刚地弓形虫复合基因疫苗、混合疫苗及多表位疫苗研究进展

有效的疫苗免疫是预防弓形虫病的最理想方法.当前弓形虫疫苗的研制虽然取得了一些进展,但是单价疫苗的免疫效果并不理想.寻找更有效的候选抗原基因和合适的载体及研究多种抗原基因的优化组合将是今后弓形虫疫苗研究的主要方向.该文就弓形虫复合基因疫苗、混合疫苗及多表位疫苗的研究进展进行综述.     

弓形虫多表位抗原基因DNA疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护性研究

目的以弓形虫多表位抗原基因DNA疫苗免疫小鼠,评价该疫苗对弓形虫感染产生的免疫保护作用。方法利用PCR技术和亚克隆技术,构建弓形虫多表位抗原基因真核表达重组质粒pcDNA3-MAG,以质粒纯化试剂盒大量制备质粒,同时分别以载体质粒pcDNA3和PBS液为空质粒对照和空白对照,与lipofectin按5∶2的比例混合后,经股四头肌注射免疫小鼠,间隔两周,连续免疫3次,通过检测小鼠血清中特异的IgG抗体、IFN-γ和IL-4含量,评价疫苗产生的体液免疫和细胞免疫水平。以强毒型RH株弓形虫感染免疫小鼠,统计小鼠的存活时间,评价疫苗产生的免疫保护性。结果经双酶切及DNA测序鉴定,所构建的重组质粒pcDNA3-MAG读码框架正确。与免疫前及载体质粒和空白对照组相比,小鼠免疫后产生特异性IgG抗体,并引发高水平IFN-γ。攻虫后,实验组较对照组小鼠存活时间明显延长。结论弓形虫多表位抗原基因DNA能诱导BALB/c系小鼠产生特异的细胞免疫和体液免疫,对弓形虫感染可产生一定的免疫保护性。     

日本血吸虫23kD抗原表位及多价疫苗的初步研究

目的　研究日本血吸虫 2 3kD抗原表位及日本血吸虫 2 3kD抗原大亲水区多肽 (LHD -Sj2 3)与脂肪酸结合蛋白(SjFABP)两个基因重组抗原联合免疫小鼠的保护效果。 方法　人工合成血吸虫 2 3kD抗原中一段可诱导T细胞和B细胞免疫应答的抗原表位多肽p14 ,与鸡白蛋白偶联后免疫小鼠。用LHD -Sj2 3和SjFABP两个基因重组抗原联合免疫大鼠 ,观察诱导的免疫保护效果。结果与结论　人工合成肽 p14诱导了 2 2 2 2 %～ 30 18% (P <0 0 5～ 0 0 0 1)的减虫率。用LHD -Sj2 3和SjFABP两个基因重组抗原免疫大鼠时 ,分别获得 32 14 %和 31 85 %的减虫率 (P >0 0 5 ) ,当用这两种基因重组抗原联合免疫大鼠时 ,获得了 4 7 2 8%的减虫率。加强抗原表位及“鸡尾酒”疫苗研究 ,可为寻找更高保护作用的抗血吸虫病疫苗提供基础。     

B细胞表位预测的研究进展

表位,又称抗原决定簇,是指免疫应答中被特异的效应 分子或T、B淋巴细胞识别的抗原分子的特定结构位点。B细 胞表位是指抗原中可被B细胞抗原受体(BCR)或抗体特异 性识别并相互结合的线性片段或空间构象型结构。B细胞表 位的预测对免疫原性多肽和新型疫苗分子的设计都有很大 的帮助,并有利于诊断试剂的开发以及临床疾病的诊断。     

弓形虫多表位基因的构建及其在大肠杆菌系统中的表达鉴定

目的　构建弓形虫和破伤风毒素多个表位的编码基因 ,将其在大肠杆菌系统进行表达 ,评价重组抗原的特异反应性。方法　从弓形虫保护性抗原及通用免疫增强佐剂破伤风毒素中选取含有T和 (或 )B细胞表位的抗原片段 ,通过软件分析在各片段之间插入适当数目、起间隔作用的氨基酸 ,以保持个片段的空间构象独立性 ,从而确定氨基酸顺序。根据氨基酸序列选取适当的密码子构成弓形虫多表位基因。将该基因合成并鉴定后 ,亚克隆入原核表达载体 ,在大肠杆菌中表达并分析表达产物的表达形式和抗原活性。结果　成功构建了长度为 36 0bp的弓形虫多表位基因。该基因在原核表达系统中经诱导 ,得到了 14 4kDa的包涵体形式的表达产物。免疫印迹实验表明该产物具有强特异性抗原活性。结论　弓形虫多表位基因在原核中的表达产物在弓形虫病疫苗及诊断中有潜在的应用价值     

