人肠三叶因子毕赤酵母表达载体的构建及稳定整合菌珠的筛选

目的 构建hITF毕赤酵母分泌型表达载体，获得稳定整合酵母菌珠，为大量获得重组hITF、进行功能研究奠定基础。方法 通过PCR获得hITFcDNA片段，将目的基因插入酵母表达载体pPICZαA分泌信号下游，得到重组载体pPICZαA—hITF，SαcⅠ线性化后氯化锂转化进入X-33，Zeocin筛选转化酵母菌，PCR鉴定目的基因，MD、MM鉴定基因型。结果 经测序证实PCR扩增的hITFcDNA与基因文库中的完全一致并准确插入酵母表达载体pPICZαA中，氯化锂转化后，PCR鉴定证明重组载体整合进入酵母基因组中，基因型鉴定表明获得的酵母菌株均为Mut^＋。结论 成功构建出酵母表达载体pPICZαA—hITF，获得稳定整合hITFcDNA的酵母菌株，为hITF的大量表达及其功能研究奠定了基础。     

毕赤酵母分泌表达系统的研究进展

毕赤酵母表达系统是一种新的，极具潜力的真核表达系统，具有其他系统不可比拟的优点，在生物医药领域正在得到越来越广泛的应用。本文综述了该蛋白表达系统的一些特征及影响其表达的相关因素。     

毕赤酵母分泌表达系统的研究进展

毕赤酵母表达系统是一种新的,极具潜力的真核表达系统,具有其他系统不可比拟的优点,在生物医药领域正在得到越来越广泛的应用。本文综述了该蛋白表达系统的一些特征及影响其表达的相关因素。     

一种新型多拷贝毕赤酵母表达载体的构建

目的：构建合适的载体用于外源基因在巴斯德毕赤酵母中的正确分泌表达。方法：利用基因重组技术,对已有载体pPIC9K进行改造：除去信号肽末端的XhoI酶切位点,在多克隆位点处添加此切点;添加一个多聚组氨酸纯化标签;重建了阅读框架。结果：成功构建了一个多拷贝毕赤酵母表达载体。结论：可以利用这个表达载体对外源基因进行分泌表达。     

hTFF2毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

目的 构建三叶因子2(hTFF2)的毕赤酵母表达载体.方法 从人胃窦部提取总RNA,经RT-PCR得到hTFF2 cDNA,用PCR方法扩增hTFF2基因,并将其克隆到毕赤酵母的表达载体pGAPZαA中,构建真核重组表达质粒pGAPZαA-hTFF2.结果 通过双酶切和基因序列分析确定插入pGAPZαA中的片段为hTFF2基因片段.结论 重组质粒pGAPZαA-hTFF2成功构建,为在真核细胞中高效表达hTFF2及下一步的功能研究奠定了基础.     

水蛭素在毕赤酵母中的分泌表达

目的:构建水蛭素毕赤酵母表达载体,获得重组蛋白在毕赤酵母中的分泌型表达. 方法: 通过PCR扩增获得水蛭素HV2, HV2-N47K基因,将序列正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K,构建表达质粒pPIC9K-HV2, pPIC9K-HV2-N47K. 重组质粒转化宿主菌GSM1168,G418抗性筛选高拷贝的稳定表达菌株,经甲醇诱导表达并对表达产物进行鉴定. 结果: 成功构建了水蛭素毕赤酵母表达载体,获得水蛭素在毕赤酵母中的分泌型表达,表达产物具有抗凝血酶活性. 结论: 水蛭素在毕赤酵母中获得分泌型表达,为研究新药奠定了基础.     

