脐血间充质干细胞移植后帕金森病大鼠纹状体内多巴胺含量的变化

背景：目前干细胞移植对帕金森病动物模型的研究多集中在骨髓间充质干细胞和胚胎干细胞方面,关于脐血间充质干细胞移植对帕金森病动物模型的研究相对较少,且未见测量脐血间充质干细胞移植前后多巴胺含量变化的报道。 目的：观察脐血干细胞移植对帕金森病大鼠纹状体内多巴胺含量的影响。 方法：帕金森病模型大鼠随机分成实验组和对照组。将第3代脐血间充质干细胞用Hoechst33258标记后植入实验组大鼠纹状体内,对照组注射磷酸盐缓冲溶液。移植后2,4,8周用免疫荧光双标法检测间充质干细胞的存活、迁移以及胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶、酪氨酸羟化酶和突触素的表达。移植后8周利用高效液相色谱-电化学检测仪检测纹状体多巴胺含量。 结果与结论：脐血间充质干细胞移植后可在大鼠脑内存活,随时间延长迁移范围扩大,分布于纹状体、胼胝体和皮质;胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶、酪氨酸羟化酶都有表达,突触素无表达。多巴胺水平与对照组相比有明显提高 (P < 0.05)。     

神经元特异性烯醇化酶与急性颅脑创伤患者预后关系研究

目的探讨急性颅脑创伤患者血清和脑脊液神经元特异性烯醇化酶表达变化与病情严重程度和预后关系。方法共89例急性颅脑创伤患者根据入院时Glasgow昏迷量表(GCS)评分分为轻型、中型、重型和特重型颅脑创伤组,于伤后12 h内分别检测血清(89例)和脑脊液(18例)神经元特异性烯醇化酶表达水平,Spearman秩相关分析评价其与颅脑创伤程度和预后的相关性。结果与对照组相比,颅脑创伤各组患者血清神经元特异性烯醇化酶表达水平升高(均P0.05),且特重型组和重型组高于中型组和轻型组(均P0.05)。脑挫裂伤患者血清神经元特异性烯醇化酶表达水平高于弥漫性轴索损伤(P=0.025)、硬膜下血肿(P=0.031)和硬膜外血肿患者(P=0.021)。血清神经元特异性烯醇化酶表达水平与GCS评分(rs=-0.327,P=0.024)和Glasgow预后分级评分(rs=-0.252,P=0.049)均呈负相关关系。特重型和重型颅脑创伤患者脑脊液神经元特异性烯醇化酶表达水平均高于血清(P=0.039,0.031)。结论神经元特异性烯醇化酶表达变化可以作为辅助评价急性颅脑创伤程度、分型诊断和判断预后的实验室指标,且脑脊液神经元特异性烯醇化酶水平较血清更敏感。     

海马神经元条件培养液体外诱导大鼠骨髓间质干细胞向神经元样细胞和神经胶质样 细胞的分化：与含b-FGF培养基和无血清培养基的比较*☆

背景：目前关于骨髓间质干细胞能否向神经元方向分化的报道不多,且争论多集中在分化后的神经元是否仅具有神经元形态而不具有神经元功能。 目的：探讨海马神经元条件培养液诱导大鼠骨髓间质干细胞向神经元样细胞和神经胶质样细胞分化的可能性。 方法：将第5代大鼠骨髓间质干细胞分为4组：条件培养基组加入海马神经元和胶质细胞的培养液;b-FGF组加入含b-FGF的DMEM培养基;无血清培养组加入含Neurobasal和B27的无血清培养基;阴性对照组加入含胎牛血清的DMEM。各组诱导12,24 h后,应用免疫细胞化学染色行神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白的鉴定,Western-blot法检测细胞神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白的表达。 结果与结论：诱导12,24 h后,条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组骨髓间质充干细胞微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶均呈阳性表达,阴性对照组未见表达。与阴性对照组比较,诱导后24 h,条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组微管相关蛋白2表达均明显增强(P < 0.05),且条件培养基组增强幅度显著高于另两组(P < 0.05);条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白表达无明显差异。结果证实海马神经元条件培养液可体外诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞,与含b-FGF的培养基和无血清培养基相比,海马神经元条件培养基诱导的神经元和神经胶质细胞阳性率最高。     

