制作用。方法:将对数生长期的H446细胞随机分为4组。对照组:H446细胞培养过程中不作任何处理;热处理组:将细胞消化后放置离心管中在42℃水浴中加热2h;排泄分泌蛋白处理组:将提取的旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白用无血清培养基稀释成0.15mg/ml、0.3mg/ml、0.6mg/ml,分别与H446细胞共培养;热处理联合排泄分泌蛋白组:先经水浴处理后加入各浓度的ESPs。采用噻唑蓝比色法(MTT法)检测细胞抑制率。结果:MTT检测结果显示,随着ESPs浓度的增加及作用于H446细胞时间的延长,H446细胞的增殖活力逐渐减弱,热疗联合ESPs对H446细胞具有明显的抑制作用,呈剂量—时间依赖性效应。结论:42℃加热2h联合旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白对小细胞肺癌H446细胞的增殖有抑制作用。     

旋毛虫新生幼虫抗原免疫小鼠免疫功能的动态观察

【目的】探讨旋毛虫新生幼虫抗原诱导小鼠产生的保护性免疫机制。【方法】采用免疫组化法分别检测旋毛虫新生幼虫抗原免疫后7、14、28、42d小鼠外周血CD4^＋和CD8^＋ T淋巴细胞的百分率,并同时用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定外周血PBMC培养上清中IL-4和IFN-γ水平。【结果】与对照组相比,旋毛虫新生幼虫抗原免疫组小鼠外周血CD4^＋、CD8^＋ T淋巴细胞的百分率均增高,IL-4和IFN-γ水平亦升高,直至免疫后42d;而CD4^＋／CD8^＋ T细胞比值与对照组相比无显著性差异（P〉0.05）。【结论】旋毛虫新生幼虫抗原能诱导机体产生有效的体液免疫和细胞免疫,有希望成为预防旋毛虫病有前途的候选疫苗。     

尿素溶解性抗原用于ELISA诊断旋毛虫病的初步研究

文本报告了旋毛虫感染期幼虫虫体尿素溶解性抗原的提取及其用于ELISA诊断旋毛虫病的效果。ELISA检测24例旋毛虫病人血清IgG和12例病人滤纸干血滴IgG,阳性率均为91.67％(22/24和11/12),21例病人血清IgM,阳性率为95.24％(20/21),对日本血吸虫病人血清作IgG和IgM检测时均有一定的交叉反应,而感染其它几种寄生虫的小鼠血清无交叉反应。 本实验结果表明尿素溶解性抗原用于ELISA诊断旋毛虫病具有较高的敏感性、特异性和好的重复性,是一种具有实用价值和经济价值的诊断抗原。     

间接荧光抗体试验诊断实验性旋毛虫病的研究

本文应用间接荧光抗体试验比较了４种方法制备的旋毛虫幼虫抗原诊断实验性旋毛虫病的效果。结果表明，旋毛虫纯净幼虫冰冻切片抗原优于完整幼虫抗原、超声粉碎幼虫抗原及膈肌幼虫冰冻切片抗原。用此抗原检测感染旋毛虫的大鼠血清时，抗体阳性率为１００％（１３／１３），而１０份正常大鼠血清均为阴性反应。小鼠感染旋毛虫后２周即可检测到抗旋毛虫抗体，阳性率为１１．１１％（１／９），感染后５周抗体阳性率已升到１００％（８／８），升高的抗体滴度可一直持续至感染后第１５周。此抗原在－２０℃至少可保存２．５年而不丧失其活性和特异性。应用滤纸血也可取得满意的检测结果。     