人干燥综合征B抗原在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达研究

目的：通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母中表达人干燥综合征B抗原（SS—B）。方法：PCR扩增SS—B基因，与酵母表达载体pPIC9k重组，构建表达质粒pPIC9k—SS—B。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168，在MD平板上筛选重组克隆，用G418快速筛选高拷贝转化子，阳性克隆经甲醇诱导表达后，培养上清用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和免疫酶斑点法（immunodot）鉴定。结果：PCR产物约为1200bp，与预期1224bp接近，pPIC9k—SS—B重组阳性克隆测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致，双酶切鉴定正确。表达产物SS—B的分子量约48000，高拷贝毕赤酵母转化菌的表达水平明显高于低拷贝的。表达量占分泌总蛋白60％以上。产物浓度为800—900mg／L。免疫酶斑点法证实表达产物具有天然SS—B分子的免疫原性。阴性对照菌未见目的表达条带。结论：SS—B在巴斯德毕赤酵母中获得高效分泌表达，为下一步研究打下了基础。     

人抑瘤素M在毕赤酵母中的高效分泌表达

目的：在毕赤酵母中高效分泌表达重组人抑瘤素M（rhOSM）。方法：以人胚胎组织DNA为模板通过PCR技术获得hOSM基因,构建毕赤酵母真核表达载体pPICZαC-hOSM,电转化毕赤酵母菌株X-33,PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE和Western blotting方法筛选能够稳定、高效分泌表达rhOSM的酵母工程菌。结果：经PCR法获得了hOSM基因,培养液上清经SDS-PAGE和Western blotting证实获得了相对分子质量约为28 000的rhOSM,表达量为45　mg•L^-1。结论：毕赤酵母表达系统能够稳定、高效分泌表达rhOSM,摇瓶规模表达量为45 mg•L^-1。     

人TALL-1基因在毕赤酵母中的分泌表达与鉴定

目的 研究在毕赤酵母(Pichia Pastoris)系统中人TALL-1基因的分泌表达,获得具有生物活性的重组TALL-1.方法 将人TALL-1基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用Sac Ⅰ将重组质粒线性化,电转化Pichia Pastoris GS115感受态细胞,筛选阳性整合子并进行甲醇诱导表达,采用MTY对表达产物进行初步的生物活性检测.结果 经过诱导表达条件的优化,人TALL-1在酵母培养基BMMY中实现了分泌表达;免疫印迹和酶联免疫检测结果显示,重组产物可以结合其特异抗体;生物学活性检测证实其可抑制Hela细胞增殖.结论 在毕赤酵母系统中实现了人TALL-1的分泌表达,具有生物学活性的重组TALL-1分子可以用于进一步的结构与功能研究.     

巴斯德毕赤酵母表达系统

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris,P.pastoris)是一种广泛使用的外源基因表达系统，该系统不仅具有高效表达、高稳定、高分泌、高密度生长等特点，而且可以对表达产物进行类似真核细胞的翻译后修饰和加工等显著优点。该研究对巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及研究进展作了简要的综述。     

Production of human intestinal trefoil factor in Pichia pastoris

Objective：To construct a Pichia pastoris （P. pastoris） expression vector of human intestinal trefoil factor （hITF） and study its expression and purification procedures. Methods：hITF gene encoding mature peptide was modified with a polybistidine tag sequence at the N-terminal, and then inserted into the P. pastoris expression vector pGAPZaA at the downstream of the s-mating factor signal. After gene sequencing, the recombinant pGAPZaA-hITF was transformed into the P. pastoris strain X-33 with lithium chloride, rhITF was induced to constitutively express in shake flask, and then analyzed with Tricine SDS-PAGEand Western blotting. The obtained rhITF was isolated from the cultured supernatants by ammonium sulfate precipitation, Ni-NTA affinity chromatography, and ultrafiltration. Results：The correctness and integrity of rhITF were identified by restriction digestion and gene sequencing, rhITF was successfully expressed to 50 mg/L as a secretive protein. After purification, the purity was above 95%. Tricine SDS-PAGE and Western-blot analysis showed that rhITF presented as a single band with a molecular weight of 10 kDa, a little larger than 7 879 Da as assayed by mass spectrometry analysis. Conclusion： hITF P. pastoris expression vector is successfully constructed and rhITF is expressed in P. pastoris at commercially relevant level. This research lays foundation for the further functional studying of hITF.     

