游离型HPV16细胞类型特异性增强子片段的变异对启动子活性的影响

目的 研究宫颈癌中游离型HPV16中细胞特异性增强子(cell-type specific enhancer,CTSE)片段的变异对启动子P97活性的影响,探讨CTSE片段变异与游离型HPV16致癌机制的关系。方法 分别构建含HPV16突变型及野生型CTSE片段的重组报道基因载体(pCAT3-Promoter)表达系统,利用脂质体将重组的报道基因载体转染HeLa细胞;ELISA法测定细胞中CAT蛋白表达量的变化,了解变异CTSE片段对启动子活性的影响。结果 与无增强子的CAT报道质粒pCAT3-Promoter相比,插入HPV16 CTSE 序列的pCAT3-Promoter重组报道质粒CAT蛋白表达量增加1.5～2.5倍;插入突变型CTSE 序列的报道载体与插入野生型CTSE 序列的报道载体相比,报道基因CAT蛋白表达量增加了约1.6倍。结论 陕西地区宫颈癌组织中HPV16 YY1位点突变的CTSE序列可激活启动子活性,YY1位点的突变与游离型HPV16 DNA 致宫颈癌有密切关系。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白表达影响因素分析

目的优化高表达禽流感病毒NS1蛋白的实验方法。方法将基因工程菌接种LB培养基,设定IPTG终浓度为0.3mmol/L,诱导温度为37℃,诱导表达6.0h,SDS-PAGE分析融合蛋白表达情况,确定最佳诱导时间。以0.1mmol/L为梯度,设置不同IPTG诱导浓度,37℃诱导4.0h,分析融合蛋白表达,确定最佳IPTG诱导浓度。设定IPTG至终浓度为0.6mmol/L,分别于24℃、28℃、32℃、37℃和42℃下诱导表达4.0h,分析融合蛋白表达,确定最适诱导温度。采用最优表达条件,超声裂菌后SDS-PAGE分析融合蛋白,Western blotting对融合蛋白进行鉴定。结果当培养温度为37℃,IPTG浓度为0.3mmol/L时,融合蛋白GST-NS1在IPTG诱导5.0h时的表达量最高,达28.5%;当IPTG诱导浓度为0.6mmol/L,在37℃诱导表达4.0h时,融合蛋白的表达量可达27.9%。选用优化的表达条件,IPTG 0.6mmol/L,37℃诱导表达4.0h,融合蛋白的表达量最高可达33.2%。进一步分析显示,融合蛋白大部分以可溶形式表达,其表达量可占菌体总蛋白的25.1%。经SDS-PAGE电泳、电转移后,用小鼠抗GST单克隆抗体进行免疫印迹分析,出现一条阳性反应带。结论通过实验优化了工程菌诱导表达的最佳IPTG浓度、最适时间和培养温度,实现了融合蛋白的可溶性高表达。     

人乳头瘤病毒16L1-E5表达质粒的构建及其蛋白表达

目的构建人乳头瘤病毒16L1-E5的原核表达质粒,并进行表达融合蛋白,为下一步探讨该蛋白是否能作为疫苗的研究作准备。方法以本室已构建好的阳性质粒pET32（＋）／HPV16E5为模板,PCR获得E5基因,经SalI和NotI双酶切插入已构建好的pGEX4T-1／HPV16L1,通过筛选获得正确的阳性克隆pGEX4T-1／HPV16L1-E5。pGEX4T-1／HPV16L1-E5转化入BL21感受态细胞,经IPTG诱导进行目的蛋白的表达,通过测定不同时间、不同IPTG浓度和不同温度时目的蛋白表达情况,获得蛋白表达的最佳条件,SDS-PAGE和Westernblot检测蛋白表达。结果成功构建了质粒pGEX4T-1／HPV16L1-E5,在1mmol／L IPTG、34℃、4h诱导获得最大量的目的蛋白表达。结论成功构建的pGEX4T-1／HPV16L1-E5质粒能表达出目的蛋白,为进一步研究目的蛋白功能打下了坚实的基础。     