旋毛虫成囊前期幼虫17 000抗原组分的免疫诊断价值

目的研究旋毛虫成囊前期幼虫抗原(PELA) 17 000组分的免疫诊断价值.方法应用聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)和转印技术分离PELA 17 000蛋白组分,用ELISA检测实验感染旋毛虫的Wistar大鼠和旋毛虫病患者血清抗体,并以PELA和成囊期幼虫抗原(ELA)为对照.结果对于感染旋毛虫的大鼠,17 000组分和PELA的首次血清阳性反应出现在感染后第10 d,而ELA则在感染后第14 d,其差异具有统计学意义(P<0.05);对48份旋毛虫病患者血清,17 000抗原的阳性率为95.8%, PELA和ELA的阳性率均为100%,3种抗原之间差异均无统计学意义(P>0.05).17 000抗原与其他寄生虫病患者及健康人血清无反应,而PELA和ELA均与肺吸虫病、鞭虫病患者血清有反应,差异均具有统计学意义(P<0.05).结论与PELA和ELA相比,PELA 17 000组分对旋毛虫病的早期诊断具有更大的价值.     

旋毛虫体外培养研究

目的 :研究旋毛虫囊蚴在宿主体外培养的情况。方法 :加 2 0 %小牛血清的 RPMI- 16 4 0作为培养基 ,在 37℃、 5 % CO2 的二氧化碳培养箱中培养。结果 :旋毛虫脱囊蚴能在体外合适培养基中存活较长时间。但虫体无明显增大。结论 :旋毛虫脱囊蚴能在体外生存 ,生长和发育还需要其它刺激因子     

Preliminary study of immunodiagnosis of trichinosis by ELISA using urea-soluble antigen of Trichinella spiralis

Urea-soluble antigens of Trichinella spiralis infected larva were preparedand the efficiency of the antigens in diagnosis of trichinosis by ELISA wasstudied.Specific IgG antibodies were detected by ELISA using urea-solubleantigens in 91.67% (22/24) of 24 serum samples taken from patients withtrichinosis and 91.67% (11/12) of 12 blood spots on filter paper.Specific IgMantibodies were seen in 95.24% (20/21) of 21 serum samples from patients withtrichinosis using the antigens.Sera of patients infected with Schistosoma japonicumhad some cross teactions to the antigens,but the sera of mice infected withSchistosoma japoni(?) Ancylostoma caninum larva and Plasmodium yoelti were allnegative in the test.     

免疫脂质体趋旋毛虫的靶向性研究

在旋毛虫感染小鼠模型上,体内和体外实验都证实悬挂旋毛虫幼虫单克隆抗体的免疫脂质体(~(14)C-POPC/Chol/PA),在幼虫体内的含量远高于对照脂质体。实验结果表明,免疫脂质体可以提高脂质体的靶向性,为脂质体作为药物载体应用于临床治疗旋毛虫病提供了理论依据。     

旋毛虫新生蚴抗原的化学及免疫化学分析

作者采用SDS-PAGE分离旋毛虫新生蚴虫体可溶性抗原,然后分别用戊二醛-氨银、过碘酸-氨银、耐尔氏蓝液等染色,分析该抗原蛋白质性质和测定分子量;用免疫印迹试验分析抗原的免疫化学性质。结果显示:旋毛虫新生蚴虫体可溶性抗原至少含40个蛋白质组分,其中28个为糖蛋白,9个为脂蛋白;有6个靶抗原组分,均为糖蛋白,其中分子量41.5、40、29.5、25、11kd组分及18kd组分分别为旋毛虫虫种及新生蚴期特异的靶抗原。     

Chemistry and immunochemistry analysis of the soluble antigens of newborn larvae of Trichinella spiralis]

The soluble antigens of newborn larvae of Trichinella spiralis were characterized in terms of molecular weight of protein, glycoprotein and lipoprotein contents, and immunochemistry. After the antigens were separated with SDS-PAGE and then followed by ultrasensitive silver staining, at least 40 bands of proteins were noted. Correspondingly, 28 bands of glycoproteins and 9 bands of lipoproteins were revealed as the similar gels were stained by the hypersensitive periodic acid silver and Nile's blue staining respectively. Six specific bands were recognized using polyclonal antibodies in the serum of rabbits immunized with antigens of newborn larvae by immunoblotting. All of them are glycoproteins. The components of the antigens with molecular weight (MW) 41.5 kd, 40 kd, 29.5 kd, 25 kd, 11 kd and 18 kd were found to be species specific and newborn larva stage-specific target antigen relevantly.