基于免疫信息学技术的结核分枝杆菌多表位疫苗构建北大核心CSCD

目的筛选具有抗原表位可能性的结核分枝杆菌高活性结合肽(HABPs),构建基于HABPs的多表位疫苗。方法通过免疫信息学方法预测HABPs的保护性抗原可能性、细胞毒性、致敏性及潜在B细胞和T细胞表位;将筛选出的HABPs与佐剂霍乱毒素B亚单位连接,构建多表位疫苗,并对其二级结构和理化性质进行分析;采用I-TASSER服务器进行多表位疫苗三级结构同源建模,优化的模型质量通过PROCHECK、ERRAT及ProSA-web软件进行验证;使用PatchDock软件进行多表位疫苗与TLR-4的分子对接;对疫苗进行密码子优化、在线克隆和免疫模拟。结果共筛选出32条HABPs序列,构建的多表位疫苗包含881个氨基酸残基,二级结构由43.93%的α螺旋、13.62%的β折叠和42.45%的无规则卷曲组成,不稳定性指数(Ⅱ)、脂肪族指数和亲水性平均值分别为45.34、84.09和-0.009,表明该疫苗具有灵活、稳定的球形构象和亲水结构。Ramachandran图中位于核心区域和允许区的氨基酸比例大于90%,ERRAT评估整体质量因子值为74.39,Z值为-5.94,表明3D模型的质量整体较好。分子对接结果表明疫苗可与TLR-4稳定相互作用。经过密码子优化的疫苗可在大肠埃希菌中高效表达。免疫模拟显示,当反复暴露于多表位疫苗抗原时,机体的B细胞和T细胞免疫反应均得到增强。此外,多表位疫苗还可诱导高水平细胞因子的分泌。结论利用免疫信息学工具构建的基于HABPs的多表位疫苗含有B、T细胞表位,有望同时激发机体体液免疫和细胞免疫,具有良好应用前景,但其实际免疫效果还需进一步证实。     

表位疫苗:疫苗研制新策略

人类通过接种疫苗已控制了许多重大感染性疾病并且消灭了天花 ,这是有史以来 ,人类征服疾病最为辉煌的成绩。传统疫苗是将病原体灭活或减毒而制成的 ,但存在生物危害性和遗传变异致使原疫苗效力丧失等问题。表位疫苗 (epitopevaccine)是用抗原表位制备的疫苗 ,包括合成肽疫苗 (syntheticpeptidevaccine)、重组表位疫苗 (recombinantepitope basedvaccine)及表位核酸疫苗 (epitopeDNAvaccine ,minigenes/epigenes) ,是目前研制感染性疾病和恶性肿瘤疫苗的方向。1　表位疫苗研制的理论基础表位 (epitope)是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化…     

弓形虫新基因表位疫苗免疫效果的观察

目的观察弓形虫新基因WX、WX2的表位疫苗对小鼠的保护作用。方法将昆明小鼠分成5组,分别用pcDNA3-W2b、pcDNA3-W4a、pcDNA3-W2b4a质粒及pcDNA3和NS,肌注3次,每次间隔2周。免疫完成后ELISA法检测血清抗体水平,取脾细胞用流式细胞仪检测CD4 与CD8 淋巴细胞比值,PCR检测肌肉组织中重组质粒。免疫后第3周,小鼠经腹腔注射弓形虫速殖子500个,观察发病情况和存活时间。30d后仍存活的小鼠,取组织匀浆后进行小鼠盲传。结果免疫后第3周,pcDNA3-W2b组小鼠血清抗体水平显著高于pcDNA3和NS对照组(P<0.05);用PCR法从pcDNA3-W2b、pcDNA3-W4a和pcDNA3-W2b4a质粒组小鼠肌肉组织中成功检测到各表位疫苗质粒,且各组小鼠脾脏CD4 与CD8 T淋巴细胞比值显著低于pcDNA3组和NS组(P<0.05)。pcDNA3-W2b、pcDNA3-W2b4a组小鼠存活时间与pcDNA3组及NS组比较明显延长(P<0.05)。结论弓形虫新基因WX、WX2表位疫苗能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫,提示DNA类表位疫苗的研制可作为弓形虫疫苗研究的策略之一。     