H5N1亚型禽流感病毒NSl蛋白表达影响因素分析

目的 优化高表达禽流感病毒NS1蛋白的实验方法。方法将基因工程菌接种LB培养基,设定IPTG终浓度为0.3mmol／L,诱导温度为37℃,诱导表达6．0h,SDS-PAGE分析融合蛋白表达情况,确定最佳诱导时间。以o．1mm01／L为梯度,设置不同IPTG诱导浓度,37℃诱导4.0h,分析融合蛋白表达,确定最佳IPTG诱导浓度。设定IPTG至终浓度为0。6mmo1／L,分别于24℃、28℃、32℃、37℃和42℃下诱导表达4．0h,分析融合蛋白表达,确定最适诱导温度。采用最优表达条件,超声裂菌后SDS-PAGE分析融合蛋白,Westernblotting对融合蛋白进行鉴定。结果当培养温度为37℃,IPTG浓度为0。3mmol／L时,融合蛋白GST-NSl在IPTG诱导5．0h时的表达量最高,达28．5％;当IPTG诱导浓度为0。6ram01／L,在37℃诱导表达4。0h时,融合蛋白的表达量可达27．9％。选用优化的表达条件,IPTG0．6mmo1／L,37℃诱导表达4．0h,融合蛋白的表达量最高可达33．2％。进一步分析显示,融合蛋白大部分以可溶形式表达,其表达量可占菌体总蛋白的25．1％。经SDS-PAGE电泳、电转移后,用小鼠抗GST单克隆抗体进行免疫印迹分析,出现一条阳性反应带。结论通过实验优化了工程菌诱导表达的最佳IPTG浓度、最适时间和培养温度,实现了融合蛋白的可溶性高表达。     

GHRHR-SV1抗体的制备及其蛋白在黑色素瘤细胞中的表达

目的：制备生长激素释放激素受体剪接变异体1（GHRHR-SV1）抗体,并检测GHRHR-SV1蛋白在黑色素瘤细胞中的表达情况,为后续的肿瘤机制研究奠定基础。方法：设计GHRHR-SV1基因序列,将其插入质粒pET-32a（+）中,构建pET-GHRHR-SV1重组载体,经PCR及测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21（DE3）中,分别加入0、0.5、1.0、1.5和2.0mmol·L^-1异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）;诱导1、2、4和6 h,并在37℃、30℃和25℃不同温度下进行诱导;观察目的蛋白表达的最佳IPTG浓度、时间和温度。亲和层析纯化重组蛋白,将纯化后的蛋白免疫家兔,制备兔多克隆抗体,ELISA法检测该抗体效价,Western blotting法检测GHRHR-SV1蛋白在黑色素瘤细胞系B16-F10中的表达情况。结果：重组载体pET-GHRHR-SV1构建成功。在IPTG浓度为2.0 mmol·L^-1时目的蛋白的表达量最高;IPTG诱导蛋白表达2 h时,蛋白表达量最大;当温度为25℃时,蛋白的表达量最大。诱导表达的蛋白相对分子质量约为24 000,纯化后纯度为80%,GHRHR-SV1抗体效价为1：1 600 000,B16-F10细胞中有GHRHR-SV1蛋白表达。结论：成功制备pET-GHRHR-SV1重组载体。GHRHR-SV1蛋白在IPTG浓度为2.0 mmol·L^-1、诱导时间为2 h和温度为25℃的条件下表达最佳。成功制备了高效价的GHRHR-SV1抗体。黑色素瘤细胞系中有GHRHR-SV1蛋白表达。     

人乳头瘤病毒16 E7基因的原核表达及表达条件的优化

目的:构建pET-28a(+)-HPV16 E7原核表达质粒,并对其表达条件进行优化,为进一步研究HPV16E7致病机制及HPV疫苗提供相应的技术平台。方法:应用基因重组技术,构建pET-28a(+)与HPV16 E7(标准株和湖北株)的原核表达重组质粒,用PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测对重组质粒DNA进行鉴定,将其转入宿主菌E.coliBL21(DE 3)进行诱导以表达蛋白;SDS-PAGE及Western blot检测鉴定表达蛋白的分子量及特异性。优化诱导表达的条件,如温度、IPTG浓度、适用的培养基,探讨不同温度下蛋白的表达形式;纯化回收HPV16 E7蛋白。结果:PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV16 E7(标准株)蛋白得到高效原核表达,最佳表达条件:表达HPV16 E7的工程菌BL21(DE 3)的最佳诱导温度是37℃,诱导剂IPTG的浓度为0.3-0.4 mmol/L,最佳培养基为1.5倍LB。结论:pET-28a(+)-HPV16 E7标准株和湖北株重组载体构建成功,人乳头瘤病毒16 E7标准株获得高效原核表达。     

