人重组S100A8蛋白适配体的筛选和结构分析

目的：筛选人重组S100A8蛋白特异性的适配体。方法：采用配体指数级富集系统进化（systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX）技术,以人重组S100A8蛋白为靶蛋白,以微孔板为筛选介质,从体外合成的随机单链DNA文库中筛选其适配体。利用生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶系统检测每轮单链DNA文库与靶蛋白的亲和力直至亲和力的上升趋于饱和,将最后一轮筛选产物克隆测序,并进行生物信息学分析。结果：经过11轮筛选,单链DNA文库与人重组S100A8蛋白的亲和力趋向稳定,将第11轮筛选产物克隆测序,对获得的30个适配体进行分析。一级结构分析显示30个适配体并无共同的保守序列,但有3对适配体序列完全一致。二级结构预测分析表明,茎环和口袋结构为主要的结构形式,提示其可能是适配体与人重组S100A8蛋白特异性结合的基础。根据茎环和口袋的相对比例可将30个适配体分为4组,其中第1组中35号适配体与人重组S100A8蛋白亲和力最高。结论：获得了与人重组S100A8蛋白特异性结合的适配体群,为后续适配体的应用研究以及S100A8蛋白功能的研究奠定了基础。     

人重组S100A8对牙周膜细胞增殖和迁移活性的影响

目的：观察人钙结合蛋白轻亚基S100A8对牙周膜细胞增殖和迁移活性的影响,探讨S100A8在牙周炎发生及发展中的作用。方法：体外培养人牙周膜原代细胞,给予人重组S100A8处理,MTT检测细胞增殖活性的改变,Annexin-Ⅴ/PI染色后流式细胞检测技术观察细胞的凋亡状况,Transwell小室及划痕实验检测细胞迁移能力的改变。结果：10^-7~10^-5 mol/L人重组S100A8抑制牙周膜细胞增殖,而10^-9~10^-7 mol/L S100A8促进牙周膜细胞迁移,其中10^-5 mol/L S100A8作用牙周膜细胞48 h后可以显著抑制其增殖并诱导其凋亡,而10^-9 mol/L S100A8却显著促进牙周膜细胞的迁移。结论：高浓度S100A8抑制牙周膜细胞增殖且促进其凋亡,而牙周治疗后低浓度的S100A8可以促进牙周膜细胞迁移,有助于疾病后期组织的修复。     

以大肠埃希菌tolC蛋白为靶标的适配体的筛选及结构分析

目的:筛选大肠埃希菌外排泵tolC蛋白的核酸适配体.方法:重组表达大肠埃希菌外排泵外膜蛋白tolC,利用指数富集的配体系统进化技术(stematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)从单链DNA文库中筛选出一组能够特异性与其结合的核酸适配体.利用FITC荧光素标记技术检测每轮单链DNA文库与靶蛋白的亲和力,直至亲和力的上升趋于饱和,将最后一轮筛选产物克隆测序,并用DNAman软件分析其二级结构.结果:经过12轮筛选,单链DNA文库与靶标蛋白的亲和力趋向稳定,将第12轮筛选产物克隆测序,对获得的23个适配体进行分析.一级结构分析显示23个适配体并无共同的保守序列,但分别有3对和2对适配体序列完全一致.二级结构预测分析表明,茎环结构为适配体主要的结构形式,提示其可能是适配体与tolC蛋白蛋白特异性结合的基础.根据二级结构特点可将23个适配体分为4个家族,其中20号适配体与靶标蛋白亲和力最高.结论:成功利用SELEX技术筛选获得了特异结合tolC的高亲和力的核酸适配体,为大肠埃希菌耐药干预及机制研究奠定了基础.     

人重组S100A8对牙周膜细胞增殖和迁移活性的影响

目的:观察人钙结合蛋白轻亚基S100A8对牙周膜细胞增殖和迁移活性的影响,探讨S100A8在牙周炎发生及发展中的作用。方法:体外培养人牙周膜原代细胞,给予人重组S100A8处理,MTT检测细胞增殖活性的改变,Annexin-Ⅴ/PI染色后流式细胞检测技术观察细胞的凋亡状况,Transwell小室及划痕实验检测细胞迁移能力的改变。结果:10-7～10-5mol/L人重组S100A8抑制牙周膜细胞增殖,而10-9～10-7mol/L S100A8促进牙周膜细胞迁移,其中10-5mol/L S100A8作用牙周膜细胞48 h后可以显著抑制其增殖并诱导其凋亡,而10-9mol/L S100A8却显著促进牙周膜细胞的迁移。结论:高浓度S100A8抑制牙周膜细胞增殖且促进其凋亡,而牙周治疗后低浓度的S100A8可以促进牙周膜细胞迁移,有助于疾病后期组织的修复。     