脐血间充质干细胞体外扩增和向神经元样细胞的定向诱导*

背景：骨髓间充质干细胞存在取材困难、供体有限、可能病毒污染等缺陷,限制了其临床应用,而目前已证实间充质干细胞不仅存在于骨髓,还存在于外周血,尤其是脐血。 目的：探讨人脐血间充质干细胞的体外分离、扩增纯化方法及其神经分化潜能。 设计、时间及地点：应用研究,体外细胞学观察,于2005-10/2007-10在南方医科大学神经生物学教研室完成。 材料：新鲜脐血来自南方医科大学南方医院足月剖宫产新生儿脐带,取脐血前征得新生儿监护人的知情同意。 方法：无菌条件下收集脐血,去除红细胞,采用低糖DMEM/F12进行培养;取扩增第3或4代的人脐血间充质干细胞,培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和全反式维甲酸。 主要观察指标：用流式细胞仪检测贴壁细胞的表面标志;用免疫组化法检测诱导后细胞神经元特异性烯醇化酶、巢蛋白、神经元特异性核内抗原和神经丝蛋白表达。 结果：人脐血间充质干细胞强表达CD13、CD 29、CD44和CD105,弱表达CD106,不表达CD34、CD11a、CD14、CD33和CD45。培养基添加神经营养因子诱导后的细胞呈现典型的神经元样表型,诱导后高表达巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经元特异性核内抗原和神经丝蛋白。 结论：人脐血富含间充质干细胞,分离培养后于培养基添加神经营养因子能够分化为神经元样细胞。     

人羊膜上皮细胞分泌神经营养因子诱导人脐血间充质干细胞向神经元样细胞的分化：可能性验证**★

背景：课题组前期实验已证实人羊膜上皮细胞条件培养液可以诱导人脐血间充质干细胞分化为多巴胺能神经元样细胞，在此过程中人羊膜上皮细胞分泌的神经营养因子及其受体可能起到了重要作用。 目的：探讨人羊膜上皮细胞分泌的神经营养因子对人脐血间充质干细胞神经分化的作用。 方法：将P1代人脐血间充质干细胞按2×108 L-1密度接种，分为3组：对照组加入HG-DMEM培养基；诱导组加入人羊膜上皮细胞条件培养液；阻断剂组预先加入阻断剂K252a工作液，36 ℃孵育40 min后更换为羊膜上皮细胞条件培养液。免疫荧光化学检测诱导后人脐血间充质干细胞神经元特异性烯醇化酶及多巴胺转运体的表达，实时定量PCR法检测诱导后人脐血间充质干细胞中神经元特异性烯醇化酶、多巴胺转运体及酪氨酸羟化酶的表达。 结果与结论：人羊膜上清中有神经生长因子和脑源性神经营养因子的表达，且P1代人脐血间充质干细胞表达神经营养因子高黏附性受体Trka及Trkb。诱导48 h后与对照组比较，诱导组及阻断剂组神经元特异性烯醇化酶、多巴胺转运体阳性细胞数均明显增加(P < 0.05)，且诱导组阳性细胞数最多(P < 0.05)。诱导组、阻断剂组神经元特异性烯醇化酶、多巴胺转运体及酪氨酸羟化酶mRNA含量均显著高于对照组(P < 0.01)，且诱导组各基因mRNA含量明显高于阻断剂组(P < 0.01)。结果证实人羊膜上皮细胞分泌的神经营养因子对人脐血间充质干细胞的神经分化有重要作用，其促神经分化作用是通过酪氨酸激酶受体介导的。     

骨髓间充质干细胞神经分化的体内外研究

目的研究骨髓间充质干细胞在体内外向神经细胞分化的潜能。方法(1)分离培养：从水囊引产胎儿的四肢骨中分离培养骨髓基质细胞，再通过贴壁方法将间充质干细胞从骨髓来源的单个核细胞中分离出，利用流式细胞仪进行间充质干细胞免疫表型测定。(2)体外分化观察：将间充质干细胞在二甲基亚砜(DMSO)和丁羟茴醚(BHA)中作用5h后，行神经元特异性烯醇化酶、神经微丝等免疫组化染色。(3)体内分化观察：将用5一溴脱氧尿核苷(BrDU)标记的间充质干细胞通过立体定向的方法移植于顶叶皮质区，然后再行烯醇化酶、神经微丝及胶质纤维酸性蛋白免疫组化染色。结果(1)生物学特性：间充质干细胞贴壁生长，细胞表现为梭形细胞形态，骨髓来源的间充质干细胞CD34、HLA—DR的表达为阴性，而CD44、CD29、CD13的表达为阳性。(2)体外分化：间充质干细胞在体外被DMSO／BHA处理后，胞浆向细胞核方向收缩，形成一个收缩的胞体，外周是细胞膜的突起，呈现出典型的神经元表型，并且免疫组化染色呈现神经元特异性烯醇化酶及神经微丝染色阳性。(3)体内分化：间充质干细胞被立体定向移植后，在移植部位可见BrDU染色阳性的细胞团，同时可见BrDU阳性细胞迁移到周围宿主的皮质中。免疫组化染色显示，在移植物中及邻近宿主皮质中的移植细胞呈神经元标记烯醇化酶染色阳性，星形细胞标记胶质纤维酸性蛋白染色阳性。结论问充质干细胞有能力分化为非间充质细胞，特别是神经元。     