人纤溶酶原K5突变体在大肠杆菌中的优化表达

【目的】提高K5突变体（mK5）在原核系统的单位表达量。【方法】调整可能影响表达的参数：抗生素浓度、pn、A600值、IPTG终浓度、诱导时间、诱导温度，同时固定其它参数。通过电泳分析，获得mK5在原核系统pET22b-BL21的最优表达条件；组氨酸结合柱亲和层析、纯化获得mK5蛋白，SDS-PAGE和Western-blot方法鉴定mK5蛋白；MTT法分析mK5对人视网膜毛细血管内皮细胞（HRCEC）增殖的影响。【结果】优化后的表达条件为：最适细菌培养温度为37℃．最佳抗生素浓度为50μg／mL羧苄青霉素．最适pH值为7．0,在A600为0．9～1．0时加入终浓度为1．0mmol／L的IPTG为最佳诱导条件，37℃诱导10h为最佳诱导时间；优化条件后mK5纯化蛋白得率为21mg／L．产量较优化前（15mg／L）提高近30％：mK5特异性地抑制HRCEC的增殖．IC50=40nmol／L。【结论】本研究确定了mK5蛋白诱导表达的最适参数．并获得具有生物活性的高纯度、高表达量的重组蛋白，为工业化大规模发酵生产提供了基本参数。     

HPV16 E7蛋白编码基因原核表达与鉴定

目的研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16E7蛋白原核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPV16感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16E7基因,经BamH Ⅰ和Hind Ⅱ双酶切后插入相同酶切pET32a（＋）载体,转化JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS—PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32／E7,HPV16E7-TRX融合蛋白在BL21（DE3）菌株中高效表达,在1mmol／L IPTG、30℃诱导条件下融合蛋白表达量占菌体总蛋白的30％左右。结论pET32／E7原核表达质粒的构建、HPV16E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础。     

人纤溶酶原K5突变体在大肠杆菌中的优化表达

 【目的】 降低成本，增大产出，提高K5突变体（mK5）在原核系统的单位表达量。 【方法】 调整可能影响表达的参数：抗生素浓度、pH、A600值、IPTG终浓度、诱导时间、诱导温度，同时固定其它参数。通过电泳分析，获得mK5在原核系统pET22b-BL21的最优表达条件；组氨酸结合柱亲和层析、纯化获得mK5蛋白，SDS-PAGE和Western-blot方法鉴定mK5蛋白；MTT法分析mK5对人视网膜毛细血管内皮细胞（HRCEC）增殖的影响。【结果】 优化后的表达条件为：最适细菌培养温度为37℃，最佳抗生素浓度为50μg/mL羧苄青霉素，最适pH值为7.0，在A600为0.9～1.0时加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG为最佳诱导条件，37℃诱导10 h为最佳诱导时间；优化条件后mK5纯化蛋白得率为21 mg/L，产量较优化前(15 mg/L)提高近30％；mK5特异性地抑制HRCEC的增殖，IC50=40 nmol/L。【结论】 本研究确定了mK5蛋白诱导表达的最适参数，并获得具有生物活性的高纯度、高表达量的重组蛋白，为工业化大规模发酵生产提供了基本参数。     

幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白的诱导表达与活性鉴定

目的：优化幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白诱导表达的条件,以提高目的蛋白的产量。方法：表达幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白的重组基因工程菌BL21（pET-HU27）在不同温度下（25℃、37℃）以不同的IPTG浓度（0.3、1.0和2.0 mmol·L^-1）和不同的培养基（LB、SOC）中分别诱导表达不同时间,表达产物经超声破碎后,进行融合蛋白可溶性分析,并用Western blotting 对表达产物进行鉴定。结果：SDS-PAGE结果显示,37℃时,LB培养基中,0.3 mmol·L^-1的IPTG浓度诱导5 h时,融合蛋白的含量最高为21.51%;25℃,SOC培养基中,1.0 mmol·L^-1的IPTG浓度诱导8 h时,可溶性HspA-UreB融合蛋白含量最高为34.58%,表达产物能够被免疫小鼠血清识别。结论：实现了幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白在原核细胞中的高效表达,并具有良好的免疫活性,为进一步开发应用以该融合蛋白为抗原的幽门螺杆菌疫苗打下了坚实的基础。     

国人小肠长度的测量

本文报道和分析测量了139具尸体的小肠长度。成年男性54例,均长414.30±9.60厘米;成年女性47例,均长345.87±8.19厘米;男女两性小肠均长382.48±6.40厘米,且两性小肠长度存在非常显著性差异。男性胎儿13例,均长218.46±8.76厘米;女性胎儿25例,均长211.60±7.31厘米;胎儿两性小肠均长213.95±5.68厘米,两性间无差异。求相关系数表明,r=0.039,小肠长度与身高完全无关。     