人S100A9重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的制备人S100A9(hS100A9)重组腺病毒载体,为进一步研究人S100A9蛋白的分子生物学作用奠定基础。方法从pHAHA-hS100A9中PCR扩增hS100A9片段,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-TOX,获得重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A9。酶切、聚合酶链反应(PCR)及测序鉴定正确后经PmeⅠ酶切电转入AdEasier感受态细胞,获得重组腺病毒质粒pAdhS100A9,该质粒经PacⅠ酶切后由脂质体转染至HEK293细胞中包装扩增重组腺病毒并进行滴度测定,最后通过PCR及蛋白印迹法(Western blot)鉴定重组腺病毒。结果正确扩增出hS100A9基因;重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A9均及重组腺病毒质粒pAdhS100A9构建成功,并在HEK293细胞中成功包装且扩增后滴度为1 010 I U/mL;重组腺病毒AdhS100A9在HEK293细胞中成功转录和表达。结论用pAdEasy系统成功构建hS100A9重组腺病毒载体,为探讨其生物学作用奠定了基础。     

S100A8、S100A9蛋白在急性肺损伤新生儿血清中的动态变化及意义

目的 探讨S100A8、S100A9蛋白在急性肺损伤(ALI)新生儿血清中的动态变化.方法 选择该院2011年1月至2013年12月收治的ALI患儿30例(ALI组)、湿肺患儿30例(湿肺组)及同期产科出生的健康新生儿30例(对照组),采取酶联免疫吸附测定(ELISA)法分别检测各组对象S100A8及S100A9蛋白的动态变化.结果 ALI组在发病第1、3、7天血清S100A8、S100A9蛋白均明显高于湿肺组及对照组,差异有统计学意义(P＜0.01),ALI组S100A8蛋白在发病第1天升高最为明显[(187.29.士29.71) pg/mL],S100A9蛋白在发病第3天升高最为明显[(280.01士42.29)pg/mL],差异有统计学意义(P＜0.01),第7天时二者均有不同程度下降.湿肺组S100A8、S100A9蛋白较对照组升高,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 S100A8、S100A9蛋白参与了新生儿ALI的发病,对新生儿ALI早期诊断、治疗及预后有着一定的潜在临床应用价值.     

筛选环孢霉素A适体的BioMag-SELEX技术的建立

1990年，Tuerk和Gold分别独立研制了一种新型的体外筛选技术，即指数富集的配体系统进化（Systematic evolution of ligand by exponential enrichment，SELEX）技术，用于研究小分子核酸与靶物质相结合的部位、序列及空间构像。适体（aptamer），来源于拉丁语aptus。     

慢性髓细胞性白血病K562细胞适体的筛选与鉴定

目的：筛选并鉴定出慢性髓细胞性白血病（CML）K562细胞的寡核苷酸适体.方法：体外合成长度为88个碱基的随机单链DNA（ssDNA）文库,采用生物素-链霉亲和素磁珠法制备次级文库,以正常人血液中提取的中性粒细胞为反筛细胞,利用指数富集的配基系统进化（SELEX）技术筛选出与CMLK562细胞特异结合的适体.将筛选得到的适体回收纯化后连接pGEM-T质粒载体,经蓝白筛选后,随机挑选24个克隆子进行序列测定.采用荧光标记引物法检测ssDNA文库与K562细胞的亲和力,并用Clustal 2.05和DNA sis V2.5软件对适体序列进行一级结构同源性分析和二级结构预测.结果：经过13轮循环筛选,CML K562细胞适体的A值从0.12上升到1.25,至第13轮A值无明显增高.一级结构分析无同源序列,但可分为6个家族,其中5个家族各自具有保守序列,家族6无保守序列.二级结构分析表明,适体形成的茎环、凸环结构可能是与K562细胞特异性结合的结构基础.结论：利用SELEX技术成功筛选出高亲和性的CML K562细胞适体.     