日本血吸虫重组铁蛋白疫苗和表位疫苗联合免疫诱导的保护性免疫研究

目的 探讨日本血吸虫重组铁蛋白疫苗和日本血吸虫抗原表位疫苗联合免疫对昆明感染鼠的免疫保护作用。方法 将制备的日本血吸虫重组铁蛋白疫苗和用特异性抗体筛选噬菌体随机12肽库获得的日本血吸虫抗原表位疫苗联合或单独免疫昆明鼠,共3次,分别在0、2、4周进行。每次背部皮下多点注射50μg重组铁蛋白和/或10~(13)pfu表位疫苗,第6周每鼠经腹部感染(40±1)条日本血吸虫尾蚴。攻击感染后42d剖杀冲虫,计数成虫及肝虫卵数。在免疫前和末次免疫后从小鼠尾静脉采血,分离血清,用间接ELISA法检测抗体反应。结果 联合免疫组与对照组相比,获得了32.8％的减虫率和63.0％的减卵率;单独重组铁蛋白疫苗免疫组的减虫率为21.6％,减卵率为49.5％;单独表位疫苗免疫组减虫率和减卵率分别为17.1％和44.3％,显著低于联合组(P<0.05);联合免疫组小鼠体内IgG的抗体水平明显高于其他各组。结论 日本血吸虫重组铁蛋白疫苗和表位疫苗联合免疫的效果优于单独应用铁蛋白免疫和表位疫苗免疫。     

弓形虫代谢分泌抗原在免疫中研究进展

Desgeorges等人1980年首先检测到弓形虫代谢分泌抗原,并对其体外动力学特性作了描述,之后20多年中,弓形虫代谢分泌抗原的物理、化学、酶学性以及免疫原性得到详尽的研究,其中最令人感兴趣的是代谢分泌抗原在弓形虫病免疫中的作用。尽管对弓形虫代谢分泌抗原的定义不同,制作的方法也因人而异,但均认为代谢分泌抗原是研制疫苗所需的最佳抗原,并对代谢分泌抗原中的各种蛋白（无论是作为一个整体,还是单独作用）的免疫效果均进行了大量的研究。     

结核分枝杆菌融合基因疫苗的研究进展

BCG在不同地区的免疫保护作用差异很大（0％～80％），加上耐多药菌株的出现，寻找比BCG免疫保护效果更好的疫苗成为当今抗结核疫苗研究的当务之急。结核病DNA疫苗中，单一抗原免疫的免疫保护作用不及两种抗原混合免疫，但是DNA混合免疫又有费用高、副作用多和难推广等缺点，而融合基因疫苗则可克服混合免疫的不足。     

刚地弓形虫主要抗原B细胞表位的筛选及鉴定

目的筛选刚地弓形虫主要抗原B细胞表位并在原核表达载体中表达,对纯化的表位重组蛋白进行免疫反应性鉴定。方法用计算机软件BioSun、DNAstar综合分析6个弓形虫主要抗原的亲水性、可及性、柔韧性、二级结构、极性参数等,每一抗原分子预测2个最佳表位,设计合成24条共12对寡核苷酸,两端分别引入NocI、XhoI酶切位点,退火形成的双链定向克隆至原核表达载体pET-32c中,EcoRI单酶切鉴定重组质粒Epitope/pET-32c。将含有Epitope/pET-32c的BL21单菌落接种至LB肉汤培养基中培养,导入表达。表达产物用Ni2 螯合柱亲和纯化,免疫印迹试验(Westernblot)分析重组表位蛋白与弓形虫抗原免疫血清的免疫反应性。结果成功构建了12个原核表达质粒Epitope/pET-32c,并经测序证实,在E.coliBL21有11个表位基因能有效表达重组融合蛋白;纯化的表位蛋白大小均在20.0kDa左右;Westernblot结果显示表位蛋白SAG2-A、SAG3-B能被弓形虫抗原免疫血清识别,且反应较强,SAG2-B为弱阳性,其余的则不能被识别。结论成功筛选到3个弓形虫B细胞表位基因,为进一步构建弓形虫复合表位抗原诊断弓形虫病奠定了基础。     