国人下颌孔的定位研究

用200例(男124、女76)长春市郊出土的干燥成人下颌骨进行了下颌孔定位的研究。所测得的数据,均通过统计学处理。结果发现下颌孔的位置是变化的,但下颌孔主要位于冠突最高点与下颌角连线的上五分之三与下五分之二交界处。同时进行了男、女性别之间及同一性别两侧之间的对比研究。从研究结果看,除下颌孔至下颌角的距离在男、女性别之间存在着明显性别差异以外,其余各项未看出明显性别差异。     

猫直肠的初级传入和传出神经元节段性分布(HRP法研究)

本文用成年猫8只,向直肠壁浆膜下层和肌层内多点注入10％HRP溶液200微升,研究结果证明①猫直肠初级传入神经来自双侧(?)_1至腰_5和骶_1至尾_1的脊神经节,其高峰节段是腰_2和骶_2节段。②脊神经节内直肠的初级传入神经元胞体多为圆形和椭圆形,少数是梭形和不规则形。③直肠初级传入神经元的中枢突经李氏束深面进入骶髓_(13)节段,围绕后角形成较大的外侧束和较小的内侧束。两束沿后角外侧阳内侧缘行向腹侧,其终末均终止于灰质Ⅱ,Ⅲ层和Ⅴ、Ⅶ层.④直肠副交感节前神经元位于双侧骶_1至尾_1节段的中间带外侧核,并在网状核、侧素、后外侧核、中界核和前角后外侧核也见到标记细胞。     

国人腹主动脉不成对脏支起点高度的观察

在162例成年尸体上观察的结果如下:腹腔动脉起点的高度,以平L_1上1/3者最多,平Th_(12)下1/3者次之,平均在L_1上1/3上部。肠系膜上动脉起点的高度,以平L_1上1/3者最多,平L_1下1/3者次之,平均在L_1中1/3下部。肠系膜下动脉起点的高度,以平L_3下1/3者最多,平L_3中1/3者次之,平均在L_3下1/3上部。腹腔动脉起始部下缘与肠系膜上动脉起始部上缘间的距离,以在0.1～0.5厘米之间者最多,平均距离为0.41厘米。肠系膜上动脉起始部下缘与肠系膜下动脉起始部上缘间的距离,以在5.0～7.0厘米之间者最多,平均距离为6.36厘米。腹腔动脉、肠系膜上动脉和肠系膜下动脉起始部下缘与腹主动脉分叉角顶之间的距离,分别以在12.0～14.0厘米、10.0～13.0厘米和3.0～5.0厘米之间者最多,它们的平均距离分别为13.03厘米、11.28厘米和4.21厘米。     

兔胰腺器官内淋巴管

本文对家兔胰腺器官内的淋巴管进行了光镜和电镜观察。胰腺毛细淋巴管和淋巴管存在小叶间和被膜下。毛细淋巴管的超微结构与其他器官所见相同。     

弱视治疗中的有关因素分析

本文报导了83例119眼弱视治疗及随访情况,其中经随访一个月以上的93眼中,56眼(60%)视力恢复三排以上或达1.0以上。 视力恢复与开始治疗的年龄有明显的关系,5岁以前开始治疗者疗效较5岁以后开始治疗者显然好得多。非中心凹注视者疗效不一定比中心凹注视者差,而大多数非中心凹注视眼视力提高者转变为中心凹注视。定期随访,严格认真地遮盖健眼,及强迫多使用弱视眼是治疗弱视的重要原则。     

头孢吡肟中间体合成条件考察

目的：在现有的实验室务件下以7-ACA为原料合成头孢吡肟中间体，并在一定程度上提高收率。方法：与国外文献报道的相关方法具有一致性，同时，采用正交实验设计方法考察了一些关键步骤(时间、温度、剂量)对中间体收率的影响。结果：中间体收率为32．7％。结论：该方法使中间体的合成更易于控制，避免了一些繁杂的操作，并降低了实验成本。     

血小板聚集活动脉粥样硬化发生中的作用

为查明血小板聚集活性在动脉粥样硬化发生中的作用,在造成动粥模型前测定血小板对ADP的聚集性,分为高敏感性血小板组和低敏感性血小板组。结果表明,高敏感组的动粥斑块病变比低敏感组明显加重(P<0.05)。但是,两组脂质和脂蛋白变化,除胆固醇有明显差异外,其它各项指标比较均无差异(P<0.05)。