H22肿瘤细胞aptamer的筛选与结构分析

目的：获得与H22肿瘤细胞特异性结合的aptamer。方法：利用SELEX技术,以小鼠DC细胞为反筛选细胞,以H22肿瘤细胞为靶细胞,从体外合成的80bp随机单链DNA文库中筛选出能与H22肿瘤细胞特异结合的aptamer。采用荧光标记引物法检测aptamer与H22肿瘤细胞的亲和力：所获得的aptamer采用MACAWv2．05软件进行aptamer序列的一级结构同源序列比较,用DNASISv2．5软件计算分析序列最低二级结构能量值,获得其二级结构模拟图。结果：本实验设计的文库序列：5’-CGTCGCTGCACATTCCG—N46-CGCACAGCTGGGAGTAC-3’具有较高的扩增效率,适合于aptamer与以细胞为靶物质的筛选。经过11轮循环筛选,随机单链DNA文库与靶细胞结合的荧光强度从1％上升到59％,结合曲线进入平台期,表明结合已基本处于稳定状态,因此可以判断aptamer与靶细胞的结合基本已经处于饱和状态：对所获得的32个aptamer进行测序,然后进行一级结构和二级结构分析。一级结构分析获得5个保守序列：AGGGA、AGAAGG、GTGAXAA、ATAGT、CAAGG,其余10个aptamer无同源序列。二级结构分析表明,aptamer形成的茎环、凸环结构可能是与H22肿瘤细胞特异性结合的结构基础。亲和力检测结果表明第24号aptamer具有最强的亲和力。结论：利用随机单链寡核苷酸文库成功获得与H22肿瘤细胞特异结合的aptamer,其一级和二级结构与亲和力密切相关。     

重组 PBP2a 转肽酶区蛋白核酸适配体的筛选及鉴定

目的：筛选和鉴定重组青霉素结合蛋白2a（PBP2a）转肽酶区蛋白的核酸适配体。方法利用指数富集的配体系统进化技术（SELEX）,以重组 PBP2a 转肽酶区蛋白为靶标,从单链 DNA 文库中筛选能与之特异性结合的核酸适配体。筛选产物克隆测序后,对其进行结构分析和特性鉴定。结果经过11轮筛选,单链 DNA 文库与靶标蛋白的亲和力趋向稳定,将第8、10轮筛选产物克隆测序,对获得的40个适配体进行分析,一级结构分析显示40个适配体并无共同的保守序列,二级结构预测分析表明,其可分为3个家族。其中13号适配体与重组 PBP2a 蛋白亲和力最高,并能与之特异性结合。结论利用 SELEX 技术成功筛选出特异性结合重组 PBP2a 转肽酶区蛋白的核酸适配体,为探索耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的诊疗新途径奠定基础。     

人S100A6-GST融合蛋白的原核表达和纯化

目的:制备人S100A6-GST融合蛋白,为研究人S100A6((hS100A6)蛋白的功能奠定基础.方法:从pHAHA-hS100A6中双酶切获取hS100A6基因,亚克隆至原核表达载体pGST-moluc,构建pGST-moluc-hS100A6,转化BL21后,IPTG诱导重组菌表达hS100A6蛋白,SDS-PAGE及Western Blot鉴定表达产物,Glutathion-Sepharose 4B球珠分离纯化.结果:重组菌株表达出与理论预测值相符的一个约36ku的hS100A6融合蛋白,纯化后的融合蛋白的产量为3mg/L菌液,纯度约92%.结论:成功构建了hS100A6-GST原核表达质粒,在大肠杆菌中表达纯化后得到较高浓度的hS100A6-GST融合蛋白,为hS100A6蛋白功能的研究打下了基础.     

亲和纯化技术联合质谱鉴定与S100A8和S100A9相互作用的蛋白

目的：利用亲和纯化技术联合质谱分析筛选鉴定与S100A8和S100A9相互作用的蛋白,为探讨S100A8和 S100A9在结肠炎相关性结肠癌发生发展中的作用机制提供线索。方法：构建含有S100A8和S100A9 CDS区和Flag亲和标 签的真核表达载体p3×Flag-CMV-S100A8和p3×Flag-CMV-S100A9,将其转染至HEK293细胞中,48 h后收集蛋白。运用标 签分离纯化S100A8和S100A9蛋白,液相质谱/质谱分析技术(liquid chromatography mass spectrometry/mass spectrometry, LC-MS/MS)鉴定S100A8和S100A9的相互作用蛋白,通过生物信息学的方法(GO分析)归纳分析相互作用蛋白,免疫共 沉淀实验鉴定S100A8和S100A9的相互作用蛋白。结果：通过标签纯化联合质谱分析成功鉴定出PKM,NPM1,eIF5A 等14个与S100A8相互作用的蛋白,鉴定出14-3-3ε,PKM等6个与S100A9相互作用的蛋白。对所鉴定的相互作用蛋白进 行生物信息学分析,发现与S100A8和S100A9相互作用的蛋白参与糖代谢、细胞黏附、正向调控NF-κB转录因子活性、 抗凋亡等在内的生物信号通路,并利用免疫共沉淀证实PKM2与S100A8和S100A9发生相互作用,14-3-3ε与S100A9发生 相互作用。结论：利用免疫共沉淀结合质谱技术筛选鉴定的S100A8和S100A9相互作用蛋白PKM2和14-3-3ε,可能为阐 明S100A8和S100A9在结肠炎相关性结肠癌发生发展中的作用机制提供重要线索。     