刚地弓形虫DNA疫苗的研究进展

疫苗是防治弓形虫病的有效手段之一。弓形虫疫苗研制经历了全虫疫苗、虫体特异组分疫苗、基因工程疫苗、DNA疫苗等4个发展阶段。弓形虫DNA疫苗较传统疫苗虽有诸多优势,但尚处于研究起步阶段,单价DNA疫苗和佐剂增强型DNA疫苗可诱导机体对弓形虫感染产生细胞免疫和体液免疫,但免疫效果并不理想,复合多重DNA疫苗将是弓形虫疫苗今后的发展趋势。此外,弓形虫DNA疫苗的免疫保护机制和安全性还不十分清楚,进一步探讨疫苗免疫机制和弓形虫免疫逃避机制,将有助于研制高效、安全、实用的弓形虫DNA疫苗。     

旋毛虫病疫苗

综述了旋毛虫病减毒活疫苗、天然抗原 (成虫、新生幼虫和肌幼虫粗抗原、ES抗原及纯化抗原 )疫苗、合成肽疫苗、重组抗原疫苗、核酸疫苗及其诱导的保护性免疫应答和预防接种效果 ,讨论了影响疫苗免疫效果的因素 ,如免疫佐剂、接种途径和接种剂量等。     

随机肽库筛选弓形虫特异性抗原表位诱导保护性免疫的研究

目的　从噬菌体随机肽库中筛选出模拟弓形虫特异性抗原表位的短肽分子 ,并探讨其对弓形虫的保护性效果。方法　以纯化的弓形虫免疫兔血清IgG为配基 ,亲和筛选法富集特异性噬菌体 ,随机挑取噬菌体克隆用夹心ELISA法和Dot-ELISA法检测其特异性 ,混合 4个阳性克隆免疫小鼠 ,1月后攻击感染 ,观察小鼠发病时间和死亡时间。结果　经 3轮筛选 ,特异性噬菌体得到了有效富集 ,第 3轮洗脱噬菌体的产量为第 1轮的 16 7倍 ,随机挑取 2 7个噬菌体经Dot -Bloting和夹心ELISA法检测 ,有 2 4个能与弓形虫免疫兔血清及单克隆抗体特异反应。用致死量弓形虫攻击感染经阳性克隆免疫的小鼠 ,存活时间明显长于对照组。结论　免疫筛选噬菌体随机多肽库可获得具有保护性的弓形虫抗原表位 ,为弓形虫疫苗研制提供了新途径。     

Q热疫苗研究

Q热(Q fever)为一种世界性分布的重要人兽共患病,疫苗接种是预防Q热的最有效手段。专性细胞内寄生的贝氏柯克斯体是Q热的病原体,灭活I相贝氏柯克斯体Q热疫苗(WCV)免疫保护效能几乎为100%,但是其免疫副反应强。氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体(CMR)和三氯醋酸提取贝氏柯克斯体可溶性抗原(TCA)Q热疫苗保留灭活Q热疫苗的免疫保护效能,且免疫副反应显著减轻。但CMR和TCA Q热疫苗均需要用鸡胚大量培养贝氏柯克斯体,需要在高等级生物防护实验室采用复杂步骤提取、纯化贝氏柯克斯体,这些使Q热疫苗的生产成本高、批量生产难。近十年来,国内外Q热疫苗研究着力于分子疫苗,并已经由研究贝氏柯克斯体保护性抗原转移到筛选能诱导特异性细胞免疫应答的CD4⁺和CD8⁺T细胞表位上,以期望T细胞表位在机体内高效表达,诱导机体产生良好的抗Q热保护性免疫应答。     

弓形虫抗原主要功能和免疫特性

研制安全有效的弓形虫疫苗一向是弓形虫病研究的重点,所以我们非常有必要对可能诱导宿主产生保护性免疫应答的弓形虫抗原进行广泛地筛选并对疫苗候选抗原进行科学合理的评价。因此,本文着重对具有致病性,免疫原性和多阶段有效性等重要特征的候选疫苗的抗原进行综述,旨在为将来寻找最佳的抗原,研制有效的疫苗提供较为准确的信息。     