人CTLA-4胞外区cDNA毕赤酵母表达载体的构建及高拷贝稳定整合菌株的筛选

目的 构建人CTLA－4胞外区蛋白毕赤酵母分泌型表达载体，获得高拷贝稳定整合菌株，为大量获得人CTLA－4胞外区蛋白，进行功能研究及其临床应用奠定基础。方法 从活化人外周血淋巴细胞总RNA中，扩增人CTLA－4基因胞外区cDNA片段，将目的基因插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游，再插入高拷贝载体pPIC9K，得到pPIC9K-CTLA4,SaL I线性化后电转GS115；G418梯度筛选转化菌。PCR，Suthern blotting鉴定目的基因整合及拷贝数。结果 成功构建了人CTLA－4胞外区cDNA毕赤酵母表达载体，获得了高拷贝稳定整合菌株。结论 为表达人CTLA－4胞外区蛋白及其功能研究和临床应用奠定了基础。     

人骨形成蛋白-2成熟肽在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

目的利用甲醇毕赤酵母表达系统,高效分泌表达人骨形成蛋白-2成熟肽(hBMP-2)。方法利用PCR方法扩增得到hBMP-2基因,构建其毕赤酵母真核表达载体pPICZaC/hBMP2,电转化巴斯德毕氏酵母X-33,于28℃进行甲醇诱导分泌表达,用PCR法、SDS-PAGE、WesternBlot等方法筛选获得高效表达rhBMP-2的工程菌株,并进行了表达产物的纯化和活性测定。结果表达产物分泌至培养上清中,rhBMP-2含量达100mg·L-1。SDS-PAGE初步验证了表达产物的分子量,经WesternBlot和ELISA检测到重组表达产物的特异性结合活性。结论构建了重组hBMP-2的基因工程菌,并在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,为进一步研究其活性和功能奠定了基础。     

可溶性GPC3基因的克隆及酵母表达

目的克隆可溶性磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（soluble glypican-3,sGPC3）基因,并分泌表达重组蛋白。方法通过RT-PCR克隆sGPC3 cDNA,利用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点,将sGPC3基因插入酵母表达载体pPICZαA中,构建真核表达质粒pPICZαA-sGPC3,以该表达质粒转染酵母菌株X-33,在含有Zeozin的YPD平板上进行筛选,然后对PCR鉴定为阳性的酵母重组子进行甲醇诱导表达,表达上清经SDSPAGE和Western blot检测。结果使用特异性引物进行RT-PCR,获得约1 600 bp左右与目的基因大小相符的条带,构建的真核表达质粒pPICZαA-sGPC3表达框正确无误,阳性酵母重组子x-33/pPICZαAsGPC3诱导表达上清在60 000处有与预期大小相符的蛋白条带,且该蛋白条带与抗6×His单克隆抗体孵育后呈现特异性反应。结论成功克隆了可溶性GPC3基因,并在毕赤酵母中获得分泌表达,为进一步研究sGPC3对肝细胞癌的作用及作用机制、开发一种生物治疗肝癌的新型药物奠定了基础。     

人胰岛新生相关蛋白基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

目的 在毕赤酵母中分泌表达具有生物学活性的重组人胰岛新生相关蛋白(rhINGAP),用于INGAP的生理功能研究和动物试验.方法 通过PCR扩增INGAP基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列的Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点处,再将融合基因αINGAP重组到表达质粒pPIC9K的BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ之间,Sal Ⅰ酶切线性化重组质粒INGAP/pPIC9K,电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的 基因INGAP,甲醇诱导rhINGAP的表达,SDS-PAGE和Western blotting鉴定目的 蛋白,用ELISA定量测定生物学活性.结果 成功构建了重组表达质粒INGAP/pPIC9K,筛选得到3个阳性转化子,表达产物具有良好的抗原活性.结论 实现了rhINGAP在毕赤酵母中的高效分泌性表达.     

植酸酶毕赤氏酵母诱导条件初步研究

目的优化产植酸酶的毕赤酵母基因工程菌的表达条件,确定最佳的诱导表达条件。方法先培养酵母细胞,然后进行诱导产酶,最后进行酶活测定。结果植酸酶的最佳收获时间为3 d;甲醇的最佳诱导浓度为10 g/L。结论在诱导开始之后加入0.4%的PTM1和0.1%酪蛋白水解物可以明显促进植酸酶的表达。