S100A8启动子的克隆及转录活性检测

目的 构建小鼠S100A8基因启动子序列的报告基因载体,通过报告基因技术检测在静息、脂多糖(LPS)、PolyI:C及NaASO2等刺激下该段启动子的转录活性.方法 采用PCR从小鼠脾组织基因组DNA扩增S100A8启动子序列(-826～+468);将其克隆至pDsRed1-1载体上,重组质粒经过PCR、酶切及测序分析正确无误后转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,荧光显微镜下观察静息、LPS、PolyI:C和NaASO2刺激下红色荧光蛋白表达.结果 正确扩增出小鼠S100A8启动子片段(-826～+468);成功构建其红色荧光蛋白报告基因载体,证实该质粒转染RAW 264.7细胞后静息状态下仅可见少量而微弱的红色荧光,经LPS、PolyI:C和NaASO2刺激后,红色荧光强度和亮度明显增加.结论 小鼠S100A8启动子(-826～+468)在静息状态下即具有转录活性,炎性、氧化应激刺激后S100A8表达增强;该启动子的成功克隆和其报告基因载体的构建,为进一步研究S100A8的基因表达调控机制打下了良好的基础.     

结直肠癌患者血清S100A8和S100A9表达水平检测及其临床意义

目的：探讨血清S100A8和S100A9表达水平和结直肠癌患者临床特征的关系。方法：用ELISA法检测82例结肠癌或直肠癌患者和14例健康对照者血清中S100A8和S100A9的含量,利用t检验、方差分析等方法分析两种分子与结直肠癌病理分期及临床特征的关系;利用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析S100A8和S100A9对结肠癌和直肠癌的诊断效能;构建logistic回归模型分析S100A8和S100A9血清水平升高的可能相关因素。结果：结肠癌组患者血清中S100A8浓度[(1 403.3±593.7) pg/mL]和S100A9的含量[(2 890.3±994.9) pg/mL]均显著高于健康对照组[分别为(712.8±265.3)和(1 492.7±564.6) pg/mL,P<0.01];直肠癌患者血清S100A8和S100A9的含量分别是(1 417.7±666.5)和 (3 026.7±887.6) pg/mL,也高于对照组(P<0.05);血清S100A8和S100A9诊断结肠癌或直肠癌均具有较高的敏感性和特异性,两者联合应用时,曲线下面积(AUC)在结肠癌和直肠癌分别达到0.972和0.964;随着结直肠癌临床恶性度增高和远处转移的发生,血清S100A9表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05),S100A9在III期[(3 111.9±178.5) pg/mL]和IV期[(3 831.4±278.5) pg/mL]患者血清中的含量均显著高于I期患者[(2 276.1±167.4) pg/mL,P<0.01];而S100A8血清浓度与临床分期之间未发现明显关联;logistic回归分析发现血清S100A9升高与肿瘤浸润深度(OR=6.135,P=0.024)、淋巴结转移(OR=4.735,P=0.05)及分化程度(OR=2.573,P=0.043)等密切相关。结论：结直肠癌患者的S100A8和S100A9血清水平显著升高,且S100A9水平与结直肠癌恶性度呈正相关。     

钙结合蛋白S100A1与心力衰竭

钙结合蛋白S100A1被认为是一种钙依赖性心脏收缩因子.心力衰竭时S100A1蛋白表达减低,增加S100A1蛋白表达可通过调节心肌钙转运、抑制心室重构、减少心肌细胞凋亡和恢复心肌能量供应等机制增加心脏收缩功能,因此恢复衰竭心肌内S100A1蛋白水平是治疗心力衰竭的有效措施.