全反式视黄酸诱导兔骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化

背景：目前,在骨髓间充质干细胞体外向神经细胞分化的实验中,较多采用抗氧化剂法和细胞因子法,但诱导效率低。 目的：探讨全反式视黄酸在兔骨髓间充质干细胞向神经细胞分化中的作用。 方法：体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代骨髓间充质干细胞观察细胞形态,实验组用0.4 μmol/L全反式视黄酸预诱导24 h后,改用神经细胞培养基继续培养。神经细胞培养基培养4,8,16及24 h,免疫组织化学检测巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达情况,采用RT-PCR的方法检测巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达水平。 结果与结论：骨髓间充质干细胞经培养、传代后,细胞贴壁生长,呈长梭形。免疫组织化学检测结果显示：全反式视黄酸诱导组巢蛋白及神经元特异性烯醇化酶呈阳性,诱导后细胞的活力良好。RT-PCR结果显示全反式视黄酸诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异性烯醇化酶在诱导后16 h可见明显的扩增条带,24 h后更加明显。提示全反式视黄酸能够在体外促进兔骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。     

骨髓间质干细胞的分离培养及向神经细胞分化的研究

目的 研究骨髓间质干细胞的分离培养方法及其向神经元细胞分化的条件及可行性。方法 取大鼠骨髓，采用贴壁培养筛选法，分离培养骨髓问质干细胞，经β-巯基乙醇诱导，骨髓问质干细胞可向神经元样细胞分化，免疫细胞化学方法对分化细胞进行鉴定。结果 分离的骨髓间质干细胞可体外增殖，经β-巯基乙醇诱导，骨髓间质干细胞可向神经元细胞分化，细胞突起增多，具有神经元的形态学特征；分化后的细胞表达神经元标志物-神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经微丝(NF)。结论 骨髓组织中存在着骨髓间质干细胞，易分离和培养，体外可增殖，可横向分化为神经元，从而为中枢神经系统疾病的移植治疗提供了细胞来源。     

脂肪基质细胞诱导分化为神经元细胞的实验***

背景：寻找合适的种子细胞是移植治疗脑血管疾病及其他中枢神经系统疾病的关键。 目的：观察人脂肪组织来源的基质细胞分化为神经元细胞的能力。 方法：脂肪组织取自要求去除腹部多余脂肪的健康成人,供者无传染性疾病和内分泌疾病。分离培养脂肪组织来源的基质细胞,采用神经诱导培养基加GM1对其进行诱导培养。倒置相差显微镜下连续观察细胞生长情况和形态变化,免疫组织化学法鉴定神经前体细胞的特异性标志神经巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和微管联合蛋白2的表达情况。 结果与结论：①经神经诱导培养基加GM1诱导后,分化后的细胞大部分呈典型的神经元样细胞形态。②倒置相差显微镜下可见,于诱导后1 h出现神经巢蛋白表达阳性,5 h出现神经元特异性烯醇化酶和微管联合蛋白2表达阳性。提示脂肪基质细胞可分化为神经元细胞,分化后的神经元细胞具有表达神经巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和微管联合蛋白2的功能。     

无血清培养条件诱导人脐血间充质干细胞向神经细胞的分化

于2005-06/2007-09在南昌大学第二附属医院江西省分子医学重点实验室拟建立一种在无血清培养条件下诱导脐血间充质干细胞向神经细胞分化的方法。所用无血清培养基血清替代物是将纯化人转铁蛋白直接溶于DMEM培养基中,再将去毒后的BSA、超声波粉碎后的胆固醇、胰岛素及过氧化氢酶直接加入DMEM培养基中稀释至所需浓度。体外分离的脐血单个核细胞以1×109 L-1接种,加入含氢化可的松、纤维连接蛋白的无血清培养基,7 d后消化传代。取传至2,5,8代的脐血间充质干细胞,达60%~70%融合时以含β-巯基乙醇、丁化羟基苯甲醚的无血清培养基诱导其向神经细胞分化。结果在无血清条件下能培养扩增出大量脐血间充质干细胞,融合后可继续传代扩增;不表达CD34、CD13和CD45,强表达CD166、CD29、CD105,较强表达CD54,80%以上细胞处于G0/G1期;脐血间充质干细胞经诱导后,能形成具有典型神经元形态的神经细胞,神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、神经胶质元纤维酸性蛋白均呈阳性表达。提示在自行研制的无血清培养条件下可成功诱导脐血间充质干细胞向神经细胞分化。