黄芪对弓形虫wx2b2a表位疫苗免疫小鼠后抗急性弓形虫感染的免疫调节作用北大核心CSCD

目的探讨黄芪对弓形虫wx2b2a表位疫苗免疫小鼠后抗急性弓形虫感染的免疫保护作用。方法将小鼠随机分成pcDNA3-W2b2a组、pcDNA3-W2b2a+黄芪治疗组、pcDNA3+黄芪治疗组、黄芪治疗组、pcDNA3及生理盐水对照组。将弓形虫pcDNA3-W2b2a肌注免疫pcDNA3-W2b2a组、pcDNA3-W2b2a+黄芪治疗组小鼠3次,末次免疫后4周,每组小鼠腹腔注射102个速殖子,感染后2d起,pcDNA3-W2b2a+黄芪治疗组、pcDNA3+黄芪治疗组及黄芪治疗组小鼠给予黄芪75mg/d灌胃治疗,连续用药7d,用ELISA法测定免疫前、末次免疫后4周、感染后6d小鼠血清IgG水平及免疫前、末次免疫后2周、感染后4、6、8d小鼠IFN-γ、IL-18水平,并观察弓形虫感染后小鼠的生存时间。结果 pcDNA3-W2b2a免疫小鼠后血清IgG抗体水平均高于其它组(P<0.05),末次免疫后4周,感染后第6dpcDNA3-W2b2a、pcDNA3-W2b2a+黄芪治疗组小鼠特异性IgG抗体水平无显著性差异(P>0.05);末次免疫后2周、感染后4d、6d、8dpcDNA3-W2b2a+黄芪治疗组小鼠血清IFN-γ水平分别高于其它组(P<0.05);感染后各组小鼠血清IL-18水平持续上升,但感染后8d,黄芪治疗后小鼠血清IL-18水平显著低于pcDNA3和生理盐水对照组(P<0.05);小鼠RH株速殖子感染后,pcDNA3-W2b2a+黄芪治疗组小鼠存活时间明显长于pcDNA3-W2b2a组、pcDNA3+黄芪治疗组及黄芪治疗组(P<0.05)。结论黄芪可增强弓形虫wx2b2a表位疫苗免疫小鼠后抗急性弓形虫感染的免疫调节作用。     

弓形虫黏膜疫苗研究进展

弓形虫主要通过自然感染途径经口感染,引起人和温血动物的弓形虫病。弓形虫可能是世界上人类感染最普遍的寄生虫之一。弓形虫入侵宿主首先要通过黏膜组织的严密防御系统,即黏膜免疫系统,这是机体抗感染的第一道免疫屏障,诱导黏膜免疫应答。在共同黏膜免疫系统（CMIS）的作用下,全身多处黏膜相关淋巴组织（MALT）的免疫活性细胞被激活,黏膜部位产生大量的sIgA抗体,并形成庞大的免疫应答网络,发挥抗虫效应。该文将就近几年来弓形虫抗原诱导的黏膜免疫和黏膜疫苗的研究进行综述。     

黄芪多糖、香菇多糖增强弓形虫wx2b4a表位疫苗免疫小鼠的保护作用

目的探讨黄芪多糖(Astragalan)、香菇多糖(Lentinan)增强弓形虫wx2b4a表位疫苗刺激机体产生免疫应答和保护免疫的效果。方法将黄芪多糖、香菇多糖分别与弓形虫wx2b4a表位疫苗混合肌注免疫小鼠,ELISA法检测小鼠血清中IgG抗体水平,pcDNA3-W2b4a刺激下培养各组小鼠脾脏淋巴细胞,ELISA法检测IL-2、IFN-γ分泌水平,CCK-8法检测免疫鼠脾细胞增殖活性,并观察其受到弓形虫攻击感染后的生存时间。结果各免疫组小鼠血清IgG抗体水平显著高于对照组(P<0.05),且pcDNA3-W2b4a+黄芪多糖组要高于pcDNA3-W2b4a+香菇多糖组(P<0.05);pcDNA3-W2b4a+黄芪多糖组、pcDNA3-W2b4a+香菇多糖组小鼠脾细胞IL-2、IFN-γ水平高于pcDNA3-W2b4a组(P<0.05);各免疫组T细胞增殖活性与对照组比较明显增强(P<0.05),且pcDNA3-W2b4a+香菇多糖组要高于pcDNA3-W2b4a+黄芪多糖组;小鼠攻击试验表明,pcDNA3-W2b4a+黄芪多糖组、pcDNA3-W2b4a+香菇多糖组小鼠存活时间明显长于对照组和pcDNA3-W2b4a组(P<0.05)。结论黄芪多糖、香菇多糖可增强弓形虫wx2b4a表位疫苗产生免疫应答,并显示较好的免疫保护效应。